Proporcionamos un protocolo detallado para la inducción de la potenciación a largo plazo en la región CA1 del hipocampo y el posterior aislamiento de fracciones enriquecidas nucleares de la zona de tetanized de la rodaja. Este enfoque puede ser utilizado para determinar la actividad de importación nuclear dependiente de proteína en modelos celulares de aprendizaje y memoria.
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Artículo de método
Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares
En este artículo
Resumen
Resumen
El estudio de la actividad de la expresión de proteínas dependientes, translocación subcelular, o fosforilación es esencial para entender los mecanismos celulares subyacentes de la plasticidad sináptica. La potenciación a largo plazo (LTP) y depresión a largo plazo (LTD) inducida en cortes de hipocampo agudos son ampliamente aceptados como modelos celulares de aprendizaje y la memoria. Existen numerosos estudios que usan imágenes de células o de inmunohistoquímica enfoques en vivo para visualizar la actividad dinámica de las proteínas dependientes. Sin embargo, estos métodos se basan en la idoneidad de los anticuerpos para inmunocitoquímica o sobreexpresión de proteínas de fluorescencia de etiquetado en las neuronas individuales. La inmunotransferencia de proteínas es un método alternativo que proporciona una confirmación independiente de los resultados. El primer factor limitante en la preparación de fracciones subcelulares de cortes de hipocampo tetanized individuales es la baja cantidad de material. En segundo lugar, el procedimiento de manejo es crucial porque las manipulaciones incluso muy cortos y menores de living rebanadas podría inducir la activación de ciertas cascadas de señalización. Aquí se describe un flujo de trabajo optimizado con el fin de obtener una cantidad suficiente de la fracción nuclear enriquecido de suficiente pureza a partir de la región CA1 de cortes de hipocampo agudos de cerebro de rata. Como ejemplo representativo se muestra que la ERK1 / 2 forma fosforilada de la proteína nuclear mensajero synapto-Jacob activamente transloca al núcleo después de la inducción de la LTP y se puede detectar en una fracción enriquecida nuclear de las neuronas CA1.
Introducción
Sináptica N-metil-D-aspartato-receptores (NMDAR) juegan un papel crucial en la plasticidad sináptica y la supervivencia celular de señalización mientras que la activación de los NMDAR extrasinápticos puede desencadenar la neurodegeneración y la muerte celular. Estos cambios dependen de / actividad regulada la expresión génica dependiente fuertemente controlada y por lo tanto requieren una comunicación constante entre las sinapsis o dendritas activados y el núcleo 7. El MAP quinasas ERK1 / 2 son los efectores de NMDAR sinápticos de señalización y están involucrados en la expresión génica inducida por NMDAR activación, mientras que la señalización a través d....
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Protocolo
1 Preparación de aguda hipocampo rebanadas de cerebro de rata adulta
- Anestesiar las ratas con isoflurano. PRECAUCIÓN: Realice el procedimiento utilizando un desecador cerrado, no inhale el isoflurano. Asegúrese de que el animal está completamente anestesiado.
- Decapitar a la rata, aislar rápidamente el cerebro, y sumergirlo en precarbonated (95% de O2 / 5% de CO mezcla de gas 2) solución de Gey (composición en mM en frío de hielo: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl 2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl2 · 6H 2 O, 0,23 KH 2 PO 4, 0,8 Na 2....
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Resultados
Hemos demostrado previamente que la proteína nuclear synapto-mensajero Jacob acumula en el núcleo después de la inducción de la LTP pero no LTD 1. Por otra parte, la translocación de Jacob después de la estimulación sináptica requiere la activación de la MAPK ERK1 / 2 y la fosforilación de Ser180 a Jacob (Figura 1). Jacob fosforilado se transloca al núcleo de una manera importin-dependiente y el estado fosforilado se puede conservar durante períodos prolongados de tiempo por la asociación con.......
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Discusión
Los pasos descritos en el protocolo anterior proporcionan una guía de cómo preparar aguda hipocampo rodajas de ratas jóvenes o adultos, inducir y registro LTP, diseccionar rápidamente área estimulada de la rebanada, y preparar fracción enriquecida nuclear para el estudio de la actividad dinámica de las proteínas dependientes. Este enfoque se deriva de la combinación de varios métodos diferentes usados independientemente uno de otro. Hemos optimizado el flujo de trabajo y proporcionar suficientes detalles para el princ.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), la subvención DIP (MRK), el EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), el Centro de Ciencias del Cerebro del Comportamiento (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK y SB), MM es beneficiario de la beca a largo plazo de la Organización Europea de Biología Molecular (EMBO) (EMBO ALTF 884-2011) y Marie-Curie IEF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA convertidor Cambridge | Electronics Design, UK | ||
| a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Microscopio estereoscópico | Leica S4E, Alemania | ||
| Vibrotomo | Leica VT1000S, Alemania | ||
| Estimulador de impulsos aislado | A-M Systems, EE. UU. | Centrífuga modelo 2100 | |
| Sistema Thermo Scientific | |||
| SDS-PAGE | Biorad | ||
| Cooler | Julabo | ||
| Microscopio de campo claro | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Incubadora de cultivos celulares | Micromanipulador | ||
| Luigs & Neumann, SM-5, Alemania | |||
| Cámara de transferencia y proveedor de energía eléctrica | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Cámara de registro de tipo sumergido | hecha | ||
| forma de U e incubadora de tipo sumergido | hecho | ||
| Tijeras quirúrgicas pequeñas | |||
| Vaso de precipitados | |||
| Jeringa | |||
| Reactivos | |||
| NaCl | Roth Art.-Nr.3957.1 | ≥ 99.5%, p.a., ACS, ISO | |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1& | ge; 99.5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2· 2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4· 2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2· 6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | para biología molecular |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | para biología molecular |
| Na2HPO4· 2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra pura |
| · H2O Roth | Art.-Nr.6887.1 | para biología molecular | |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥ 99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro análisis |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurano | Baxter | ||
| Anticuerpos | |||
| Anticuerpos primarios | Número de catálogo | la empresa | Especie |
| pJac-s180 | Biogenes | conejo (diluido 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | ratón (diluido 1:1.000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | conejo (diluido 1:1.000) |
| Beta-actina | Sigma | A-5441 | ratón (diluido 1:5.000) |
| Anticuerpos secundarios | Número de catálogo | la empresa | Especie |
| IgG HRP conjugada | DAKO | cabra anti-ratón (1:5.000) | |
| IgG HRP conjugada | NEB | cabra anti-conejo (1:5.000) |
Referencias
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276(2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T.
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Reimpresiones y permisos
