El ascorbato desempeña numerosos papeles importantes en el metabolismo celular, muchos de los cuales sólo han salido a la luz en los últimos años. Aquí se describe un rendimiento medio, ensayo específico y de bajo costo de microplacas para la determinación tanto de ascorbato intra y extracelular en cultivos de células.
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Artículo de método
Un ensayo rápido y específico de microplacas para la Determinación de ascorbato intra y extracelular en células cultivadas
En este artículo
Resumen
Resumen
La vitamina C (ascorbato) desempeña numerosos papeles importantes en el metabolismo celular, muchos de los cuales sólo han salido a la luz en los últimos años. Por ejemplo, dentro del cerebro, ascorbato actúa de una manera neuroprotector y neuromodulador que implica el ciclismo ascorbato entre las neuronas y astrocitos vecinales - una relación que parece ser crucial para la homeostasis ascorbato cerebro. Además, la evidencia emergente sugiere fuertemente que el ascorbato tiene un papel ampliado en gran medida en la regulación del metabolismo del hierro celular y sistémica que se reconoce clásicamente. El creciente reconocimiento del papel integral de ascorbato en la fisiología celular y del organismo normal y desregulado exige un rango de mediano rendimiento y alta sensibilidad técnicas analíticas que se pueden ejecutar sin la necesidad de equipo especializado altamente costoso. Aquí proporcionamos instrucciones explícitas para un medio de rendimiento, ensayo específico y relativamente barato microplaca para la determinación de la boª ascorbato intra y extracelular en cultivos de células.
Introducción
El descubrimiento de la naturaleza química del ácido ascórbico (vitamina C), y su identificación como el largamente buscado "factor anti-escorbuto", de Albert Szent-Györgyi y otros en los artículos publicados desde 1928 hasta 1934 1 han sido hitos importantes en la historia de la bioquímica. De hecho, estos descubrimientos han contribuido a Szent-Györgyi siendo galardonado con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1937. La suite en constante expansión de los roles de ascorbato en la fisiología animal y vegetal, así como la salud humana, siguen siendo los temas de activo científica investigación y controversia.
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Protocolo
1. Determinar ascorbato intracelular en células cultivadas
- Cultivo de células y la cosecha
- Crecer de suspensión (por ejemplo, la eritroleucemia humana K562) o células adherentes (por ejemplo, los astrocitos primarios) utilizando procedimientos estándar de cultivo 19-21,32,38. Nota: para garantizar las células contienen ascorbato, se cargan las células cultivadas con ascorbato, ya sea como ascorbato o DHA 33,39.
- Crear un extracto celular que contiene ascorbato-
- Incubar un número apropiado de solución salina tamponada con fosfato de suspensión (PBS....
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Resultados
Determinación de ascorbato intracelular en las células cultivadas en suspensión
En el primer ensayo (Figura 1), ascorbato intracelular se determina, después de ascorbato-específica (es decir, AO-sensible) reducción de ferricianuro a ferrocianuro, utilizando la determinación altamente sensible de ferrocianuro por un procedimiento publicado previamente 37. La detección de ascorbato se basa en la quelación colorimétrico de hierro ferroso que se genera por la re.......
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Discusión
En este trabajo se presentan dos ensayos de microplaca colorimétricos rápidos, concretos y relativamente sensibles para la determinación de ascorbato derivado de los compartimentos intra y extracelulares en las células cultivadas. Los ensayos pueden ser completados con el acceso a equipos de laboratorio estándar y los reactivos. El reactivo sólo moderadamente costosa requerida para el ensayo es AO, que es esencial, ya que imparte un alto grado de especificidad analito hacia L-ascorbato. Lo.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos al Dr Stephen Robinson y la Sra. Hania Czerwinska (Universidad de Monash) por la generosa oferta de cultivos de astrocitos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de fondo plano Nunc de 96 pocillos | Thermo | 269620 | Se puede utilizar cualquier placa de fondo plano de 96 pocillos |
| Microcentrífuga de sobremesa refrigerada | Eppendorf | 5415D | También se puede utilizar una microcentrífuga no refrigerada que se haya equilibrado a la temperatura en una cámara frigorífica |
| Centrífuga de sobremesa refrigerada | Eppendorf | 5810R | Cubeta |
| oscilanteEspectrofotómetro de microplacas Bio-Rad Benchmark Plus | Bio-Rad | Se puede utilizar cualquier espectrofotómetro de microplacas capaz de leer a 593 nm y se recomienda. Si se utiliza un lector de placas basado en filtro, elija la longitud de onda más cercana posible y utilice el método de curva estándar. | |
| Ependorf MixMate (mezclador orbital de microplacas) | Eppendorf | Se trata de un mezclador de microplacas muy versátil y fiable y funciona muy bien para estos ensayos | |
| Tampones de | |||
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 | |||
| Solución salina tamponada con MOPS (MBS); 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7,3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucosa (MBS/D) | |||
| Solución salina tamponada con HEPES + 5 mM de D-glucosa (HBS/D); 137 mM de NaCl, 5,2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2• 2 H2O, 0,8 mM MgSO4&toro; 7 H2O, 5 mM de D-glucosa, 20 mM de HEPES-Na+, pH 7,3) | |||
| Tampón de permeabilización celular (CPB; 0,1% de saponina en PBS) | |||
| Productos químicos | |||
| Ácido L-ascórbico o L-ascorbato de sodio | Sigma-Aldrich | Se deben obtener preparaciones de máxima pureza | |
| Dímero de ácido dehidro-L-ascórbico (DHA) | Sigma-Aldrich | 30790 | soluciones acuosas producen teóricamente 2 moles de monómero de DHA por mol de dímero de DHA |
| Citocalasina B | Sigma-Aldrich | C6762 | Soluciones madre preparadas en DMSO o etanol |
| Ascorbato oxidasa (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Las soluciones madre (120 U/ml) pueden prepararse en PBS o MBS y luego congelarse en alícuotas |
| Ferricianuro de potasio (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihidrato |
| Ferene-S (3-(2-Piridil)-5,6-di(2-furil)-1,2,4-triazina-5′,5′ ′-sal disódica del ácido disulfónico) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| L-glutamato de sodio | Sigma-Aldrich | ||
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare una solución madre al 0,1% |
| Soluciones madre para el ensayo | |||
| 3 M acetato de sodio (pH 6,0) | |||
| Ácido | |||
| 0,2 M Ácido | |||
| 3,3 mM FeCl3 en 0,1 M Ácido | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) de ácido acético + 30% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA) | |||
| Soluciones madre para ensayo | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2,4 mM ferene-S | |||
| 0,12 mM FeCl3 en 0,6 mM de citrato |
Referencias
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. ....
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Reimpresiones y permisos
