Un ensayo rápido y específico de microplacas para la Determinación de ascorbato intra y extracelular en células cultivadas

Resumen

El ascorbato desempeña numerosos papeles importantes en el metabolismo celular, muchos de los cuales sólo han salido a la luz en los últimos años. Aquí se describe un rendimiento medio, ensayo específico y de bajo costo de microplacas para la determinación tanto de ascorbato intra y extracelular en cultivos de células.

Resumen

La vitamina C (ascorbato) desempeña numerosos papeles importantes en el metabolismo celular, muchos de los cuales sólo han salido a la luz en los últimos años. Por ejemplo, dentro del cerebro, ascorbato actúa de una manera neuroprotector y neuromodulador que implica el ciclismo ascorbato entre las neuronas y astrocitos vecinales - una relación que parece ser crucial para la homeostasis ascorbato cerebro. Además, la evidencia emergente sugiere fuertemente que el ascorbato tiene un papel ampliado en gran medida en la regulación del metabolismo del hierro celular y sistémica que se reconoce clásicamente. El creciente reconocimiento del papel integral de ascorbato en la fisiología celular y del organismo normal y desregulado exige un rango de mediano rendimiento y alta sensibilidad técnicas analíticas que se pueden ejecutar sin la necesidad de equipo especializado altamente costoso. Aquí proporcionamos instrucciones explícitas para un medio de rendimiento, ensayo específico y relativamente barato microplaca para la determinación de la boª ascorbato intra y extracelular en cultivos de células.

Introducción

El descubrimiento de la naturaleza química del ácido ascórbico (vitamina C), y su identificación como el largamente buscado "factor anti-escorbuto", de Albert Szent-Györgyi y otros en los artículos publicados desde 1928 hasta 1934 ¹ han sido hitos importantes en la historia de la bioquímica. De hecho, estos descubrimientos han contribuido a Szent-Györgyi siendo galardonado con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1937. La suite en constante expansión de los roles de ascorbato en la fisiología animal y vegetal, así como la salud humana, siguen siendo los temas de activo científica investigación y controversia.

L-ascorbato es una abundante reductor fisiológica y la enzima cofactor en sistemas de mamíferos, y contribuye a numerosas reacciones enzimáticas bien definidas que implican la hidroxilación del colágeno, carnitina y la biosíntesis de norepinefrina, metabolismo de la tirosina y de la hormona péptido amidación ^2. Curiosamente, evide montajena vez que sugiere que el ascorbato juega un papel en la estimulación de otras dioxigenasas dependientes de hierro, tales como las prolil hidroxilasas y asparaginilo implicados en la hidroxilación y la orientación de los factores inducibles por hipoxia (HIF) 1α y 2α ^3. Un informe reciente sugiere que el ascorbato juega un papel en la maduración de células T a través de desmetilación que afecta a la cromatina a través de su actividad en la estimulación de las hidroxilasas nucleares, Jumonji C (JmjC) dominio de las proteínas; el último de los cuales parecen requerir ascorbato para la plena actividad ^4. De hecho, la estimulación de tales enzimas por el ascorbato parece ocurrir por un mecanismo similar a la estimulación por el ascorbato de las hidroxilasas de HIF y de colágeno. Entre otros efectos clásicos, ascorbato contribuye significativamente a la antioxidación celular como una cadena-romper eliminador de radicales soluble en agua ⁵ y para el reciclaje de membrana plasmática α-tocoferol (vitamina E) a través de la reducción de la α-tocoferoxilo radical ^6, Which es importante en la protección contra la peroxidación lipídica de la membrana ^7. Es importante destacar que, aunque la mayoría de los mamíferos son capaces de la síntesis hepática de novo de ascorbato a partir de D-glucosa, primates superiores, conejillos de indias y algunos murciélagos dependen de fuentes dietéticas de la vitamina ^8. Esto es debido a la inactivación del gen GULO, los ortólogos de mamíferos que en no afectados codifican la enzima, γ-gulono-lactona oxidasa ^9-13. Esta enzima es necesaria para la reacción final en la biosíntesis de ascorbato a partir de glucosa ^13.

