Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares

Sináptica N-metil-D-aspartato-receptores (NMDAR) juegan un papel crucial en la plasticidad sináptica y la supervivencia celular de señalización mientras que la activación de los NMDAR extrasinápticos puede desencadenar la neurodegeneración y la muerte celular. Estos cambios dependen de / actividad regulada la expresión génica dependiente fuertemente controlada y por lo tanto requieren una comunicación constante entre las sinapsis o dendritas activados y el núcleo ^7. El MAP quinasas ERK1 / 2 son los efectores de NMDAR sinápticos de señalización y están involucrados en la expresión génica inducida por NMDAR activación, mientras que la señalización a través de NMDAR extrasynaptic no tiene o tiene un efecto inhibitorio sobre la ERK1 / 2 Actividad ^8,11.

Hay una serie de proteínas que han demostrado lanzadera entre dendritas distales y el núcleo. Muchas de estas proteínas contienen una señal de localización nuclear y son transportados activamente a lo largo de los microtúbulos en un dineína y forma importina dependiente al núcleo ^6,9. Interestingly, algunos de estos mensajeros sólo de tránsito al núcleo en respuesta a estímulos sinápticos específicos. Por ejemplo, el transporte retrógrado de AMP cíclico elemento de respuesta a la proteína de unión 2 (CREB2) es inducida por LTD química pero no LTP ^12. Localizada estimulación sináptica dependiente de NMDAR impulsa coactivador transcripcional CREB reguladas (CRTC1) en el núcleo, un proceso de translocación, que está implicado en la plasticidad del hipocampo a largo plazo ^4. Se ha demostrado recientemente que el mensajero de proteínas Jacob se transloca al núcleo después de tanto, la activación NMDAR sinápticos y extrasynaptic y regula la transcripción génica dependiente de CREB ^5. El origen sináptica o extrasynaptic de la señal se codifica en una modificación postraduccional de Jacob. La actividad sináptica induce ERK1 / 2 fosforilación dependiente de Jacob en una serina en la posición 180 fundamental (pJacobS 180), que es un requisito para la posterior translocación al núcleo del hipocampo en cultivo primario. Por otra parte, in neuronas CA1 del hipocampo rebanadas agudas pJacobS 180 transloca al núcleo después de Schaffer garantía LTP pero no LTD ^1,10. PS180 Jacob lleva a un aumento de la expresión de genes relacionados con la plasticidad y la expresión de los genes se alimenta de nuevo a la función sináptica. En agudo contraste, Jacob que se transloca al núcleo después de la activación NMDAR extrasinápticos no está fosforilada en Ser180 y podría estar asociado con diferente complejo de proteínas en el núcleo causando 'CREB apagado' y una retracción de los contactos sinápticos ^10.

Mayoría de los estudios publicados sobre la importación nuclear de synapto-nuclear proteína mensajera se han realizado en cultivos primarios neuronales disociadas. Por lo tanto, sería interesante ver si estos hallazgos pueden ser reproducidos en fisiológicamente más relevante condiciones utilizando rebanadas de hipocampo donde la conectividad neuronal y la función son mucho mejor conservado. Aquí presentamos un protocolo optimizado para la evaluación de LTP-deColgante translocación nuclear de los mensajeros de proteínas por inmunotransferencia. Este método también es adecuado para el análisis de la actividad de fosforilación dependiente de proteínas en una fracción nuclear crudo. En concreto, el actual protocolo implica la preparación de rodajas de hipocampo CA1 agudas, la inducción y la grabación de la LTP. A continuación, la región CA1 se diseccionó microscópicamente para aislar la región estimulada. Hemos combinado y modificado el protocolo para el aislamiento nuclear proporcionada por CellLytic NuCLEAR Extraction Kit con los cambios introducidos por Zhao y sus colegas ^17. El procedimiento optimizado incluye la lisis de las regiones CA1 disecados en tampón hipotónico que permite hinchazón celular y liberación de núcleos. La lisis celular y la morfología de los núcleos pueden ser determinadas por examen microscópico. De enriquecimiento nuclear se logra mediante una etapa de centrifugación corta. Análisis de inmunotransferencia con anticuerpos contra NeuN y NSE2, marcadores específicos de fracciones citosólicas o nucleares, indica que este enfoque puede ser utilizado como un rápidoy el protocolo reproducible para aislar estas fracciones subcelulares y estudiar las modificaciones posteriores a la traducción muy lábiles como la fosforilación de proteínas. Además, este método es ventajoso para las pequeñas muestras de tejido que se derivan de regiones CA1 de cortes de hipocampo disecados y se puede utilizar en combinación para inmunohistoquímica de cortes de hipocampo.

