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Artículo de método

Electrofisiológico Grabación desde

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⸱

DOI:

10.3791/51355

⸱

26 de febrero de 2014

 ,  , 
1MCDB, Yale University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe registro extracelular de los potenciales de acción respuestas disparados por las neuronas gustativas labellar en Drosophila.

Resumen

La respuesta de sabor periférica de insectos puede ser poderosamente investigó con técnicas electrofisiológicas. El método aquí descrito permite al investigador para medir las respuestas gustativas directa y cuantitativa, lo que refleja la entrada sensorial que el sistema nervioso de los insectos recibe de estímulos de sabor en su entorno. Este protocolo describe todos los pasos clave en la realización de esta técnica. Los pasos críticos en el montaje de una plataforma de electrofisiología, como la selección de los equipos necesarios y un entorno adecuado para la grabación, se delinean. También describe cómo prepararse para la grabación haciendo electrodos de referencia y registro adecuados y soluciones saborizante. Se describe en detalle el método utilizado para preparar el insecto mediante la inserción de un electrodo de referencia de vidrio en la marcha con el fin de inmovilizar la trompa. Mostramos los rastros de los impulsos eléctricos disparados por las neuronas gustativas en respuesta a un azúcar y un compuesto amargo. Aspectos del protocolo son technically desafiante e incluimos una extensa descripción de algunos problemas técnicos comunes que se pueden encontrar, como la falta de señal o ruido excesivo en el sistema, y ​​las posibles soluciones. La técnica tiene limitaciones, tales como la incapacidad para entregar estímulos temporalmente complejos, observar el fondo de disparar inmediatamente antes de la entrega a los estímulos, o utilizar compuestos de sabor insolubles en agua convenientemente. A pesar de estas limitaciones, esta técnica (incluyendo variaciones menores que se hace referencia en el protocolo) es un estándar, procedimiento ampliamente aceptado para la grabación de las respuestas neuronales de Drosophila para probar compuestos.

Introducción

El sentido del gusto permite un insecto para detectar una amplia gama de productos químicos solubles y juega un papel importante en la aceptación de una sustancia nutritiva, o el rechazo de un ser nociva o tóxica. Sabor también se cree que desempeñan un papel en la selección de la pareja, a través de la detección de feromonas 1-5. Estas funciones importantes y diversos han hecho que el sistema del gusto del insecto un objetivo convincente de investigación sobre cómo los sistemas sensoriales traducen señales del medio ambiente en las salidas de comportamiento pertinentes.

La unidad principal del sistema del gusto Drosophila melanogaster es el pelo sabor o sensillum. Las moléculas entran en el sensillum a través de un poro en su punta de 2,6. Sensilla se encuentran en el labelo, las piernas, el margen de ala, y la faringe 6. En el labelo, el número y la ubicación de sensilla es estereotipado. Hay tres clases morfológicas de sensilla basados ​​en longitud: la longitud (L), intermedio (I) y corto (S ) Sensilla 7,8. Cada sensillum contiene ya sea dos (de tipo I) o cuatro (L-y de tipo S) neuronas receptoras gustativas (GRNs) 9. Diferentes GRNs responden a diferentes categorías de estímulos sabor: amargo, el azúcar, la sal y la osmolaridad 7,10 y expresan diferentes subconjuntos de receptores gustativos 8,11-13. Sólo I y de tipo S sensilla contengo GRNs-amargas sensible 8,10. El proyecto GRNs al ganglio subesophageal (TG) y su activación por las moléculas de sabor se transmite al sistema nervioso central superior para la decodificación, lo que resulta en una respuesta de comportamiento 6. El relativamente pequeño número de neuronas y la susceptibilidad a un análisis molecular y de comportamiento hacen que el sistema del gusto Drosophila un excelente modelo para la investigación de los sistemas gustativos en general. La relativa facilidad con la que el sistema puede ser manipulado a través de mutación genética o el sistema de expresión de GAL4-UAS también sirve como una herramienta valiosa 14,15.

ONTENIDO "> Debido a que estos sensilla sobresalen de la superficie del labelo, que son excelentes objetivos para electrofisiología. El disparo de los GRNs se puede supervisar usando la grabación extracelular. Históricamente, el método de grabación de la pared lateral, que utiliza un electrodo de vidrio insertado en la sensillum para registrar la actividad neuronal, 26 se ha utilizado. Sin embargo, este método es técnicamente difícil de realizar, y que es difícil de grabar por mucho tiempo a partir de cada preparación. El método de la punta-de grabación, que mide la respuesta de las neuronas con un electrodo que proporciona simultáneamente un saborizante, se ha convertido ya que el método de elección 9,16. Se ha utilizado para investigar el sistema de sabor de Drosophila melanogaster 8,10,17,18, así como un número de otras especies de insectos 19-23. Tiene sido facilitado en gran medida por el desarrollo del amplificador tastePROBE, que superó uno de los principales inconvenientes del método de grabación de punta mediante la compensación dela gran diferencia de potencial entre el electrodo de referencia y el sensillum de insectos, permitiendo que los potenciales de acción GRN a grabarse sin excesiva amplificación o filtrado 24. Otro acontecimiento importante fue el uso de citrato de tricolina como electrolito grabación 25. TCC suprime las respuestas de la GRN-osmolaridad sensible y no estimula la GRN sensibles a la sal, por lo que las respuestas generadas por los sabores amargos y azúcar mucho más fáciles de analizar 25.

