Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.
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Artículo de método
La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting
En este artículo
Resumen
Resumen
Electroforesis en gel bidimensional (2DE) es una poderosa herramienta para descubrir modificaciones proteoma potencialmente relacionados con diferentes condiciones fisiológicas o patológicas. Básicamente, esta técnica se basa en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico en un primer paso, y en segundo lugar, de acuerdo con sus pesos moleculares por SDS electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). En este informe se describe un protocolo de preparación de muestras optimizado para poca cantidad de tejido post-mortem y el cerebro del ratón humano. Este método permite realizar tanto la electroforesis bidimensional diferencia de fluorescencia de gel (2D-DIGE) y mini inmunotransferencia 2DE. La combinación de estos enfoques le permite a uno no sólo encontrar nuevas proteínas y / o modificaciones de las proteínas en su expresión gracias a su compatibilidad con detección por espectrometría de masas, sino también una nueva visión de la validación de marcadores. Así, mini-2DE acoplado a los permisos de transferencia Western para identificar y validar mensaje-Translacional modificaciones, proteínas catabolismo y proporciona una comparación cualitativa entre diferentes condiciones y / o tratamientos. En este documento, se proporciona un método para estudiar los componentes de los agregados de proteínas que se encuentran en la EA y la demencia con cuerpos de Lewy, tales como el péptido beta-amiloide y de la alfa-sinucleína. Nuestro método de este modo puede ser adaptado para el análisis del proteoma y las proteínas insolubles extraer a partir de modelos de tejido cerebral y ratones humanos también. En paralelo, puede proporcionar información útil para el estudio de las vías moleculares y celulares implicados en enfermedades neurodegenerativas, así como potenciales biomarcadores y dianas terapéuticas.
Introducción
Los trastornos mentales y neurológicos representan el 13% de la carga mundial de la enfermedad, los nuevos desafíos como los mecanismos fisiopatológicos, factores de riesgo y biomarcadores prodrómicos deben explorarse 1. En línea con este objetivo, la proteómica estudios del cerebro humano se convierten en indispensables para destapar las vías moleculares implicadas en procesos como la memoria, el comportamiento, las emociones y la plasticidad neuronal, por ejemplo, no sólo para fisiológica, sino también para las condiciones patológicas. Por lo tanto, el uso de modelos animales y, más específicamente los ratones transgénicos, aporta una amplia gama de posibilidades para imitar la etiología de los trastornos neurodegenerativos humanos 2.
Proteómica enfoques son hoy en día disponibles con el fin de llevar a cabo estas nuevas perspectivas en el campo de la neurociencia. Electroforesis en gel bidimensional (2DE) es un método simple y potente probable que permite comparar el proteoma de una amplia gama de muestras. Por otra parte, también es unpoderoso método para aislar una proteína de una mezcla compleja con el fin de identificar y analizar adicionalmente por espectrometría de masas. Esta técnica consiste esencialmente en dos etapas sucesivas: 1) de separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico (pI) por isoelectroenfoque (IEF). Más precisamente, un potencial eléctrico se aplica a través de las tiras de acrilamida inmobilina entre un gradiente de pH y luego proteínas migrará y se centran en un determinado pI en función de su carga neta global. 2) proteínas isoeléctricamente se centraron se desnaturalizan y cargados negativamente por la adición de dodecil sulfato de sodio (SDS), con lo que las proteínas en su primera estructura se separan en función de su peso molecular aparente (MW) por SDS-PAGE 3. Estas dos propiedades distintas nos permiten abordar un doble valor para ir más lejos en el estudio del proteoma. Por una parte este enfoque ofrece la posibilidad de realizar un análisis cuantitativo usando colorantes mínimos método 2D-DIGE, y por otro lado un CUALITATIVOanálisis e por mini-2DE acoplado a Western Blot.
