Aquí se describe un protocolo utilizando el navegante mutagénesis-mini Himar1 transposón mediada para generar una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad de la pantalla, aislar e identificar nuevos reguladores de alginato en el prototípico cepa PAO1 Pseudomonas aeruginosa.
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Artículo de método
Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en
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Resumen
Resumen
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa, del medio ambiente con capacidades metabólicas versátiles. P. aeruginosa es una bacteria patógena oportunista que produce infecciones pulmonares crónicas en pacientes con fibrosis quística (FQ). La sobreproducción de un polisacárido capsular llamado alginato, también conocido como mucoidy, promueve la formación de biopelículas mucoides que son más resistentes que las células planctónicas a la quimioterapia antibiótico y las defensas del huésped. Además, la conversión de la nonmucoid a fenotipo mucoide es un marcador clínico para el inicio de la infección crónica en la FQ. Sobreproducción de alginato por P. aeruginosa es un proceso que en gran medida endergónica impuestos sobre la energía celular. Por lo tanto, la producción de alginato está muy regulada en P. aeruginosa. Para entender mejor la regulación de alginato, se describe un protocolo usando el transposón de mutagénesis de mini-Himar1 para la identificación de nuevos regulador de alginatos en una cepa PAO1 prototípico. El procedimiento consta de dos pasos básicos. En primer lugar, hemos transferido el transposón mini-Himar1 (PFA) del huésped E. coli SM10/λpir en receptor P. aeruginosa PAO1 a través de la conjugación biparental para crear una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad, los cuales fueron seleccionados en placas de agar de Pseudomonas aislamiento suplementado con gentamicina. En segundo lugar, hemos examinado y aislaron las colonias mucoides para asignar el lugar de la inserción a través de PCR inversa usando cebadores de ADN que apuntan hacia el exterior desde el casete de gentamicina y la secuenciación del ADN. El uso de este protocolo, se han identificado dos nuevos reguladores de alginato, Muce (PA4033) y kinB (PA5484), en PAO1 cepa con una de tipo salvaje mucA codifica el factor anti-sigma MUCA para el maestro de alginato regulador AlgU (ALGT, σ 22) . Este protocolo de mutagénesis de alto rendimiento puede ser modificado para la identificación de otros genes relacionados con la virulencia que causa el cambio en Colomorfología ny.
Introducción
La capacidad de la oportunista, patógenos Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa para sobreproducir alginato es un factor importante en su capacidad para establecer un biofilm. La sobreproducción de alginato es un fenotipo a menudo referido como mucoidy. El aislamiento de colonias mucosas de los esputos de los individuos que sufren de fibrosis quística (FQ) es indicativo de una infección crónica y se asocia directamente con una disminución general de la salud del paciente 1. En la actualidad, se entiende que la regulación y la producción de alginato en P. aeruginosa se produce principalmente en dos operones. El primero es el operón biosintético de alginato, que contiene 12 genes (algD - Alg8 - Alg44 - algK - Alge - AlgG - Algx - algL - Algi - algJ - algF - alga) que son responsables de la síntesis y la exportación del polímero de alginato través el periplasma para el med extracelularnt 2-5. El segundo operón es un grupo de genes a partir de la alternativa sigma factor AlgU / T y continuando con mucA, mucB y MUCD. AlgU / T es un regulador positivo, mientras que MUCAB-D se clasifican como reguladores negativos de la producción de alginato 6-8. Además, los reguladores transcripcionales, tales como ALGB, AlgQ, ALGR, y RpoN, así como post-transcripcional y post-translacional modificación por el control de la represión catabólica, la actividad quinasa (KinB) y intramembrane proteólisis, también se han demostrado estar involucrados en alginato regulación 9-14.
