Artículo de método

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

DOI:

10.3791/51306

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3 de noviembre de 2014

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1Integrated Department of Immunology and Integrated Center for Genes, Environment, and Health, National Jewish Health and University of Colorado School of Medicine

En este artículo

Resumen

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En este protocolo, describimos métodos para transfectar eficientemente líneas celulares de macrófagos murinos con siRNAs utilizando el sistema de lanzadera Amaxa Nucleofector de 96 pocillos, estimular los macrófagos con lipopolisacáridos y monitorear los efectos sobre la producción de citoquinas inflamatorias.

Resumen

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Los macrófagos son células inmunitarias innatas fagocíticas clave. Cuando los macrófagos se encuentran con un patógeno, producen proteínas y compuestos antimicrobianos para matar al patógeno, producen varias citocinas y quimiocinas para reclutar y estimular otras células inmunitarias, y presentan antígenos para estimular la respuesta inmunitaria adaptativa. Por lo tanto, ser capaz de manipular eficientemente los macrófagos con técnicas como el ARN de interferencia (ARNi) es fundamental para nuestra capacidad de investigar esta importante célula inmunitaria innata. Sin embargo, los macrófagos pueden ser técnicamente difíciles de transfectar y pueden exhibir una eliminación génica ineficiente inducida por ARNi. En este protocolo, describimos métodos para transfectar de manera eficiente dos líneas celulares de macrófagos de ratón (RAW264.7 y J774A.1) con siRNA utilizando el sistema de lanzadera de 96 pocillos Amaxa Nucleofector y describimos procedimientos para maximizar el efecto del siRNA en la eliminación de genes. Además, los métodos descritos están adaptados para trabajar en formato de 96 pocillos, lo que permite estudios de rendimiento medio y alto. Para demostrar la utilidad de este enfoque, describimos experimentos que utilizan ARNi para inhibir genes que regulan la producción de citocinas inducida por lipopolisacáridos (LPS).

Introducción

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En este protocolo, se describen los métodos eficaces para inhibir genes en líneas celulares de macrófagos de ratón utilizando siRNAs y controlar los efectos de estos tratamientos en la respuesta inmune innata. Estos procedimientos se realizan en formato de 96 pocillos, lo que permite pantallas de RNAi en la moda de mediano o alto rendimiento.

En respuesta a la infección, los seres humanos montar una respuesta inmune innata inmediata y una respuesta inmune adaptativa más lento pero más específico. Esta rápida respuesta inmune innata implica el reclutamiento y la activación de las células inmunes innatas fagocíticas incluyendo macrófagos

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Protocolo

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1. Mantenimiento de líneas celulares de macrófagos

  1. Crecer RAW264.7 y líneas de células J774A.1 en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ºC en presencia de 5% de CO 2. Para ayudar a mantener la esterilidad, añadir 1% de penicilina / estreptomicina (pen / strep) a los medios de comunicación (aunque esto no es estrictamente necesario).
  2. Paso crítico: Asegúrese de que los macrófagos están creciendo en un estado saludable para la transfección eficiente y inducida por siRNA desmontables de genes. Utilice células entre pasajes 3 y 10 después de la descongelación fresco, ya que estas líneas de macrófagos ex....

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Resultados

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Para demostrar la eficacia de la transfección usando este enfoque, que supervisó la captación de ARNsi marcado con FITC utilizando un citómetro de flujo (Figura 1).

Para ilustrar la utilidad de nuestro enfoque para el seguimiento de la respuesta inmune innata, transfectadas siRNAs dirigidos a genes reguladores inmunes innatas conocidas en la línea celular de macrófagos RAW264.7, estimulamos las células con LPS, y luego supervisó la producción de las citoquinas pro-inflamator.......

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Discusión

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Numerosos estudios han sido publicados en los que los genes individuales han sido blanco de siRNA en macrófagos murinos. Mientras que la transfección mediada por lípidos ha sido utilizado para entregar siRNA a las líneas celulares de macrófagos sobre una base individual, estos métodos sufren de los efectos potenciales sobre la viabilidad, la caída limitada de genes, y la variabilidad del gen a gen. Para desarrollar ensayos más robustos que podrían ser utilizados para apuntar a genes de la moda de mediano o de alto rendi.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Este artículo fue patrocinado por Lonza, Inc.

Agradecimientos

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Gracias a Brad Lackford por su ayuda en la optimización de algunas de las técnicas descritas en este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sistema de lanzadera de 96 pocillos Amaxa NucleofectorLonzaAAM-1001S
en el gen
Pool de siRNA de control no dirigidoDharmaconD-001206-13-20
Block-iT oligonucleótido fluorescente para electroporaciónInvitrogen13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 Lista de LPSBiological Laboratories421
DMEM, alta glucosaInvitrogen11995-065
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Solución de penicilina-estreptomicina (pluma/estreptococo)FisherSV30010
0,25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200072
placas de cultivo de tejidos de 96 pocillosFisher07-200-89  
Placas estériles de fondo redondo de 96 pocillos (sin recubrimiento)Fisher07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kitR& D BiosystemsDY406
Ratón TNFα Kit Duoset ELISAR& D BiosystemsDY410
Diacetato de fluoresceínaSigma-AldrichF7378
Tampón RLTQiagen79216
RNeasy mini kitQiagen74134
Vybrant Kit de ensayo de fagocitosisInvitrogenV-6694
Línea celular Amaxa SF Kit de nucleoefecto de 96 pocillos Lonza V4SC-2096 RAW264.7 línea celular de macrófagos de ratón ATCC TIB-71 J774A.1 línea celular de macrófagos de ratón ATCC TIB-67 siGenome smartpool siRNA Dharmacon varía en función

Referencias

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  1. Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. The innate immune response to infection. , ASM Press. (2004).
  2. Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
  3. Fujiwara, N., Kobayashi, K.

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