El análisis cuantitativo por 2D-DIGE confiere expresión de la proteína cambia en todo el proteoma de la muestra. Brevemente, las muestras se etiquetan con tres cianinas (Cy2, Cy3 y Cy5) que emiten a tres longitudes de onda distintas (azul, verde y rojo). Estos colorantes mínimas de flúor que contienen grupo éster de succinimidil-N-hidroxi reaccionan con el grupo ε-amino de lisinas residuos de proteínas resultantes en enlaces amida covalentes 4. Residuos de lisina están etiquetados sólo entre el 1-3% y evitando así múltiples etiquetas además por la proteína y de las principales modificaciones de carga neta de 5, 6. Cy3 y Cy5 se utilizan a menudo para etiquetar dos muestras independientes mientras Cy2 Etiquetas Una mezcla de partes iguales de las muestras para comparar. Las dos ventajas principales son que todas las muestras marcadas se mezclan y IEF y SDS-PAGE se llevan a cabo en un gel de una sola vez para cada paso, evitando la variabilidad entre los experimentos debido a geles comparación. Por otra parte, presenta un umbral de detección máximo de alrededor de 1 femtomol de proteína 7. Los geles se escanearon y el software 2D compara las imágenes de fluorescencia de gel 2D, donde Cy2 sirve como un estándar interno que permite la identificación de las diferencias estadísticas entre los puntos para su posterior identificación por espectrometría de masas. El software de análisis de 2D utilizando el patrón interno logra una detección rápida de menos de 10% de las diferencias entre las muestras con más de 95% de confianza estadística 8.
Análisis cualitativo de mini-2DE es un paso crucial para la caracterización de proteínas. El principio es el mismo que el descrito anteriormente para el PI y la separación MW, pero en este caso las proteínas se transfieren a partir de un gel de poliacrilamida a una membrana pequeña y la inmunotransferencia se realiza después. Mientras que una electroforesis en gel de dimensión proporciona los cambios en la expresión de la proteína para uno o varios epítopos de la proteína en función del anticuerpo, la Informaciónn de mini-2DE dota con dos parámetros adicionales. En primer lugar, los isovariants proteínas cambian en función del pI, lo que indica que las modificaciones posteriores a la traducción pueden tener lugar. En segundo lugar, la identificación de la espectrometría de masas puede ser indicativo de zimógenos plausibles y productos catabólicos de proteínas. Por lo tanto, las modificaciones observadas por 2D-DIGE es probable indicativa de los mecanismos de cambios en el perfil global de proteoma subyacentes. Alineaciones de inmunoblots entre varias muestras para el mismo epítopo de proteína / s por el mini-2DE pueden reflejar los cambios de acidez Arrojando luz sobre las variaciones posteriores a la traducción un poco observados o ni siquiera por inmunotransferencia monodimensional 9, 10. Por otra parte, este análisis informa acerca de los sitios de escisión potenciales debido al conocimiento de la pI y MW de los residuos metabólicos 11,12.
La combinación de estas dos técnicas proporciona un análisis de proteómica complementaria. Por un lado 2D-DIGE permite un tipE de diferencias que permiten un aislamiento precisa de polipéptidos cuya expresión es diferente. Estas diferencias consisten esencialmente en la aparición o desaparición de un lugar o de aumento / disminución de la intensidad de un uno determinado por el análisis de software de los geles fluorescentes. Sin embargo, estas observaciones por sí mismos son poco probable para explicar la naturaleza de la modificación observada. Por estas razones, una vez que el polipéptido se aísla y se identificó por espectrometría de masas, el uso de mini-2DE permite confirmar precisamente 1) la identidad de la proteína aislada y 2) la naturaleza de la diferencia: el cambio en el nivel de isovariant / isoforma de de expresión, las modificaciones post-traduccionales y procesos de escisión por ejemplo. Sin embargo, es necesario desarrollar un tampón de lisis a partir tanto compatible con 2D-DIGE y con mini-2DE con el fin de limitar las dispersiones potenciales resultantes de la utilización de protocolos de extracción que son muy diferentes.
En el presente artículo, nos dèse describe un protocolo adaptado para la preparación, la extracción y el rendimiento de técnicas de mini-2DE de las proteínas cerebrales procedentes de tejido humano y de ratón 2D-DIGE y.
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Protocolo
1. La homogeneización y extracción total de proteínas de tejido cerebral humano y ratón
- Homogeneización del tejido cerebral. Homogeneizar el tejido cerebral 10% (w / v) en 8 M de urea, 2 M tiourea y 1% w / v de tampón de SDS (UTS) utilizando un Potter de vidrio (para muestras de humanos) o Teflón homogeneizador (para muestras de ratones). Someter a ultrasonidos a 60 Hz 30 pulsos con un generador de aplicación de ultrasonidos 0,5 seg para la desintegración total de tejido 13, 14.
- Determinar la concentración de proteínas con el ensayo de Bradford, utilizando BSA como estándar. Este UTS extracción tampón es totalmente compatible con una dimensión de SDS-PAGE, siempre y cuando los lisados no son sobre-calentado para evitar carbamilación 15.