Después de la absorción mediada por transportador desde la luz intestinal en los seres humanos, ascorbato se distribuye por todo el cuerpo por el sistema circulatorio. La vitamina se encuentra típicamente en su forma reducida en concentraciones milimolares intracelularmente (con la notable excepción de los eritrocitos en la que las concentraciones son típicamente similar a la concentración de plasma que prevalece), y en HCl conc micromolarentrations (por ejemplo 50-200 micras) en la mayoría de los fluidos extracelulares ^14,15.

En condiciones fisiológicas, ascorbato típicamente se somete a una oxidación de un electrón reversibles a la libre radical ascorbilo (AFR; también conocido como monodehydroascorbate o semidehydroascorbate). Mientras que la AFR es un radical relativamente estable ^16, en ausencia de su rápida reducción enzimática de un electrón de nuevo a ascorbato, dos AFR pueden más dismutan a uno ascorbato y uno deshidroascorbato (DHA) ^9,13,17. En el interior de la célula, el producto de oxidación de dos electrones de ascorbato, el DHA, se puede reducir rápidamente de nuevo a ascorbato por el glutatión-y NAD (P) H-enzimática dependiente y reacciones no enzimáticas ^13.

Si bien se acepta que clásicamente único papel importante de ascorbato en el metabolismo del hierro es el de estimular la absorción dietética de hierro no hemo ^18, nosotros y otros han aportado pruebas de strongly lo que sugiere que el ascorbato juega un papel ampliado en gran medida en el metabolismo de este metal. En primer lugar, ascorbato que se libera por las células-ascorbato repleta parece jugar un papel importante en la modulación de la absorción de hierro no unido a transferrina por las células ^19,20, y la evidencia reciente indica que el ascorbato también modula la absorción de hierro unido a transferrina por las células ^21, el último de los cuales corresponde a una ruta principal de hierro-captación fisiológica ^22.

Ascorbato es esencial para la función normal del sistema nervioso central de los mamíferos ^23,24. Junto con la corteza suprarrenal, glándula pituitaria, el timo, la retina y el cuerpo lúteo, el cerebro contiene altas concentraciones de ascorbato en relación con otros tejidos del cuerpo ^23,25-27. Además, la exposición de ambos astrocitos ^28,29 y neuronas como las células ³⁰ al glutamato se sabe para accionar la liberación de ascorbato en el espacio extracelular, donde el ascorbate se cree que ayuda a proteger a las neuronas contra el glutamato inducida por la disfunción neuronal ^31. Aunque el mecanismo exacto de glutamato inducida por la liberación de ascorbato de astrocitos se desconoce, se ha proporcionado recientemente pruebas que indican la implicación de células inflamación causada por la captación de glutamato por el glutamato de los astrocitos y transportador de aspartato (GLAST, también conocida aminoácido excitador transportador isoforma 1 [EAAT1 ] en los seres humanos) y la consiguiente activación de osmolíticas y aniones canales sensibles al volumen (VSOACs) que son permeables a las pequeñas aniones orgánicos tales como ascorbato ^32. Las identidades moleculares de los conductos de membrana de plasma implicados en la formación VSOAC quedan aún por identificar ^33,34.

Aunque muchos ensayos se han desarrollado para la determinación de ascorbato en muestras biológicas, que incluyen ensayos espectrofotométricos, fluorométricos y cromatográficas ^35,36, existe mucha variabilidad en la especificidad, la sensibilidad, interference por contaminantes químicos, rango lineal efectiva y la estabilidad del analito punto final. Además, otros factores importantes que influyen en la elección de ensayo son la rapidez, la facilidad de uso y acceso a equipos relativamente especializada, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) aparato.

Aquí presentamos un ensayo simple y altamente específico de microplacas colorimétrico para la determinación de ascorbato intracelular en células cultivadas, así como un ensayo separado para la determinación de ascorbato-flujo de salida a partir de células cultivadas. El último ensayo tiene como objetivo evitar el problema de la subestimación de la liberación de ascorbato a partir de células debido a la rápida re-absorción de ascorbato liberado por los transportadores de ascorbato de sodio-dependiente (SVCTs). Aunque ambos métodos han aparecido en algunas de nuestras publicaciones anteriores ^{19,20,32,37,38,} este manuscrito proporciona un conjunto explícito de instrucciones y directrices para su ejecución efectiva.