1 Preparación de aguda hipocampo rebanadas de cerebro de rata adulta

1. Anestesiar las ratas con isoflurano. PRECAUCIÓN: Realice el procedimiento utilizando un desecador cerrado, no inhale el isoflurano. Asegúrese de que el animal está completamente anestesiado.
2. Decapitar a la rata, aislar rápidamente el cerebro, y sumergirlo en precarbonated (95% de _O2 / 5% de CO mezcla de gas ₂₎ solución de Gey (composición en mM en frío de hielo: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O , 0.3 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 11 _MgCl2 · 6H ₂ O, 0,23 KH ₂ PO _4, 0,8 Na ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O, 5 Glucosa · H ₂ O, 25 HEPES, 22 de _NaHCO3, pH 7,32) durante 30 min ^1,2,10,16.
3. Retire el cerebelo y parte de la corteza entorrinal. Separar los hemisferios corticales con un corte sagital medio, a continuación, coloque cada hemisferio abajo en su superficie medial. A partir de entonces hacerun 50-70 ° corte (50-70 ° transversal) a lo largo del borde dorsal de cada hemisferio ^13,14.
4. Pegar cada hemisferio con la superficie recién cortada en la plataforma de corte del sistema de corte. La plataforma debe estar cubierto por la solución de Gey helada precarbogenated.
5. Cortar 350 micras 50-70 ° cortes transversales de anterior a posterior lado usando un vibratome ajustarse para minimizar la oscilación del eje z. La formación del hipocampo, las cortezas subicular y entorrinal, así como las cortezas que se encuentran dorsolateral al hipocampo serán parte de las rodajas utilizadas para los experimentos de ^13,14.
6. Transferencia de cortes de hipocampo a una forma de U y el tipo sumergido incubadora y se incuba durante al menos 2 horas a 32 ° C con líquido cefalorraquídeo artificial carbogenated (ACSF que contiene en mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O, 1,5 MgSO ₄ · 2H ₂ O, 1,24 KH ₂ PO _4, 10 Glucosa · H ₂O, 27.4 _NaHCO3, pH 7,3) ^1,2,10,16.

2. Posicionamiento de Electrodos, grabación de línea de base, y la inducción de la LTP

1. Transferir el corte de hipocampo a una cámara de grabación de tipo sumergido montado bajo un microscopio. Perfusión (6-7 ml / min) con ACSF carbogenated por lo menos durante 30 minutos a 32 ° C.
2. Preparar microelectrodos capilares de vidrio llenas de ACSF (resistencia punta es de 3-5 mW).
3. Coloque unas microelectrodos de vidrio llenas de ACSF en las fibras CA1 Schaffer-garantía para la estimulación y en el estrato radiado CA1 para fEPSP grabación ^1,2,10 (Figura 2). La distancia entre los electrodos debe ser de aproximadamente 300 micras.
4. Evocar campo excitatorios postsinápticos potenciales (fEPSPs) por la estimulación de fibras Schaffer-colaterales con impulsos de corriente rectangulares bifásicos (200 mseg / polaridad) en un rango de 3-4 V.
5. Realice la prueba de estimulación máxima midiendo el inprelación ut-producto y definir la intensidad de estimulación como el 40% de los valores máximos fEPSP-pendiente obtenidos y mantenerla constante durante todo el experimento.
6. Comienza la grabación de la línea de base durante al menos 15 minutos después de la prueba de estimulación máxima. Medir las respuestas a estímulos probar cada minuto durante todo el experimento. Realizar grabaciones de línea de base con la estimulación de baja frecuencia.
7. Anote la línea de base durante al menos 30 min.
8. Para Late-LTP inducción aplicar de alta frecuencia 100 Hz tetanización que consta de tres trenes de estímulo 1 seg a 100 Hz con un intervalo intertrain 5 min. Para aumentar el campo de la estimulación dentro CA1 región 5 M bicuculina se pueden lavar en 2 min antes de tetanización y se deben lavar inmediatamente después de la última tetanización.

3. Colección de rebanadas después de la inducción de LTP y Snap Congelación

1. Detener grabación LTP 2 min o 30 min después de tres trenes de estimulación tetánica inducen Late-LTP.
2. Recoge cada rebanada en un tubo de 1,5 ml y almacenar a -80 ° C.

