Nanopodia - Proyecciones membrana delgada y frágil con papeles en Movimiento Celular y intercelulares Interacciones

Resumen

Nanopodia son los canales de membrana delgada pero frágiles que se extienden hasta 100 micras de los principales delantero o trasero trasero de una célula y perciben el entorno celular. La fijación directa a 37 ° C, lavado suave, y la evitación de disolventes orgánicos como etanol, metanol, o acetona y de mayores Triton X-100 concentraciones están obligados a observar estas estructuras celulares.

Resumen

Las células adherentes en cultivo mantienen un estado polarizado para apoyar el movimiento y las interacciones intercelulares. Nanopodia son delgadas, alargadas, en gran parte proyecciones de membrana F-actina negativos en las células endoteliales y de cáncer que se pueden visualizar a través TM4SF1 (transmembrana-4-L-seis-familia-1) la tinción de inmunofluorescencia. Racimos TM4SF1 en 100-300 micras de diámetro TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) que contiene 3 a un máximo de 14 TM4SF1 moléculas individuales. TMED están dispuestas intermitentemente a lo largo nanopodia con una separación regular de 1 a 3 TMED por μ m y anclar firmemente nanopodia a la matriz. Esto permite nanopodia extender más de 100 μ m de la parte delantera o trasera que conduce trasera del endoteliales tumorales o células polarizadas, y hace que los residuos de la membrana a quedar atrás en matrIX cuando la célula se aleja. TMED y nanopodia han pasado por alto debido a su extrema fragilidad y sensibilidad a la temperatura. Lavado de rutina y fijación interrumpen la estructura. Nanopodia se conservan por fijación directa en paraformaldehído (PFA) a 37 ° C, seguido por una breve exposición a 0,01% de Triton X-100 antes de la tinción. Nanopodia abrir nuevas perspectivas en la biología celular: prometen a remodelar nuestra comprensión de cómo las células perciben su entorno, detectar e identificar otras células a distancia, iniciar interacciones intercelulares en estrecho contacto, y de los mecanismos de señalización que participan en el movimiento, la proliferación celular y la comunicaciones en células. Los métodos que se desarrollan para el estudio nanopodia derivados de TM4SF1 pueden ser útiles para los estudios de nanopodia que se forman en otros tipos de células a través de la agencia de tetraspanins clásicos, especialmente el CD9 expresión ubicua, CD81, CD151 y.

Introducción

Durante la polarización para el movimiento, las células animales se extienden una variedad de salientes, de membrana dinámicos de sus superficies, incluyendo filopodios, lamelipodios, fibras de retracción, y volantes ^1. Recientemente añadido a esta lista fueron nanopodia, un tipo recién reconocido de fina (100-300 m de diámetro), alargadas (hasta 50-100 m de largo) de proyección de la membrana que proporcionan los canales de membrana para la extensión de las estructuras de actina F, como filopodios y retracción de la fibra, y que la mancha positivamente con TM4SF1 (transmembrana-4-L-seis-familia-1) en endoteliales y tumorales células cultivadas ^2,3.

Protocolo

1. Cultivo de células en el disco de vidrio recubierto de colágeno

1. Lugar discos de vidrio (12 mm de diámetro) en un frasco de vidrio (4 oz) y autoclave para esterilizar los discos.
2. Ponga etanol 25 ml de 70% en un tubo Falcon de 50 ml y colocarlo en una campana de cultivo celular. Esta solución puede ser reutilizado varias veces hasta que el nivel de la solución se reduce a 20 ml.
3. Coloque unas afiladas pinzas con un punto extra fino en el etanol al 70% durante 5 minutos antes de usarla para manejar el disco de vidrio.
4. Retire con cuidado la pinza del tubo y cerrar la tapa, a continuación, coloque suavemente la pinza de etanol tr....

Resultados

Para el Paso 1:

Si las células (como HUVEC y PC3 utilizado en este estudio) son capaces de crecer normalmente, las células se unen al disco revestido con colágeno dentro de 30 minutos después de que se siembran, se polarizan y se convierten en móvil poco después, y se extienden nanopodia por delante de su camino de movimiento. Figuras 1A y 1B, respectivamente, muestran un polarizada y la proliferación de HUVEC. Figura 2A muestra células PC3 pol.......