Protocolo

1. Determinar ascorbato intracelular en células cultivadas

1. Cultivo de células y la cosecha
   1. Crecer de suspensión (por ejemplo, la eritroleucemia humana K562) o células adherentes (por ejemplo, los astrocitos primarios) utilizando procedimientos estándar de cultivo ^19-21,32,38. Nota: para garantizar las células contienen ascorbato, se cargan las células cultivadas con ascorbato, ya sea como ascorbato o DHA ^33,39.
2. Crear un extracto celular que contiene ascorbato-
   1. Incubar un número apropiado de solución salina tamponada con fosfato de suspensión (PBS), se lavó o células adherentes con 450 l de helado celular permeabilización Buffer [CPB; 0.1% (w / v) de saponina en PBS; 4 º C]. Nota: Determinar el número de células requeridas para obtener un valor de absorbancia en el intervalo lineal del ensayo (véase más adelante) empíricamente por el usuario final. Nota: Los extractos de tejidos también pueden utilizarse (véase la discusión para más detalles).
   2. Agitacélulas TE en hielo durante 10 minutos para asegurar la lisis celular completa.
   3. Crear un extracto intracelular que contiene ascorbato-aclarado mediante la eliminación de los desechos celulares por centrifugación del lisado crudo a 16.000 × g durante 5 min en una microcentrífuga refrigerada (4 º C).
   4. Retire cuidadosamente 4 x 100 ml de alícuotas de cada muestra y añadir a una secuencia horizontal de pozos en una placa de fondo plano de 96 pocillos que contiene ya sea 25 l / pocillo de PBS ("-AO") o sólo 25 l / pocillo de 45.5 U / ml solución madre de L-ascorbato-oxidasa (AO) en PBS ("+ AO"). Nota: esto debe hacerse en paralelo con la preparación de los estándares (ver más abajo).
3. Construcción estándar de la curva ascorbato (debe ser construido de nuevo para cada ensayo)
   1. Preparar una solución madre de 10 mM de ácido ascórbico en helado de PBS. Nota: Verifique la concentración de ascorbato por espectrofotometría utilizando una cubeta de cuarzo con un 1cm de longitud de vía a 265 nm (coeficiente de extinción = 14,5 mM ^-1 cm ^{-1) 40.}
   2. Prepare cuidadosamente una serie de normas de ascorbato de entre 0 y 20 mM.
   3. En paralelo con el paso 1.2.4, retirar con cuidado 4 × 100 ml de alícuotas de cada estándar y añadir a una secuencia horizontal de pozos en una placa de fondo plano de 96 pocillos que contiene 25 l / pocillo de PBS ("-AO") o un 45,5 U / ml solución madre de AO en PBS ("+ AO"). Nota: 100 l de los estándares de ascorbato anteriores contendrán 0-2 nmol de ascorbato. Tenga en cuenta, el objetivo de la AO es para el control de la contribución de reductores no-ascorbato a ferricianuro reducción.
4. Determinar ascorbato intracelular - Paso 1: eliminar selectivamente ascorbato y cuantitativamente oxidar ascorbato con ferricianuro
   1. Mezclar orbitalmente la placa de 96 pocillos a 550 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad, cubriendo la placa en papel de aluminio. Nota: Tsu paso debe oxidar todo ascorbato en los pozos "+ AO" a DHA. Los pozos "AO" no se verán afectados.
   2. Añadir 50 l de 3,5 mM ferricianuro de potasio (en lo sucesivo denominadas "ferricianuro") en PBS a todos los pocillos. La final [ferricianuro] = 1 mM. Nota: Utilice un multipipettor.
   3. Mezclar orbitalmente la placa a 550 rpm a temperatura ambiente durante otros 5 minutos en la oscuridad. Nota: Este paso debe resultar en la reducción de ferricianuro a ferrocianuro por el ascorbato en una relación estequiométrica de 2 moléculas de ferricianuro reducido por 1 molécula de ascorbato oxidado.
   4. Inmediatamente después, añadir 25 l de una solución recién construido que contiene 50% (v / v) de ácido acético y 30% (w / v) de ácido tricloroacético (TCA). Nota: Utilice un multipipettor.
5. Determinar ascorbato intracelular - Paso 2: cuantificar la cantidad de ferrocianuro formado ³⁷
   1. Añadir 100 l de solución de ferrocianuro de determinación ^{del 37} al eada bien. Nota: Una solución de trabajo debe hacerse inmediatamente antes de su uso: 2 ml de 3 M acetato sódico (pH 6,0); 0,5 ml de ácido acético glacial (~ 17,4 M de ácido acético); 2 ml de ácido cítrico 0,2 M; 2 ml de 3,3 mM _FeCl3 en ácido acético 0,1 M; 1 ml de 30 mM ferene-S. El volumen final de esta solución de trabajo debe ser 7,5 ml.
   2. Mezclar orbitalmente la placa en la oscuridad a 550 rpm durante 30 min a temperatura ambiente.
   3. Leer los valores de absorbancia de los pocillos a 593 nm (es decir, el máximo de absorbancia de la Fe (II) (Metodo-S) ₃ complejo).
   4. Calcular la cantidad de ascorbato intracelular como nmoles ascorbato por millón de células restando inicialmente los valores de A _{593 nm} para los pozos de la '+ AO' de los correspondientes - pozos 'AO' para cada muestra y luego la interpolación de la curva estándar ascorbato (véase el paso 1.3 ). Al construir la curva estándar, trazar este "valor de la diferencia" para cada estándar frente a la cantidad de ascorbcomió por pocillo.