4. Aislamiento de fracciones nucleares enriquecidos de la región CA1 del hipocampo

1. Tomar 1,5 ml tubos Eppendorf con las rodajas congeladas de -80 ° C y mantenerlos en hielo.
2. Añadir 0,5 ml de solución tampón que contiene proteasa fresca fría TBS (PI) y los inhibidores de la fosfatasa (PS), en el tubo. Incubar durante 2-3 min y transferir a un microscopio estereoscópico. PRECAUCIÓN: Use guantes de protección y una bata de laboratorio mientras trabajaba con PI y PS.
3. Diseccionar la región estrato piramidal CA1 del hipocampo utilizando dos agujas. Utilice una aguja para sujetar la rebanada bajo el microscopio estereoscópico y la segunda aguja para el corte de la zona CA1.
4. Recoger el CA diseccionado1 regiones de 5 rebanadas (para cada grupo) en un nuevo tubo de 1,5 ml contiene 50 l de tampón de lisis (1x tampón de lisis hipotónica que contiene en mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl _2, 10 KCl, pH 7,9, con PI y PS). Tenga en cuenta que esta cantidad de material será suficiente para ejecutar 2-3 inmunotransferencias.
5. Homogeneizar los tejidos recogidos por cuidado de pipeteo hacia arriba y abajo. Utilice una pipeta de 200 l. Incubar el lisado en hielo durante 5-7 minutos para permitir que las células se hinchen.
6. Tomar 2 l de lisado, caer en un portaobjetos de microscopio, y visualizar la inflamación de las células bajo un microscopio de campo claro. Con hinchazón adecuada de las células de los núcleos aparecen como estructuras intactas ronda.
7. Recoger 20 l de muestra en un tubo de 1,5 ml fresco como 'fracción homogeneizado'. Agregue 8 l de desnaturalización SDS muestra de amortiguación 4x.
8. Centrifugar los lisados ​​restantes a 11.000 rpm durante 1 min.
9. Recoger cuidadosamente el sobrenadante de la parte superior ('fracción citosólica'), transfer en un nuevo tubo y añadir 20 l de tampón de muestra 4x.
10. Resuspender el precipitado en 60 l de tampón hipotónico y añadir 20 l de tampón de muestra 4x. Esta fracción se conoce como una "fracción nuclear enriquecido '.
11. Homogenado, citosólicas y nucleares fracciones enriquecidas pueden ser almacenadas a -20 ° C o -80 ° C durante inmunotransferencia más tarde.

5. Inmunoblotting Semicuantitativo para Proteínas Synapto nucleares

1. Descongelar las muestras y hervir durante 5 minutos a 95 ° C.
2. Tome 5 l de cada fracción y determinar la concentración de proteínas por amido negro de prueba o prueba BCA.
3. Carga igual cantidad de muestras de proteínas de homogeneizado, fracciones enriquecidas citoplasmáticas y nucleares en SDS-PAGE. Las muestras de control y LTP rebanadas deben ser colocados en el mismo gel para la comparación directa.
4. Realice un procedimiento de Western Blot estándar (se recomienda la transferencia húmeda).
5. Sondear las membranas con tél anticuerpo de elección. Posteriormente los mismos blots (o mismas muestras se ejecutan en paralelo) se pueden probaron con un marcador citoplásmico - enolase2 neuronal específica (NSE2) y el marcador nuclear - NeuN y un anticuerpo actina como control de carga.

Análisis 6. Datos

1. La eficiencia de la inducción de LTP puede ser analizado por el software Clampfit. La pendiente media de grabaciones de referencia se comparó con las pistas después de tetanización usando ANOVA de dos vías, p <0,05 fue considerado significativamente diferentes. Los valores de pendiente fEPSP fueron representados en los diagramas como la media ± SEM
2. Para la cuantificación de inmunotransferencias, escanear la película de autorradiografía y analizar la densidad integrada de las bandas de proteínas por ImageJ o bandas de fluorescencia con un sistema Licor. Los valores de las bandas inmunorreactivas deben ser normalizados para el control de carga y secante. Para la comparación de los grupos control y LTP podría utilizarse un Mann-Whitney U-prueba no paramétrica.

Tabla 1. Tampones.

Hemos demostrado previamente que la proteína nuclear synapto-mensajero Jacob acumula en el núcleo después de la inducción de la LTP pero no LTD 1. Por otra parte, la translocación de Jacob después de la estimulación sináptica requiere la activación de la MAPK ERK1 / 2 y la fosforilación de Ser180 a Jacob (Figura 1). Jacob fosforilado se transloca al núcleo de una manera importin-dependiente y el estado fosforilado se puede conservar durante períodos prolongados de tiempo por la asociación con el filamento intermedio αinternexin 15 (Figura 1). El fosfo-estado de Jacob es importante para la expresión de genes dependientes de la actividad y la supervivencia celular. Curiosamente, la activación de los NMDAR extrasinápticos también impulsa Jacob en el núcleo pero en este caso Jacob no es fosforilada en Ser180 y su acumulación nuclear induce CREB 'apagado' 5,10. Los resultados descritos anteriormente se obtuvieron por protocols establecidas en nuestro estudio reciente (véase Karpova et al. 10 para una descripción detallada del modelo).