El vector transposón mini-Himar1 conocida como Comisión PFA fue creado originalmente en el laboratorio del Dr. Mekalanos 'en Harvard Medical School 15. El plásmido PFA consta de un elemento transponible flanqueado por dos repeticiones invertidas de 27 pb y un casete de gentamicina de resistencia en el medio (aacC1: 534 pb), un gen que codifica la hyperactive transposasa Mariner 16, y una codificación de β-lactamasa gen (bla) (Figura 1). Secuencia de la información para el elemento de transposición de la Comisión PFA está disponible en el número de acceso de GenBank: DQ366300 13. En la Comisión PFA, hay un sitio de clonación múltiple (MCS) detrás del gen aacC1 que se utiliza para la identificación del sitio de inserción cromosómica utilizando PCR inversa. Una gran ventaja con el uso del transposón mini-Himar1 es que no se requieren factores del huésped específicos de transposición (mutagénesis). Además, hay una alta abundancia de los sitios de inserción de dinucleótidos TA se encuentran en todo el genoma de P. aeruginosa. Por ejemplo, AT sitios de inserción dinucleótido produce 94.404 y 100.229 veces en el PAO1 (6.264.404 bps, número de acceso GenBank NC_002516.2) y PA14 (6.537.648 bps; número de acceso GenBank NC_008463) genomas, respectivamente. Debido a la abundancia de TA dinucleótido en el genoma, mini-Himar1 Transposón puede causar que el de alta densidad y mutagénesis aleatoria, que es particularmente adecuado para el análisis de genes de virulencia y los genes que están altamente regulados. Teóricamente, el transposón mini-Himar1 puede insertar en cualquier gen no esencial dentro del genoma de P. aeruginosa. Esto proporciona aproximadamente 18 sitios de inserción de asistencia técnica al marco de lectura abierto en el genoma PAO1.
Aquí se describe un protocolo utilizando mini-Himar1 transposón mutagénesis mediada por identificar nuevos reguladores de mucoidy en P. aeruginosa. Más específicamente, biparental conjugamos el vector de la Comisión PFA contiene un transposón mini-Himar1 de E. coli SM10/λpir en el nonmucoid cepa PAO1 prototrophic. Después de que el transposón se integra en el genoma, la cepa receptora se cultiva en Pseudomonas aislamiento agar (PIA) que contiene triclosán que inhibe el crecimiento de E. coli. Por lo tanto, una biblioteca de mutantes de P. aeruginosa puede ser seleccionado por el crecimiento en la placa de PIA suplementado con gentamicina y la presencia del fenotipo mucoide. Tenga en cuenta, un transposón mediada vs un mutante verdadera integración tendrá un fenotipo resistente y carbenicilina sensible gentamicina. En este estudio, aproximadamente 80.000 mutantes de inserción de PAO1 se aislaron a través de cuatro conjugaciones separadas. Hemos examinado a continuación para los aislados mucoides, y se determinó el sitio de inserción por la digestión con enzimas de restricción, ligación y PCR inversa. Se realizó análisis de transferencia de Southern usando la casete de resistencia a gentamicina como una sonda para ver el número de inserción por genoma. Se determinó que más de 90% de los mutantes obtenidos por la conjugación utilizando este protocolo tenía sólo una única copia de la Himar1 en el genoma y se muestra el fenotipo resistente y-carbenicilina sensible gentamicina. Se identificaron un total de 32 cepas mucoides, 22 de ellas fueron asignadas a diferentes loci del P. aeruginosa PAO1cromosoma. Esta tasa de inserción proporciona una cobertura adecuada para identificar varios reguladores novedosos de la sobreproducción de alginato.
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Protocolo
1. Preparación de cepas bacterianas y biparental Conjugación
- Inocular E. coli SM10/λpir/pFAC en 5 ml de caldo Luria (LB) suplementado con 15 g / ml de gentamicina y colocar en una incubadora de agitación durante la noche a 37 ° C.
- Inocular P. aeruginosa cepa PAO1 en 5 ml de LB, y colóquelo en un incubador con agitación durante la noche a 42 ° C.
- Mida OD 600 de cultivos de una noche y mezclar cantidades iguales de PAO1 y E. coli Pfac de tal manera que el volumen final es de entre 1-1,4 ml.
- Mezcla Centrifugar a 6000 xg durante 5 min.
