Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares

Resumen

Describimos un método para mapear las propiedades mecánicas de los tejidos vegetales utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM). Nos centramos en cómo registrar los cambios mecánicos que tienen lugar en las paredes celulares durante el desarrollo de las plantas a mesoescala de campo amplio, lo que permite correlacionar estos cambios con el crecimiento y la morfogénesis.

Resumen

Se describe un método recientemente desarrollado para medir las propiedades mecánicas de las superficies de los tejidos vegetales utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM) micro / nano-indentaciones, para un JPK AFM. En concreto, en este protocolo se mide el módulo aparente de Young de las paredes celulares en resoluciones subcelulares entre regiones de hasta 100 m x 100 m en los meristemos florales, hipocotilos y raices. Esto requiere una cuidadosa preparación de la muestra, la correcta selección de los micro-penetradores y profundidades sangría. Para tener en cuenta las propiedades de la pared celular sólo, las mediciones se realizan en soluciones altamente concentradas de manitol con el fin de plasmolizar las células y por lo tanto eliminar la contribución de la presión de turgencia de la célula.

En contraste con otras técnicas existentes, mediante el uso de diferentes penetradores y profundidades de indentación, este método permite mediciones multiescala simultánea, Sin embargo, varias limitaciones siguen siendo: el método sólo se puede utilizar en bastante pequeñas muestras (alrededor de 100 m de diámetro) y sólo en los tejidos externos; el método es sensible a la topografía de tejido; mide sólo algunos aspectos de las propiedades mecánicas complejas del tejido. La técnica se está desarrollando rápidamente y es probable que la mayoría de estas limitaciones se resolverán en un futuro próximo.

Introducción

El crecimiento de las plantas se logra por la expansión coordinada de las paredes celulares rígidas que rodean a cada célula del organismo. La acumulación de pruebas indica que es a través de la modificación de la química de la pared celular que las plantas locales controlan esta expansión. La expansión se piensa que es impulsado principalmente por la tensión en las paredes de las células, causados ​​por la alta presión de turgencia de la célula; Esta respuesta cepa a la presión de turgencia se rige por las propiedades mecánicas de las paredes celulares ^1. Poco se sabe de estas propiedades mecánicas y la forma en que cambia durante el desarrollo. Además, s....

Protocolo

1. Preparar cristal diapositivas para la Muestra de montaje

1. Preparar imbedding medios de agarosa: 0,7% de agarosa de bajo punto de fusión en el 10% de manitol (en agua).
2. El uso de un instrumento de metal fuerte (por ejemplo, la punta de perforación, cal), grabar un área de 0,5 x 0,5 cm en el centro de un portaobjetos de vidrio microscopía. O en lugar, pegar un pequeño trozo de lámina de vidrio (aproximadamente 20 x 200 m) a la lámina de vidrio con pegamento Araldite. NOTA: Este hace rugosa la superficie a fin de facilitar la adhesión de la agarosa para garantizar que los palos de los medios de comunicación de agarosa o correcciones a la ....

Resultados

En la Figura 1 se presenta típicos mapas móduli jóvenes de meristemos florales (Figuras 1A y 1B), hipocotilos jóvenes y mayores (figuras 1C-F), y meristemas de la raíz (Figura 1G y 1H). En todos los experimentos el penetrador es semiesférica, pero su radio es diferente por lo que las diferentes resoluciones espaciales se pueden lograr figuras 1C y 1D muestran resultados típicos para pen.......

Discusión

En las plantas, el cambio de propiedades mecánicas juegan un papel importante en dirigir el crecimiento y la morfogénesis. Hasta la fecha no ha habido un gran progreso en el descubrimiento de las redes genéticas y químicas que controlan el crecimiento de las plantas, pero nuestro conocimiento de cómo estas redes contribuyen y se ven afectados por los cambios en las propiedades mecánicas es rudimentaria. Este método nos debería permitir a llenar este vacío, y por lo que debe ser de gran interés para los científicos que e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AFM	JPK	NanoWizard	Todas las 3 generaciones son capaces de hacer el trabajo con la misma preferencia.
Etapa AFM	JPK	CellHesion	Requerido para muestras con topografía baja (menos de 11 y micro; m entre el punto más bajo y el punto más alto en el área de escaneo forzado).
Óptica AFM	JPK	Top View Óptica	Muy importante para posicionar la muestra. Podría ser reemplazado por binoculares de largo alcance o un microscopio.
Microscopio estereoscópico	Leica	M125	Cualquier tipo de microscopio estereoscópico podría servir.
Nanosensores en voladizo montados de 150 nm	Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suiza	R150-NCL-10	Para medir solo la pared celular en la superficie de la epidermis use.
1 y micro; m en voladizo	Nanosensores Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suiza	SD-Sphere-NCH-S-10	Para medir la mecánica de la pared celular ortogonal a la superficie de la epidermis.
Voladizo sin punta	Nanosensores Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suiza	TL-NCH-20	Para medir la mecánica local del tejido (2-3 células de ancho) utilice un 5 µ m en voladizo montado. Adjuntamos un 5 µ m Cordón de borosilicato a un voladizo sin punta.
5 y micro; m microesferas de silicio	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, Francia		Araldite para la fijación del cordón al voladizo sin punta.
Agarosa de bajo punto de fusión	Fisher Scientific Fair Lawn, Nueva Jersey 07410	BP160-100	34-45 ° C temperatura de gelificación
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 EE. UU.	M4125-500G
2 pinzas de acero inoxidable n.º 5	Ideal-Tek 6828 Balerna, Suiza