2. Determinación de ascorbato-eflujo de células cultivadas

1. Cultivo de células y la cosecha
   1. Crecer suspensión o células adherentes que la anterior (véase el paso 1.1). Nota: llevar a cabo el ensayo a continuación en un formato de plataforma de 24 pocillos con la suspensión y las células adherentes para obtener mejores resultados.
   2. Volver a suspender las células en suspensión, o superponer las células adherentes, con 400 l de solución salina tamponada con HEPES precalentado, con o sin calcio y magnesio, y que contiene 5 mM de D-glucosa (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) en pozos de una placa de 24 pocillos. Añadir el mismo volumen de HBS / D para pozos sin células especificados en cada placa de 24 pocillos para ser examinados. Nota: este último servirá como controles libres de células para la reacción de la línea de base (ver más abajo).

3. Determinar la cantidad de ascorbato de lanzamiento

1. Las siguientes soluciones madre deben prepararse de antemano: 120U / ml en HBS AO / D (preparar fresco); 2,4 mM Ferene-S en HBS / D; 120 M de _FeCl3 y 600 mM Na-citrato en HBS / D (preparar inmediatamente de soluciones de reserva más concentradas).
2. Para iniciar la reacción ferrireduction (volumen final por pocillo debe ser de 600 l), añadir los siguientes volúmenes de los reactivos a los pocillos individuales que ya contienen 400 l de HBS / D:
   1. Añadir 50 l de AO (120 U / ml) o HBS / D para emparejado pozos por triplicado. La concentración final AO debe ser de 10 U / ml. Nota: Label emparejado pozos como "- AO" y "+ AO".
   2. Mezclar las placas con mezcla orbital suave durante 5 min a 37 ° C.
   3. Añadir 50 l de 2,4 mM de fereno-S a todos los pocillos. La concentración final ferene-S debe ser de 200 mM. Mezclar las placas como anteriormente durante 5 min a 37 ° C.
   4. Añadir 50 l de 120 mM recién preparada citrato férrico. El hierro final y concentraciones de citrato de hierro deben ser 10 mM y 50 mM citrato. Mezclar bien.
3. En tres pocillos de control por triplicado, aspirar el medio suprayacente y añadir 600 l de HBS / D que contiene 0,1% de saponina. Nota: Estos servirán como "100% de lisis celular" controles de lactato deshidrogenasa (LDH) ensayo de liberación que se realizará en paralelo (véase más adelante).
4. Incubar durante 60 min en la oscuridad a 37 ° C.
5. Al final del ensayo de ascorbato de flujo de salida, aspirar rápidamente 500 l de cada pocillo y añadir a etiquetado adecuadamente pozos en una placa de 24 pocillos. Nota: para células en suspensión, eliminar inicialmente las células por centrifugación a 4 ° C.
6. Añadir 300 ml de alícuotas del sobrenadante a una placa de 96 pocillos y luego leer a 593 nm.

4. Determinación de ascorbato extracelular

1. Lea los valores de absorbancia de los pocillos a 593 nm.
2. Calcular la cantidad de ascorbato extracelular como nmoles de ascorbato por mg de proteína (o por millón de células) como se describe para la determinación de ascorbato intracelularen el Paso 1.5.4. Nota: el usuario final debe optimizar las condiciones de modo que la liberación de ascorbato no está limitada por el ascorbato intracelular.