- Mientras tanto, secar placas de LB para la conjugación: deje los platos abiertos en una incubadora a 37 ° C durante 10-15 min.
- Retire todos menos 50 l de sobrenadante de la mezcla de células.
- Resuspender el sedimento celular en los 50 l restantes de sobrenadante y la pipeta sobre una placa de LB seco en una gotita compacto.
- Coloque con cuidado la placa bajo una campana extractora que se seque (IMPONota rtante: No permita que las células se distribuyen en la placa, esto disminuirá significativamente la eficacia de la conjugación).
- Una vez que la gotita está seco, invertir la placa de LB y se incuba a 37 ° C durante 4-6 horas.
- Mientras que la mezcla de células se está incubando, preparar grandes (150 mm DE x 15 mm) Placas de PIA con 300 g / ml de gentamicina. Antes de su uso, eliminar la humedad residual mediante la colocación en una incubadora a 37 ° C durante 15-20 min.
- Después de la incubación de la mezcla de células es completa, recoger las células usando un asa de inoculación estéril y en un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de LB y vórtice, o una pipeta, para mezclar a fondo.
- Separe las células uniformemente sobre las planchas de PIA contienen 300 g / ml de gentamicina. (IMPORTANTE: Para este paso, lo mejor es añadir volúmenes crecientes de la mezcla de células para separar las placas (por ejemplo, la placa 1: 10 l, de la Plata 2: 50 l, de la Plata 3: 100 l, de la Plata 4: 500 l, etc) .
- Incubar durante la noche a 37° C.
2. Detección y aislamiento de colonias mucosas
- Retire las placas de la incubadora y examinar las colonias mucoides.
- Aislar una sola colonia mucoide y consecutivas para el aislamiento en placas pequeñas (OD 100 x 10 mm) con PIA y 300 g / ml de gentamicina.
- Incubar toda la noche a 37 ° C.
- Repita el paso 2.2 en el cultivo de la noche anterior.
- Repita los pasos 2.2 hasta 2.4 dos veces más para determinar la estabilidad de la cepa mucoide.
- Después de la etapa final de aislamiento, inocular 4,5 ml de LB con una sola colonia mucoide e incubar en agitador durante la noche a 37 ° C.
- Al día siguiente, la etiqueta 3 tubos de microcentrífuga para cada mutante mucoide.
- Preparar dos alícuotas de 1,25 ml de cultivo de una noche en 2 tubos para la extracción de ADN genómico y la identificación del sitio de inserción del transposón (véase el Protocolo 3).
- Además, archivar cada mutante mucoide con la pipeta 1 ml de cultivo durante la noche en una CRÉDITOScriovial Ely marcado que contiene un volumen igual de leche descremada 10%. Almacenar a -86 ° C.
3. ADNg digestión de restricción y la ligadura
- Extracto de ADNg de la mutante mucoide usando cualquier método preferido (fenol-cloroformo, por ejemplo, la columna. Espín, etc.)
- Determinar la concentración de la ADNg, digerir un total de 2 g con 1 l de la endonucleasa de restricción SalI, 0,5 l de albúmina de suero bovino, 5 l de tampón de enzima SalI (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50, 10 mM de MgCl 2 , 1 mM de ditiotreitol (DTT), pH 7,9 a temperatura ambiente), y el volumen apropiado de dH2O para conseguir un volumen total de 50 l.
- Digerir el ADN durante la noche a 37 ° C. (IMPORTANTE:. Dependiendo de la eficiencia de la enzima de restricción, puede ser necesario añadir un adicional de 1 l para la noche a la mañana digest y se incuba a 37 ° C durante 1-2 horas Esto es además de la noche a la mañana digest.)
- Se purifica el digeSTED ADN usando cualquier método preferido (por ejemplo, purificación en gel de agarosa, columnas de centrifugado) y se eluye con 25 l de tampón.