Para probar que Jacob se transloca en el núcleo después de la inducción de la LTP, se indujo y se midió la inducción de la potenciación a colateral de Schaffer fEPSP en cortes de hipocampo agudos y posteriormente aislados núcleos neuronales de las neuronas CA1 (figuras 2 y 3). Se han comparado dos momentos diferentes después de la aplicación de la estimulación de alta frecuencia (2 min y 30 min) y grabamos la inducción de LTP para cada sector que fue procesada posteriormente para el aislamiento nuclear y el Western Blot (Figuras 2 y 3). Enriquecimiento del marcador neuronal NeuN nuclear se puede ver en la fracción enriquecida nuclear preparado a partir de la región CA1 diseccionado, mientras que la neurona marcador citosólico enolase2 específica (NSE) es en su mayoría presentes en la fracción sobrenadante obtenido después de la centrifugación de c lisaronells (Figura 4A). La especificidad del anticuerpo PS180 Jacob se ha caracterizado previamente (para más detalles véase Karpova et al. 10). niveles PS180 Jacob permanecieron inalterados en el total de los homogeneizados de proteínas CA1 y en la nuclear enriquecido fracción 2 min después tetanización (Figura 4B), pero encontramos un aumento significativo en pJacobS 180 inmunorreactividad 30 min después de la inducción de la LTP (Figura 4 C), lo que confirma que Jacob translocación al núcleo en este modelo de plasticidad celular es fosforilada en Ser180.

Figura 1. Jacob fosforilados en S180 codifica el origen sináptica de las señales de NMDAR. Estimulación tetánica de fibras colaterales de Schaffer de hipocampo resultados en la activación de los NMDAR sinápticos y la posterior activación de MAPKERK1 / 2 cascada de señalización. Activado ERK1 / 2 se une y fosforila en la serina 180 Jacob y Jacob-ERK1 / 2 complejo se transloca al núcleo y esto se correlaciona con una mayor actividad de CREB y la activación de la plasticidad relacionada con la expresión génica.

Figura 2 Equipos y herramientas utilizadas para la inducción de LTP y la disección de la región CA1 de cortes de hipocampo. A) Vibratome utiliza para la preparación de cortes de hipocampo agudas (1 - Vibratome) B1-2) Electrofisiología y configuración de imagen (2 - Microscopio; 3 - Micromanipulador y sistema de perfusión; 4 - electrodo recodificación; 5 - electrodo de estimulación; 6 - El agua de la lente objetivo ; 7 - titular de la rebanada con la rebanada del hipocampo) C) El equipo utilizado para la disección de la región CA1 de cortes de hipocampo (8 Stereomicroscope; 9 - jeringa de insulina con agujas; 10 - Pequeñas tijeras quirúrgicas; 11 - Escalpelo; 12 - pipeta Pasteur de plástico; 13 - fina espátula; 14-100 mm de plato de cultivo de plástico lleno de agua con hielo, y 40 mm de plato de cultivo de plástico utilizado para la disección de las rebanadas.

Figura 3. historieta que muestre el procedimiento experimental. Los números indican los pasos del protocolo. 2.1 a 2.8) Un corte de hipocampo agudo en la cámara sumergido con electrodos de vidrio colocados en el estrato radiado para la potenciación de colateral de Schaffer-CA1 sinapsis. La inserción representa las huellas analógicas muestra fEPSP, la barra horizontal indica 5 ms y la barra vertical indica 0,5 mV. 3.3) Las rodajas se recogieron en tubos de 1,5 ml después deGrabación de LTP y se congeló. 4.3) La disección de la región CA1 del hipocampo de rata adulta rodajas. 4.4 a 4.5) regiones CA1 homogeneizaron en tampón de lisis hipotónica, lo que provoca la hinchazón osmótica de las células y la liberación de los núcleos. 4.8) La centrifugación de los lisados ​​a 11.000 rpm durante 1 min. 4,10) Colección de las fracciones enriquecidas citoplásmicos y nucleares para inmunotransferencia. 5.3) La carga de fracciones enriquecidas citoplásmicos y nucleares en SDS-PAGE y posterior-Western Blot estándar.

Figura 4. Inducción de CA1 LTP conduce a la acumulación de pJacS180 en el núcleo. A) Inmunotransferencia de homogenado, citosólicas y nucleares fracciones enriquecidas de lisado CA1 probaron con citosólicas y marcadores nucleares. B) El análisis por inmunotransferencia de nivel pJAC-S180 en homogeneizado de 2 min y 30 min después de inducción de tetanización. C) El análisis por inmunotransferencia de nivel pJacS180 en nuclear enriquecido fracción 2 minutos y minutos después tetanización. Estos resultados son parte de gráfico de cuantificación publicado en Karpova et al 10. Estos inmunoblots representativos no están incluidos en la publicación original.

Los autores no tienen nada que revelar.