5. Determinación de la LDH de lanzamiento

1. Con los 200 l restantes de solución extracelular de cada muestra de llevar a cabo un ensayo de liberación de LDH ^32,41 para determinar el grado de lisis celular. Nota: el cálculo en% del total de LDH liberable. Determinar la LDH liberable de las muestras que se trataron con 0,1% de saponina.

Resultados

Determinación de ascorbato intracelular en las células cultivadas en suspensión

En el primer ensayo (Figura 1), ascorbato intracelular se determina, después de ascorbato-específica (es decir, AO-sensible) reducción de ferricianuro a ferrocianuro, utilizando la determinación altamente sensible de ferrocianuro por un procedimiento publicado previamente ^37. La detección de ascorbato se basa en la quelación colorimétrico de hierro ferroso que se genera por la re...

Discusión

En este trabajo se presentan dos ensayos de microplaca colorimétricos rápidos, concretos y relativamente sensibles para la determinación de ascorbato derivado de los compartimentos intra y extracelulares en las células cultivadas. Los ensayos pueden ser completados con el acceso a equipos de laboratorio estándar y los reactivos. El reactivo sólo moderadamente costosa requerida para el ensayo es AO, que es esencial, ya que imparte un alto grado de especificidad analito hacia L-ascorbato. Lo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de fondo plano Nunc de 96 pocillos	Thermo	269620	Se puede utilizar cualquier placa de fondo plano de 96 pocillos
Microcentrífuga de sobremesa refrigerada	Eppendorf	5415D	También se puede utilizar una microcentrífuga no refrigerada que se haya equilibrado a la temperatura en una cámara frigorífica
Centrífuga de sobremesa refrigerada	Eppendorf	5810R	Cubeta
oscilanteEspectrofotómetro de microplacas Bio-Rad Benchmark Plus	Bio-Rad		Se puede utilizar cualquier espectrofotómetro de microplacas capaz de leer a 593 nm y se recomienda. Si se utiliza un lector de placas basado en filtro, elija la longitud de onda más cercana posible y utilice el método de curva estándar.
Ependorf MixMate (mezclador orbital de microplacas)	Eppendorf		Se trata de un mezclador de microplacas muy versátil y fiable y funciona muy bien para estos ensayos
Tampones de
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4
Solución salina tamponada con MOPS (MBS); 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7,3
MBS + 5 mM D-glucosa (MBS/D)
Solución salina tamponada con HEPES + 5 mM de D-glucosa (HBS/D); 137 mM de NaCl, 5,2 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2• 2 H2O, 0,8 mM MgSO4&toro; 7 H2O, 5 mM de D-glucosa, 20 mM de HEPES-Na+, pH 7,3)
Tampón de permeabilización celular (CPB; 0,1% de saponina en PBS)
Productos químicos
Ácido L-ascórbico o L-ascorbato de sodio	Sigma-Aldrich		Se deben obtener preparaciones de máxima pureza
Dímero de ácido dehidro-L-ascórbico (DHA)	Sigma-Aldrich	30790	soluciones acuosas producen teóricamente 2 moles de monómero de DHA por mol de dímero de DHA
Citocalasina B	Sigma-Aldrich	C6762	Soluciones madre preparadas en DMSO o etanol
Ascorbato oxidasa (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Las soluciones madre (120 U/ml) pueden prepararse en PBS o MBS y luego congelarse en alícuotas
Ferricianuro de potasio (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihidrato
Ferene-S (3-(2-Piridil)-5,6-di(2-furil)-1,2,4-triazina-5′,5′ ′-sal disódica del ácido disulfónico)	Sigma-Aldrich	92940
L-glutamato de sodio	Sigma-Aldrich
Saponina	Sigma-Aldrich	47036	Prepare una solución madre al 0,1%
Soluciones madre para el ensayo
3 M acetato de sodio (pH 6,0)
Ácido
0,2 M Ácido
3,3 mM FeCl3 en 0,1 M Ácido
30 mM ferene-S
50% (v/v) de ácido acético + 30% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA)
Soluciones madre para ensayo
AO (120 U/ml)
2,4 mM ferene-S
0,12 mM FeCl3 en 0,6 mM de citrato