La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

Summary

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

Abstract

Electroforesis en gel bidimensional (2DE) es una poderosa herramienta para descubrir modificaciones proteoma potencialmente relacionados con diferentes condiciones fisiológicas o patológicas. Básicamente, esta técnica se basa en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico en un primer paso, y en segundo lugar, de acuerdo con sus pesos moleculares por SDS electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). En este informe se describe un protocolo de preparación de muestras optimizado para poca cantidad de tejido post-mortem y el cerebro del ratón humano. Este método permite realizar tanto la electroforesis bidimensional diferencia de fluorescencia de gel (2D-DIGE) y mini inmunotransferencia 2DE. La combinación de estos enfoques le permite a uno no sólo encontrar nuevas proteínas y / o modificaciones de las proteínas en su expresión gracias a su compatibilidad con detección por espectrometría de masas, sino también una nueva visión de la validación de marcadores. Así, mini-2DE acoplado a los permisos de transferencia Western para identificar y validar mensaje-Translacional modificaciones, proteínas catabolismo y proporciona una comparación cualitativa entre diferentes condiciones y / o tratamientos. En este documento, se proporciona un método para estudiar los componentes de los agregados de proteínas que se encuentran en la EA y la demencia con cuerpos de Lewy, tales como el péptido beta-amiloide y de la alfa-sinucleína. Nuestro método de este modo puede ser adaptado para el análisis del proteoma y las proteínas insolubles extraer a partir de modelos de tejido cerebral y ratones humanos también. En paralelo, puede proporcionar información útil para el estudio de las vías moleculares y celulares implicados en enfermedades neurodegenerativas, así como potenciales biomarcadores y dianas terapéuticas.

Introduction

Los trastornos mentales y neurológicos representan el 13% de la carga mundial de la enfermedad, los nuevos desafíos como los mecanismos fisiopatológicos, factores de riesgo y biomarcadores prodrómicos deben explorarse ^1. En línea con este objetivo, la proteómica estudios del cerebro humano se convierten en indispensables para destapar las vías moleculares implicadas en procesos como la memoria, el comportamiento, las emociones y la plasticidad neuronal, por ejemplo, no sólo para fisiológica, sino también para las condiciones patológicas. Por lo tanto, el uso de modelos animales y, más específicamente los ratones transgénicos, aporta una amplia gama de posi....

Protocol

1. La homogeneización y extracción total de proteínas de tejido cerebral humano y ratón

1. Homogeneización del tejido cerebral. Homogeneizar el tejido cerebral 10% (w / v) en 8 M de urea, 2 M tiourea y 1% w / v de tampón de SDS (UTS) utilizando un Potter de vidrio (para muestras de humanos) o Teflón homogeneizador (para muestras de ratones). Someter a ultrasonidos a 60 Hz 30 pulsos con un generador de aplicación de ultrasonidos 0,5 seg para la desintegración total de tejido ^{13, 14.}
   1. Determinar la concentración de proteínas con el ensayo de Bradford, utilizando BSA como estándar. Este UTS extracción tampón es totalmente compatible con una di....

Results

Proteómica en el tejido cerebral sigue siendo un reto ya que no existe tampón ideal para recuperar el 100% de las proteínas, especialmente asociada a la membrana o proteínas del citoesqueleto. La primera serie de experimentos se centraron en la búsqueda de un tampón de lisis adecuado compatible con los dos enfoques y que permite recuperar un gran panel de proteínas. Por lo tanto, tres tampones de lisis se ensayaron para determinar la más adecuada. En primer lugar, se utilizó el tampón bioquímicas y de biología molecular.......

Discussion

El descubrimiento de los cambios de expresión de proteínas patológicas, la búsqueda de biomarcadores y la modulación de las posibles vías de dianas farmacológicas se encuentran entre los objetivos de los enfoques neuroproteomics ^30. En medio de las herramientas emergentes, el campo 2DE agrega una expectativa prometedora. Sin embargo, un consenso se debería alcanzar con el fin de minimizar la variabilidad y aumentar la reproducibilidad en los experimentos. En la línea de esta idea de un protocolo estandarizado.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Referencia en función del intervalo/tamaño de pH
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Referencia en función del intervalo de pH deseado
AMBERLITE IRN-150L RESINA DE LECHO MIXTO 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92 Caja de	plástico para hacer la rehidratación pasiva
Filtro MILLEX GS	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Geles prefabricados 13,3 x 8,7 cm (ancho x largo)	Bio-Rad		Referencia en función del MW para separar la
unidad de enfoque isoeléctrico IPGphor III	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Sistema de electroforesis grande	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 mm	Empresa de gel	P2D1.5