- Añadir 1% (w / v) de Amberlite e incubar con un mezclado suave durante 10 min a temperatura ambiente. A partir de entonces filtrar a 0,22 micras filtros de jeringa y finalmente añadir el SDS a la solución urea / tiourea. Este paso reduce la cantidad de ácido úrico y ácido isociánico, que están en equilibrIUM con urea en solución y facilitar su degradación.
- Cloroformo / metanol proteína precipitación. Precipitar entre 100-150 g de proteína por 11 cm tiras IPG y 1-1,5 mg por 18 cm queridos (independientemente del rango de pH seleccionado para realizar el IEF).
- Realice todos los pasos en el hielo o en el 4 ° C. Enfriar cloroformo y metanol a 4 ° C durante 30 min antes de iniciar el procedimiento de precipitación.
- Agregue tres volúmenes de metanol y un volumen de cloroformo a un volumen de UTS lisado. Agite manualmente la mezcla y añadir tres volúmenes de agua fría. Vórtice durante 1 min y sedimentar las proteínas mediante centrifugación a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C.
- Desechar el sobrenadante con una pipeta Pasteur y añadir tres volúmenes de MeOH frío. Vortex de nuevo y se centrifuga a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Finalmente desechar el sobrenadante y secar el pellet en N2.
- Preparación de proteínas para el análisis 2D.Resuspender el precipitado de proteína secada en 2D-tampón (8 M de urea, 2 M tiourea suplementado con 4% de CHAPS). Lavar la solución con Amberlite como se indica más arriba y tratar de mantener la proporción de 500 g de proteína por cada 200 l de tampón 2D para 2D-DIGE. Nota: tampón 2D se puede almacenar a -80 ° C o se mantiene a 4 ° C durante una semana (para evitar la degradación de la urea).
- Someter a ultrasonidos y almacenar las muestras a -80 ° C hasta realizar el siguiente paso. Digno de mención, este protocolo se puede utilizar después de la solubilización de ácido fórmico de proteína agregados 10. En pocas palabras, se evapora el ácido fórmico en N2 y resuspender el precipitado según lo descrito.
2. 2D-DIGE
- Las muestras de prueba de calidad. Muestras dosis otra vez, utilizando el método de Bradford. Diluir 15 g de proteínas en tampón de muestra LDS, de calor a 37 ° C 15 y cargar en 4-12% de geles de poliacrilamida.
- Tinción de Coomassie. Tinción en gel de poliacrilamida con 0,1% (w / v) de CoomassieAzul G-250, 50% de EtOH y 10% de solución de ácido (v / v) acético durante al menos 1 h. Deje fondo destain durante la noche en 7% de ácido acético y 10% (v / v) solución de etanol.
- Etiquetado Pre-electroforética de muestras. Antes de realizar el etiquetado colorante de cianina, verificar el pH de la muestra, que debe ser básico o neutro, incluso desde la sustitución de N-hidroxisuccinimida es más eficiente a pH básico y dado que es óptima a un pH de 8,6.
- Etiquetar mínimamente las dos muestras de estudio con tintes fluorescentes Cy3 o Cy5 con una proporción de 50 mg protein/400 tinte pmol y mantener durante 1 hora a 4 ° C en la oscuridad para facilitar el grupo éster reactivo NHS de los cianinas con la amina protonada grupos de lisinas.
- Reducir las variaciones de la muestra que hacen un etiquetado cruz con Cy3 y Cy5 tintes, evitando un acoplamiento preferencial de una muestra a una cyanine particular. Tenga en cuenta que el etiquetado mínima de cianina-colorante se puede adaptar para la pequeña cantidad de proteínas con el mantenimiento de la proporción de 1 g PROtein por 8 pmol cianina-dye. Si es así, el sistema de mini-2DE se puede utilizar en lugar de la gran sistema de gel 2D. Esto permitirá el análisis 2D-DIGE para una pequeña cantidad de tejido cerebral.
- Etiquetar una piscina de ambas muestras con la misma cantidad de proteína (50 g en total) con colorante fluorescente Cy2 y usado como patrón interno. Utilice las mismas condiciones como se indica anteriormente.
