Nuestro laboratorio ha desarrollado hidrogeles de poliacrilamida de ADN-reticulada, un sistema dinámico de hidrogel, para entender mejor los efectos de la modulación de la rigidez del tejido en función de la célula. Aquí, ofrecemos esquemas, descripciones y protocolos para preparar estos hidrogeles.
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Artículo de método
Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles
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Resumen
Resumen
Mecanobiología es un área científica emergente que aborda el papel fundamental de las señales físicas en la dirección de la morfología y la función celular. Por ejemplo, el efecto de la elasticidad de los tejidos en función de la célula es un área importante de la investigación mecanobiología porque la rigidez del tejido modula con la enfermedad, el desarrollo, y las lesiones. Materiales estáticos que imitan tejidos o materiales que no pueden alterar la rigidez una vez que se siembran las células, se utilizan principalmente para investigar los efectos de la rigidez del tejido en las funciones celulares. Si bien la información obtenida de los estudios estáticos es valiosa, estos estudios no son indicativos de la naturaleza dinámica del microambiente celular in vivo. Para abordar mejor los efectos de la rigidez dinámica en función de la célula, se desarrolló un sistema de hidrogel de poliacrilamida ADN reticulado (geles de ADN). A diferencia de otros sustratos dinámicos, geles de ADN tienen la capacidad de aumentar o disminuir la rigidez después de la fabricación y sin estímulos. Geles de ADN consisten en ADN crossltintas que se polimerizan en un esqueleto de poliacrilamida. Adición y eliminación de enlaces cruzados a través de la entrega de ADN de cadena sencilla permite temporal, espacial y de control reversible de la elasticidad del gel. Hemos demostrado en los informes anteriores que la modulación dinámica de la elasticidad del gel del ADN influye en el comportamiento de fibroblastos y la neurona. En el presente informe y el vídeo, ofrecemos un esquema que describe los mecanismos de reticulación de gel de ADN y las instrucciones paso a paso sobre los geles de ADN preparación.
Introducción
Sustratos estáticos y dinámicos son dos categorías de biomateriales que se desarrollaron para estudiar los efectos de la elasticidad de los tejidos o rigidez en la función celular. Sustratos estáticas son incapaces de cambiar sus propiedades físicas después de que se fabrican y / o una vez se siembran las células. Poliacrilamida (PA) geles fueron los primeros sustratos bidimensionales estáticas, que se sintetizaron las investigaciones mecanobiología 5,17. Geles de PA son fáciles de preparar, de bajo costo, versátil, y puede ser fabricado con una amplia gama de módulos elásticos. Aunque estas ventajas técnicas hacen PA geles un sustrato general aplicada, su....
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Protocolo
NOTA: Todo el protocolo de preparación de gel para el procesamiento de células tarda un mínimo de seis días. Tiempo estimado para la preparación del gel es de 8 horas, más un / incubación O N. Tiempo estimado para la inmovilización de gel e hibridación de ADN es de 8 horas, más una etapa O / N enjuague. Tiempo estimado para funcionalización gel es de 2 horas. Tiempo para la siembra y el crecimiento celular depende del tipo de cultivo y la aplicación, pero se requiere un mínimo de cuatro días.
1 Preparación de geles de ADN
NOTA: Preparar los geles de ADN en tres etapas distintas. En primer lugar, polimerizar indi....
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Resultados
Antes de nuestros estudios, se observaron las interacciones célula-ECM en biomateriales compatibles estáticas o en sustratos dinámicos irreversibles y unidireccionales. Estos sustratos no reflejan con exactitud la naturaleza dinámica del microambiente celular. Nuestro trabajo cambia los paradigmas técnicos existentes al proporcionar un modelo más fisiológico para el estudio de las interacciones célula-ECM de ablandamiento y endurecimiento biomateriales dinámicos. En estudios anteriores, se analizaron los efectos de sust.......
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Discusión
La capacidad de los geles de ADN para suavizar o endurecer antes y después de la adhesión celular las hace un modelo ideal para estudiar el papel de la rigidez del tejido dinámico en función de la célula. Todos los tres diseños se han utilizado en estudios mecánicos y biológicos. Sin embargo, los tres diseños tienen elasticidades similares en diversos porcentajes de reticulación, lo que indica la longitud de reticulación no influye elasticidad del gel de ADN (Tabla 2). En contraste, la concentración de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, el Dr. Bernard Yurke y el Dr. Uday Chippada por sus contribuciones en el desarrollo de la tecnología de gel de ADN; Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter por sus comentarios y ediciones de este manuscrito; fuentes de financiación, incluida la Comisión de Nueva Jersey en la médula espinal de Investigación (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) y Nueva Jersey Instituto de Neurociencias (MLP); y editores de Ingeniería de Tejidos, Parte A para la autorización de reimprimir las figuras 2 y 4 y Biomateriales permiso para reimprimir la ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ssDNA | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com | No vórtice ssDNA. Invierta suavemente el vial y/o la solución de pipeta para mezclar. | |
| PBS con calcio y magnesio | de cualquier marca. | ||
| 100x Tampón Tris-EDTA (tampón TE | )Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com | T9285 | |
| 10x Tampón Tris-Borato-EDTA (tampón TBE) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | 93290 | TBE es una toxina reproductiva. |
| Solución de acrilamida al 40% | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | BP14021 | La acrilamida es una toxina. |
| Persulfato de amonio (APS) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | A3678 | Prepare una solución al 2% en tampón TE. El APS es una toxina e irritante. |
| Tetrametiletilendiamina (TEMED) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | T9281 | Prepare una solución al 20% en tampón TE. TEMED es inflamable, corrosivo y tóxico. |
| Cubertor redondo de 12 mm de diámetro | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com | 12-545-82 | |
| Norland adhesivo óptico 72 | Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com | NOA72 | |
| Placa | Cualquier marca. | ||
| microcentrífuga | de cualquier marca. | ||
| Sulfo-SANPAH | ProteoChem o Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com o thermofisher.com | C111 o 22589 | Prepare una solución de 0,315 mg/ml en agua inmediatamente antes de usar. Disolver a 37 ° C y filtro de esterilización. Es normal observar sulfo-SANPAH no disuelto en el filtro. Sulfo-SANPAH es sensible a la luz y, por lo tanto, la solución debe protegerse de la luz hasta la exposición a los rayos UV. |
| Poly-D-Lisina (PDL) | Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) | P6407 | Prepare una solución de 0,2 mg/ml en agua y filtre la esterilización. |
| Colágeno Tipo I | Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com | 13813 | Prepare una solución de 0,2 mg/ml en ácido acético 0,2 N. La solución debe permanecer fría en todo momento para evitar la polimerización. El ácido acético es inflamable, tóxico y corrosivo. |
| 22 x 60 cubreobjetos | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 12-544-G | |
| Pipeta de desplazamiento positivo | Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com | F148504 | |
| Bloque de calor | Fisher Scientific (Pittsburg, PA) | 11-718 | |
| Fuente | Coloque los geles lo más cerca posible de la luz UV. La luz ultravioleta puede causar lesiones en la piel o los ojos. | ||
| Termómetro: | Cualquier marca. | ||
| Gas nitrógeno | GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/ | NI 5.0UH-R |
Referencias
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
- Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A.
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Hidrogeles reticulados con ADNPreparaci n de geles de poliacrilamidaReticulaci n de geles con ADNEntrega de ADN monocatenarioModulaci n de la elasticidad del gelSustratos de cultivo celularInvestigaci n en mecanobiolog aControl din mico de la rigidezComportamiento de fibroblastos y neuronasInmovilizaci n mediante pegamento ptico