Aquí se describe cómo grabar punta de Drosophila labellar sensilla se lleva a cabo actualmente en el laboratorio Carlson. Este protocolo le explicará cómo establecer una plataforma adecuada de electrofisiología, la forma de preparar la marcha, y cómo realizar grabaciones gustativas. También presentamos algunos datos representativos obtenidos mediante el registro de los subconjuntos de Drosophila sensilla, así como algunos problemas comunes y las posibles soluciones que se pueden encontrar cuando se utiliza estetécnica.

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Protocolo

El siguiente protocolo cumple con todas las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Yale.

1. Reactivos y Preparación del equipo

  1. Ajuste del equipo de grabación (Figura 1A).
    1. Elija una habitación para la configuración plataforma que está libre de grandes variaciones de temperatura o humedad, y también aislado de fuentes de ruido eléctrico y mecánico, como refrigeradores y centrifugadoras.
      figure-protocol-1
      Figura 1. (A) Descripción general de la configuración equipo de grabación. Estereomicroscopio (a) está montado en la plataforma anti-vibración (b) soporte del electrodo. Referencia (c) está montado en la plataforma frente a la headstage (d), a través de micromanipuladores. Un tubo de plástico de salida (e) la entrega de corriente de aire humidificado dirigida a la preparación mosca está montado también en Tél plataforma. El headstage está conectado al amplificador (f), que está conectado al sistema digital de adquisición (DAS) (g), el cual está conectado a un PC (h). (B) La configuración de los electrodos y el tubo de salida:. Electrodo de referencia de la izquierda, la grabación de electrodos a la derecha, y el tubo de salida de la corriente de aire dirigida a la preparación mosca Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
    2. Monte estereoscópico para centro de mesa anti-vibración o plataforma.
    3. Adjuntar micromanipulador para la preparación del electrodo de referencia / insecto y headstage / electrodo de registro a la izquierda y derecha del microscopio, respectivamente, utilizando soportes magnéticos.
    4. Montaje de tubo de plástico de salida en un tercer micromanipulador para la parte trasera del microscopio, orientado de tal manera que la abertura del tubo es apuntada hacia la ubicación de preparación de mosca (véase la Figura 1B).
    5. El uso de tubos de plástico flexible, por lotubo de plástico de salida del tacómetro a un matraz de vacío parcialmente lleno con agua. Conectar una pequeña bomba de acuario de la burbuja de aire a través del agua en el matraz, la generación de una corriente de aire humidificado a través del tubo de plástico de salida hacia la mosca.
    6. Monte de fibra óptica la fuente de luz de la mesa de vibración, la orientación de las salidas para iluminar la preparación al reflejar la luz a través de un pedazo de papel de tarjetas blanco justo debajo de la preparación. Asegúrese de que la fuente de luz no descansa sobre la mesa. Nota: el beneficio de lo que refleja la fuente de luz en un disco de papel es doble: mejora el contraste, por lo que sensilla más fácil de visualizar, y se evita el calentamiento de la preparación que se derivarían de la luz directa.
    7. Conecte el amplificador tastePROBE en el sistema de adquisición digital (DAS), y el DAS en un ordenador personal, de acuerdo con el manual de proveedores. Enchufe el pie del pedal de disparo en y organizar bajo espacio de trabajo. Nota: Los enchufes de pared eléctricamente aisladas para el amplificador y el DAS son altamente deseablecapaz.
    8. Conectar a tierra el microscopio, micromanipuladores y fuente de luz mediante la conexión de los componentes de metal para mesa con pinzas de cocodrilo y longitudes de cable eléctrico aislado y cinta aislante. Conectar a tierra la plataforma de metal mediante la conexión a tierra del edificio o del DAS, que está conectado a tierra a través del enchufe de alimentación.
    9. Instalar el software apropiado para la adquisición de la DAS de elección en el ordenador personal. Nota: Asegúrese de que los controladores de adquisición digital son compatibles con el sistema operativo en el PC.
    10. Configurar la amplificación de software (10-100x), filtrado de señal (típicamente un filtro de paso de banda de Bessel ajustar de 100 Hz-3, 000 Hz), y la tasa de muestreo (por lo menos 10 KHz). Nota: Las amplitudes de señal de las neuronas gustativas están típicamente en el rango mV 0,5-2, por lo que la escala de visualización está configurado para facilitar su visualización. Nota: El filtro de 100 Hz ayuda a excluir el ruido eléctrico extraña, sin embargo, cambia la forma de los picos y puede hacer pico de clasificación avanzada More impugnar. Alternativamente, un filtro de 1 Hz se puede utilizar.
    11. Opcionalmente, una jaula de Faraday puede ser configurado alrededor de toda la mesa de vibración. Sin embargo, pequeñas hojas de papel de aluminio son por lo general suficiente para reducir cualquier ruido generado por el ambiente externo o el investigador.
  2. Glass Preparación del electrodo
    figure-protocol-2
    Figura 2. Referencia y registro de electrodos. Photograph bajo ampliación de capilares de vidrio tirados en el electrodo de referencia, con (A) y sin (B) la punta rota, y los electrodos de grabación (C). Barra blanca representa 2 mm. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
    1. Tire de la referenciaelectrodo de un capilar de vidrio utilizando un instrumento extractor de pipeta. Nota: Los ajustes exactos del programa extractor de pipeta pueden variar de un instrumento a otro. Trate de lograr una reducción gradual muy largo. El tamaño de poro en la punta no es crucial, ya que la punta se romperá antes de la preparación mosca (Figuras 2A y 2B), sin embargo, asegurarse de que el diámetro de la longitud ahusada del electrodo no es ni demasiado delgada, que no permita la suficiente inmovilización del labelo, ni demasiado grande, que podría dañar las neuronas gustativas o romper las glándulas salivales.
    2. Tire del electrodo graba desde un capilar de vidrio de borosilicato con filamento usando un instrumento extractor pipeta. Trate de lograr una conicidad que es menos profunda que la del electrodo de referencia, y un diámetro de poro de aproximadamente 10-15 micras (Figura 2C) 28.
  3. Preparación de soluciones saborizante
    1. Utilice Beadle-Ephrussi solución Ringerción (B & E) como electrolito del electrodo de referencia. Para hacer un litro de B & E, disolver 7,5 g de NaCl, 0,35 g de KCl, y 0,279 g de CaCl 2 ∙ 2H 2 O en un litro de agua ultrapura. Almacenar alícuotas menores a -20 ° C.
    2. Utilice 30 mM de solución de citrato de tricolina (TCC) como electrolito electrodo de registro y disolvente para soluciones saborizante 25, si las respuestas GRN amargas o de azúcar se van a medir. Alternativamente, una solución de cloruro de potasio mM 1-3 se puede utilizar si las respuestas de la celda de agua se van a medir.
    3. Para hacer soluciones saborizante, pesar la cantidad adecuada de saborizante en polvo y añadir al TCC para hacer una concentración inicial de acciones. Use esto para hacer diluciones seriadas de esta población inicial para producir la concentración deseada para la prueba. Nota: Si estimulantes del gusto no se disuelven fácilmente en agua, otro disolvente, tal como etanol, se puede utilizar para hacer que la concentración de stock inicial. Una solución de control adecuado de TCC y el disolvente sin saborizantese debe utilizar en este caso.
    4. Alícuotas de las tiendas a largo plazo a -20 ° C. Almacenar una alícuota de una solución de trabajo saborizante a 4 ° C para el registro de uso de hasta una semana, dependiendo de las propiedades químicas de saborizante.