- Se liga el ADN digerido mediante la mezcla de 11 l de ADN purificado con una concentración preferida de ~ 10-20 ng / l, 1,5 l de tampón de ligadura (330 mM de Tris-acetato, pH 7,5, 660 mM de acetato de potasio, acetato de magnesio 100 mM, 5 mM TDT), 1,5 l de ATP 100 mM y 1 l de ADN ligasa.
- Incubar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente, y después inactivar la enzima por incubación durante 15 min a 70 ° C. (Nota: la incubación de la mezcla a temperatura ambiente durante más tiempo puede aumentar el éxito de la ligadura).
4. PCR inversa (iPCR) y Análisis de Secuencia
- Realice iPCR el producto de ligación utilizando la siguiente adelante y atrás primers y ciclos térmicos condiciones:
-Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Termociclador Condiciones:
1. 94 ° C durante 1 min.
2. 94 ° C durante 1 min.
3. 58 ° C durante 2 min.
4. 72 ° C durante 2 min.
5. 72 ° C durante 8 min.
6. 10 ° C espera.
Repita los pasos 2-4 para 34 ciclos.
(NOTA: Los productos de Amplified iPCR pueden almacenarse a 4 ° C) - Realice la electroforesis en gel de agarosa para confirmar la amplificación exitosa iPCR.
- Lleve a cabo la secuenciación del producto iPCR utilizando los cebadores Gm3OUT y Gm5OUT. El sitio de inserción y la orientación de Himar1 se asignan a cabo.
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Resultados
Como se ilustra en la Figura 1, el vector de transposón mariner-Mini Himar1, PFA, contiene dos repeticiones invertidas de 27 pb con sitios de inserción de AT que flanquean el casete de resistencia a gentamicina aacC1, con su promotor σ 70-dependientes, y un sitio de clonación múltiple (MCS). Además, el vector de la Comisión PFA contiene genes que codifican la transposasa altamente activo Himar1, β-lactamasa (bla), y el operón de transferencia de TRA.
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Discusión
Es importante señalar que este método se puede utilizar en otras especies de Pseudomonas con estas alteraciones: incubar P. y P. fluorescens putida a 30 ° C, y P. stutzeri a 42 ° C; P. stuzeri debe cultivarse en placas de LB suplementadas con 150 g / ml de gentamicina; en el paso 1,11, p células stutzeri deben transferirse en 500 l de LB en lugar de 1 ml. Además, hay dos pasos críticos para este protocolo. En primer lugar, la cepa receptora debe cultivarse a...
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Divulgaciones
El autor Hongwei D. Yu es el oficial científico jefe y cofundador de progénesis Technologies, LLC.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la National Aeronautics and Space Administration West Virginia Espacio de Grant Consorcio (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) y NIH P20RR016477 y P20GM103434 a la Red IDEA West Virginia para la Investigación Biomédica de Excelencia. Damos las gracias a M. Vonya Eisinger para la asistencia técnica con este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caldo Luria | Difco | 240230 | vía Fisher Scientific |
| Pseudomonas agar de aislamiento | Difco | 292710 | vía Fisher Scientific |
| Placas pequeñas (100 diámetro exterior x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Placas grandes (150 diámetro exterior x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Incubadora de agitación de sobremesa | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | agitar a 200 rpm |
| Incubadora de armario | VWR | 1540 | |
| Microcentrífuga de sobremesa | Sorvall | 75-003-287 | a través de Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Espectrofotómetro | Bio-Rad | 170-2525 | o método/proveedor preferido |
| Asas de inoculación desechables | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Viales criogénicos de 2,0 ml | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| Tubos de 15 ml | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Leche desnatada | Difco | DF0032-17-3 | vía Fisher Scientific |
| DNeasy Sangre y Tejidos (250) | Qiagen | 69506 | o método/proveedor preferido |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | o método/proveedor preferido |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | o método/proveedor preferido |
| Kit de ligadura de ADN FastLink II | Epicentre Technologies | LK6201H | a través de Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | vía Fisher Scientific |
| Sal1, endonucleasa de restricción | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher |
| Scientific Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Sulfato de gentamicina | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Viales criogénicos | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
Referencias
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