Aquí se describe un protocolo utilizando el navegante mutagénesis-mini Himar1 transposón mediada para generar una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad de la pantalla, aislar e identificar nuevos reguladores de alginato en el prototípico cepa PAO1 Pseudomonas aeruginosa.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en
En este artículo
Resumen
Resumen
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa, del medio ambiente con capacidades metabólicas versátiles. P. aeruginosa es una bacteria patógena oportunista que produce infecciones pulmonares crónicas en pacientes con fibrosis quística (FQ). La sobreproducción de un polisacárido capsular llamado alginato, también conocido como mucoidy, promueve la formación de biopelículas mucoides que son más resistentes que las células planctónicas a la quimioterapia antibiótico y las defensas del huésped. Además, la conversión de la nonmucoid a fenotipo mucoide es un marcador clínico para el inicio de la infección crónica en la FQ. Sobreproducción de alginato por P. aeruginosa es un proceso que en gran medida endergónica impuestos sobre la energía celular. Por lo tanto, la producción de alginato está muy regulada en P. aeruginosa. Para entender mejor la regulación de alginato, se describe un protocolo usando el transposón de mutagénesis de mini-Himar1 para la identificación de nuevos regulador de alginatos en una cepa PAO1 prototípico. El procedimiento consta de dos pasos básicos. En primer lugar, hemos transferido el transposón mini-Himar1 (PFA) del huésped E. coli SM10/λpir en receptor P. aeruginosa PAO1 a través de la conjugación biparental para crear una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad, los cuales fueron seleccionados en placas de agar de Pseudomonas aislamiento suplementado con gentamicina. En segundo lugar, hemos examinado y aislaron las colonias mucoides para asignar el lugar de la inserción a través de PCR inversa usando cebadores de ADN que apuntan hacia el exterior desde el casete de gentamicina y la secuenciación del ADN. El uso de este protocolo, se han identificado dos nuevos reguladores de alginato, Muce (PA4033) y kinB (PA5484), en PAO1 cepa con una de tipo salvaje mucA codifica el factor anti-sigma MUCA para el maestro de alginato regulador AlgU (ALGT, σ 22) . Este protocolo de mutagénesis de alto rendimiento puede ser modificado para la identificación de otros genes relacionados con la virulencia que causa el cambio en Colomorfología ny.
Introducción
La capacidad de la oportunista, patógenos Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa para sobreproducir alginato es un factor importante en su capacidad para establecer un biofilm. La sobreproducción de alginato es un fenotipo a menudo referido como mucoidy. El aislamiento de colonias mucosas de los esputos de los individuos que sufren de fibrosis quística (FQ) es indicativo de una infección crónica y se asocia directamente con una disminución general de la salud del paciente 1. En la actualidad, se entiende que la regulación y la producción de alginato en P. aeruginosa se produce principalmente en dos operones. El primero es el operón biosin....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de cepas bacterianas y biparental Conjugación
- Inocular E. coli SM10/λpir/pFAC en 5 ml de caldo Luria (LB) suplementado con 15 g / ml de gentamicina y colocar en una incubadora de agitación durante la noche a 37 ° C.
- Inocular P. aeruginosa cepa PAO1 en 5 ml de LB, y colóquelo en un incubador con agitación durante la noche a 42 ° C.
- Mida OD 600 de cultivos de una noche y mezclar cantidades iguales de PAO1 y E. coli Pfac de tal manera que el volumen final es de entre 1-1,4 ml.
- Mezcla Centrifugar a 6000 xg durante 5 min.
- Mientras tanto, secar placas de LB para la conju....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Como se ilustra en la Figura 1, el vector de transposón mariner-Mini Himar1, PFA, contiene dos repeticiones invertidas de 27 pb con sitios de inserción de AT que flanquean el casete de resistencia a gentamicina aacC1, con su promotor σ 70-dependientes, y un sitio de clonación múltiple (MCS). Además, el vector de la Comisión PFA contiene genes que codifican la transposasa altamente activo Himar1, β-lactamasa (bla), y el operón de transferencia de TRA.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Es importante señalar que este método se puede utilizar en otras especies de Pseudomonas con estas alteraciones: incubar P. y P. fluorescens putida a 30 ° C, y P. stutzeri a 42 ° C; P. stuzeri debe cultivarse en placas de LB suplementadas con 150 g / ml de gentamicina; en el paso 1,11, p células stutzeri deben transferirse en 500 l de LB en lugar de 1 ml. Además, hay dos pasos críticos para este protocolo. En primer lugar, la cepa receptora debe cultivarse a.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
El autor Hongwei D. Yu es el oficial científico jefe y cofundador de progénesis Technologies, LLC.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la National Aeronautics and Space Administration West Virginia Espacio de Grant Consorcio (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) y NIH P20RR016477 y P20GM103434 a la Red IDEA West Virginia para la Investigación Biomédica de Excelencia. Damos las gracias a M. Vonya Eisinger para la asistencia técnica con este trabajo.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caldo Luria | Difco | 240230 | vía Fisher Scientific |
| Pseudomonas agar de aislamiento | Difco | 292710 | vía Fisher Scientific |
| Placas pequeñas (100 diámetro exterior x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Placas grandes (150 diámetro exterior x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Incubadora de agitación de sobremesa | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | agitar a 200 rpm |
| Incubadora de armario | VWR | 1540 | |
| Microcentrífuga de sobremesa | Sorvall | 75-003-287 | a través de Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Espectrofotómetro | Bio-Rad | 170-2525 | o método/proveedor preferido |
| Asas de inoculación desechables | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Viales criogénicos de 2,0 ml | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| Tubos de 15 ml | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Leche desnatada | Difco | DF0032-17-3 | vía Fisher Scientific |
| DNeasy Sangre y Tejidos (250) | Qiagen | 69506 | o método/proveedor preferido |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | o método/proveedor preferido |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | o método/proveedor preferido |
| Kit de ligadura de ADN FastLink II | Epicentre Technologies | LK6201H | a través de Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | vía Fisher Scientific |
| Sal1, endonucleasa de restricción | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher |
| Scientific Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Sulfato de gentamicina | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Viales criogénicos | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
Referencias
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