Discusión

Nanopodia son canales de la membrana celular delgadas que se adhieren firmemente a la matriz a través de TMED y pueden extenderse a más de 100 m de una célula móvil polarizada para detectar el medio ambiente y mediar en las interacciones intercelulares ^2,3. Nanopodia adherirse a la matriz tan firmemente que los residuos se quedan atrás ya que los celulares se aleja (Figuras 1 y 2). Así Nanopodia permite el estudio de cómo las células perciben su entorno y determinar la trayec.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Discos de vidrio	Fisher Scientific	12-545-82	12 mm de diámetro
	Fisher Scientific	02-912-310	Certified Clean Clear Glass Frascos de lados rectos, 4 oz
Portaobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-544-1	Portaobjetos de microscopio de vidrio liso Fisherfinest Premium
50 ml Tubo Falcon	BD Falcon	352070	Tubo centrífugo cónico de polipropileno de alta claridad de 50 ml, clasificación de 16.000 rcf. Estéril.
Tubo Falcon de 15 ml con gradilla de espuma de poliestireno	Corning	430790	Corning 15 ml PP Tubos de centrífuga
Pinzas afiladas	Fisher Scientific	13-812-42	Pinzas de disección de astillas puntiagudas extrafinas
Placa de cultivo celular de 24 pocillos	BD Bioscience	353047	de 24 pocillos Placa de cultivo celular
150 mm BD	Bioscience	353025	placa de cultivo celular de 150 mm
19 G 1 y frac12; Aguja de jeringa	BD Bioscience	309635	19 G 1 & frac12;
Laboratorios	de Etanol Decon, Inc.	2701	Decon's Pure Ethanol 200 Proof Solución de
colágeno	BD Bioscience	354249	Colágeno I, Alta Concentración, cola de rata, 100 mg
Tripsina/EDTA	Cellgro	25-053-CI	0.25% Tripsina-EDTA 1x
DMEM	Life Technologies	11965-092	DMEM alta glucosa (1x), líquida, con L-glutamina, sin piruvato de sodio
10x PBS	Affymetrix	75889 5 LT	PBS, 10x Solución, pH 7.4
PFA (paraformaldehído)	Affymetrix	19943 1 LT	4% en PBS
FBS	Sigma-Aldrich	F4135-500ML	Suero Fetal Bovino
EGM2-MV	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit, EBM-2 Medio Basal 500 ml y EGM-2 SingleQuot Kit Suplemento & Factores
de crecimiento Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Solubilizado en agua. 4% de solución madre y concentración de trabajo es 0.4%.
Anticuerpo anti-humano TM4SF1 para ratones	Millipore	MAB3127	Epitope se encuentra en el dominio extracelular
Ratón anti-anticuerpo CD9 humano	BD Bioscience	555370	se encuentra en el dominio extracelular
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody	Life Technologies	A-21202	Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)
Phalloidin	Chemicon	90324	Phalloidin conjugada con rodamina
Medios de montaje anti-decoloración	Life Technologies	P-36931	ProLong Gold Reactivo antidecoloración con DAPI
70% de etanol			17,5 ml de etanol (200 grados) 7,5 ml de agua de doble desionización
10x PBS (hacer 200 ml)			20 ml de 10x PBS 180 ml de agua de doble desionización
20% Triton X-100 (hacer 20 ml)			4 ml de Triton X-100 16 ml de agua de doble desionización
4% NaN3 (rinde 25 ml)			1 g de NaN3 25 ml de agua doblemente desionizada
50 ng/ml Solución de colágeno bovino en PBS (haga 5 ml)			Solución madre de 50 μ g/ml (50 ml) 830 μ l de colágeno I (3 mg) 50 ml PBS
Tampón bloqueante ICC (50 ml)			49 ml PBS 2% FBS (añadir 1 ml) 0,04% NaN3 (añadir 100 μ l de 4% NaN3)
Tampón de bloqueo ICC/0.01% Triton X-100 (haga 50 ml)			50 ml de tampón de bloqueo ICC 25 μ l de 20% Triton X-100
HUVEC	Lonza	C2517A	www.lonza.com
PC3	ATCC	CRL-1435	www.atcc.org
Campana de cultivo celular	NuAIRE	Nu-425-600	NU-425 (Serie 60) Cabina de seguridad biológica
37 y s° C, 5% CO2 Incubadora de cultivos celulares	CellStar	QWJ300DABA	Cellstar CO2
Almohadilla térmica para incubadora con camisa de agua	K& H Fabricación	1020	K& H Lectro Almohadilla térmica para jaula con cubierta de vellón libre (www.amazon.com)
Centrífuga	Sorvall	T6000B	Sorvall T6000 (B) Hemocitómetro centrífugo de sobremesa
	Sigma-Aldrich	Z359629	Hemocitómetro Bright-Line

Tarro de vidrio de deEl epítopo