- Completa hasta un volumen total de 350 l con tampón 2D que contiene 1,1% de reactivo Destreak, 1,2% de tampón IPG y trazas de azul de bromofenol total 150 g de proteínas marcadas (50 g de Cy2, 50 g de Cy3 y 50 g de Cy2). Realice este paso en cuatro ejemplares con cuatro tiras independientes. Por otra parte, preparar dos tiras adicionales no etiquetados (uno para cada muestra) con 350-450 g de proteína para los geles preparativos.
- Deje las seis tiras cargadas cubiertas con aceite mineral durante la noche para la rehidratación pasiva.
- Isoelectroenfoque. Llevar a cabo el IEF a 206; C. Para un pH de 3 11NL, 18 cm tira el protocolo es: valor máximo de corriente es de 50 mA / banda durante 8 etapas: 1) 150 V paso durante 1 hora, 2) 200 V paso durante 5 horas, 3) 500 V gradiente de 2 horas, 4) gradiente de 1000 V durante 2 horas, 5) 2000 V gradiente durante 2 horas, 6) 4000 V gradiente durante 2 horas, 7) 8000 V gradiente durante 2 horas y 8) para un total de 24 000 V · paso hr . Después de la IEF, enviar el exceso de aceite mineral utilizando papel de cromatografía y almacenar las tiras a -20 ° C hasta que la segunda dimensión.
- IPG tiras de equilibrio. Equilibrar tiras en 6 M de urea, 2% de SDS, 30% de glicerol, 50 mM de Tris-HCl pH 8,6 tampón con 1% de la TDT durante 15 min y después con 4,7% de yodoacetamida en el mismo tampón pero sin TDT.
- Segunda dimensión o electroforesis SDS-PAGE. Hacer los seis 12% en geles de SDS-PAGE (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% de acrilamida / bisacrilamida, 0,1% (w / v) de SDS, 0,072% (w / v) de APS y 0,1% (v / v) de TEMED ) al mismo tiempo utilizando un gran sistema de 2D, con cuatro placas de vidrio de baja fluorescencia para la STRIps con muestras de fluorescencia y otras dos placas de vidrio con 1,5 mm de espesor para geles de preparación con el fin de extirpar las manchas de proteínas.
- Cargar las seis tiras de IPG en la parte superior de los geles y otra en capas con 0,5% (w / v) de agarosa. Tampón de migración se compone de 25 mM de Tris, glicina 192 mM y 0,1% (w / v) de SDS. Llevar a cabo la migración a 2,5 W / gel durante la noche con un sistema de refrigeración ajustado a 4 ° C 16,17.
- Las imágenes de fluorescencia de adquisición y análisis. Utilice un escáner Typhoon 9400 para obtener las imágenes de fluorescencia de geles (12 imágenes en cada experimento). Scan Cy2, Cy3 y Cy5 imágenes para cada gel a 488/520 nm, 532/580 nm y 630/670 nm de excitación / emisión de longitudes de onda, respectivamente. Utilice el software informático para analizar las imágenes. Los datos son representativos de los cambios de volumen asociados con el punto de distribución de la señal a través de los cuatro geles entre las dos muestras estudiadas.
- Tinción de Coomassie para grandes geles. Fijar los geles preparativos de 50% (v / v) EtOH y 3% de solución de ácido (v / v) ortofosfórico durante al menos 24 horas. Luego, después, se lava dos veces con agua ultra pura durante 20 min. Realizar la coloración en 34% (v / v) de MeOH, 17% (w / v) de sulfato de amonio y ácido ortofosfórico 2% durante 1 hora antes de la adición de 0,1% (w / v) de azul de Coomassie G-250. Mantenga los geles en la coloración por lo menos durante 48 horas y se decolora con agua ultra pura.
- Spots para la identificación MS. Una vez que se analizan las imágenes de fluorescencia, el software proporciona una lista de los puntos cuya expresión es estadísticamente diferente. Escindir manualmente estas manchas de los geles preparativos. Este procedimiento requiere práctica y algo de destreza manual con el fin de evitar la contaminación de la queratina. A continuación, las muestras se pueden mantener en agua a -20 ° C hasta el envío a la EM. Identificación Spot es perfectamente compatible con la espectrometría de masas en tándem (MS / MS) y la relevancia de las identidades de proteínas es juzgado de acuerdo a la puntuación Mowse basada calculado con un valor de p de 0,05 (p <0,05) 18 probabilidad.
3. Ensayo de mini-2DE cualitativa
- Resuspender máximo 100 g de muestra de proteína en tampón 2D hasta un volumen final de 200 l para una tira de IPG de 11 cm. En caso de sistema de sobreexpresión o la proteína purificada, el importe de partida se puede bajar a 20 g.
- Añadir 1,1% (v / v) Destreak Reactivo, 0,55% (v / v) de tampón de IPG y trazas de azul de bromofenol a un volumen final de 200 l. Entonces, vórtice, hacer un giro rápido y cargar en una tira IPG para la rehidratación pasiva (para llevar la banda a su espesor original) durante la noche cubierto con aceite mineral. Nota: la proporción de tampón de IPG es el mismo para todo el intervalo de pH deseado (pH 3-11, 4-7, 7-11, etc), pero su composición varía en función de la gama de pH seleccionado.
- Isoelectrofocalisation. Realice IEF a 20 ° C. La duración del programa depende del intervalo de pH seleccionado. Digno de mención, parámetros como electroendosmosis pueden perturbar el perfil de IEF y en estos casos,se requiere la optimización en tiempo electrofocalisation 19. Nota: no es necesariamente un IEF ya que proporciona mejores resultados, pero la reducción del tiempo de IEF también puede mejorar la resolución. Después de la IEF, las tiras de IPG se pueden almacenar a -20 ° C durante meses.
- IPG tiras de equilibrado. Equilibrar las tiras en un tampón que contiene 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8, DTT 20 mM, 10% de glicerol, 5% de SDS, 0,05% de azul de bromofenol. Haga tres equilibración baña durante 15 minutos con el cambio de la solución tampón entre cada baño.
- SDS-PAGE. Capa de la tira IPG en un gel prefabricado (IPG 1 bien, tira IPG 11 cm) con un porcentaje de poliacrilamida elegido en función de la PM de la proteína de interés. A continuación, secar el gel sobre una membrana de nitrocelulosa / PVDF a 100 mV durante 33 min.
- Incubar toda la noche con el anticuerpo requerido y visualizar por la actividad peroxidasa. Realice las alineaciones de inmunoblots usando polipéptidos no relacionados revelados por el anticuerpo secundario. Llegar a un semi-quantitAtive análisis por densitometría del volumen y la intensidad de los trazos / puntos con el software ImageJ.
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Resultados
Proteómica en el tejido cerebral sigue siendo un reto ya que no existe tampón ideal para recuperar el 100% de las proteínas, especialmente asociada a la membrana o proteínas del citoesqueleto. La primera serie de experimentos se centraron en la búsqueda de un tampón de lisis adecuado compatible con los dos enfoques y que permite recuperar un gran panel de proteínas. Por lo tanto, tres tampones de lisis se ensayaron para determinar la más adecuada. En primer lugar, se utilizó el tampón bioquímicas y de biología molecular...
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Discusión
El descubrimiento de los cambios de expresión de proteínas patológicas, la búsqueda de biomarcadores y la modulación de las posibles vías de dianas farmacológicas se encuentran entre los objetivos de los enfoques neuroproteomics 30. En medio de las herramientas emergentes, el campo 2DE agrega una expectativa prometedora. Sin embargo, un consenso se debería alcanzar con el fin de minimizar la variabilidad y aumentar la reproducibilidad en los experimentos. En la línea de esta idea de un protocolo estandarizado...
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Divulgaciones
Los autores tienen ningún conflicto de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el INSERM, Universidad de Lille 2, MEDIALZ, Labex (laboratorio de excelencia, programa de inversión para el futuro) y DISTALZ (desarrollo de estrategias innovadoras para un enfoque transdisciplinario para la enfermedad de Alzheimer). FJ.FG es actualmente una comunidad receptora de la ANR (Agencia Nacional de Investigación Francés / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), pero este trabajo también estaba bajo el apoyo de una subvención de la JCCM (España).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | Referencia en función del intervalo/tamaño de pH | |
| IPG Buffer, pH X-X | GE Healtcare | Referencia en función del intervalo de pH deseado | |
| AMBERLITE IRN-150L RESINA DE LECHO MIXTO 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| KIT BOX IPG 1 * 1 KIT | GE Healtcare | 28-9334-92 Caja de | plástico para hacer la rehidratación pasiva |
| Filtro MILLEX GS | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT Geles prefabricados 13,3 x 8,7 cm (ancho x largo) | Bio-Rad | Referencia en función del MW para separar la | |
| unidad de enfoque isoeléctrico IPGphor III | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix Sistema de electroforesis grande | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D Gel SpotPicker 1,5 mm | Empresa de gel | P2D1.5 |
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