2. Preparación de Drosophila

figure-protocol-3
Figura 3. Preparación de mosca para la grabación. (A) Posición de inserción del electrodo de referencia en el tórax dorsal de la mosca. La flecha blanca indica el electrodo de referencia. (B) Posición intermedia del electrodo de referencia: avanzar a través del cuello y la cabeza, probóscide aún no extendidos. (C, D) Vuela con electrodo de referencia en la posición final con la punta del electrodo en el interior labelo, y la probóscidecompletamente extendido. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

  1. Recoger las moscas recién eclosed para grabar a partir de cultivos de moscas bien mantenidas, cultivadas bajo y temperatura-condiciones de humedad controlada, y envejecerlos 5-10 días en frascos de cultivo fresco antes de grabar.
  2. Chill placa de microscopio en hielo durante 15 a 30 min antes de preparar la mosca.
  3. Relleno electrodo de referencia de vidrio con B & E solución usando una larga aguja de plástico, delgada de 0,5 mm de diámetro, tal como una aguja espinal y jeringa de 1 ml y golpear suavemente las burbujas. Romper pequeña cantidad de la punta de uso de fórceps y utilizar la acción capilar para extraer todas las burbujas restantes con un pañuelo desechable, observando bajo microscopio de disección.
  4. Slide B & E llenas electrodo de referencia sobre el alambre de soporte del electrodo de referencia, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.
  5. Aspirar volar en una punta de pipeta P200, utilizando un aspirador fly integradoa partir de tubos, malla, y la punta de la pipeta; 29 lugar en el cubo de hielo y el frío durante 30-60 seg.
  6. Retire la placa de microscopio de hielo, elimine los restos de humedad y la posición por debajo del microscopio. Golpear suavemente volar fuera de la punta de la pipeta sobre la placa de microscopio.
    Nota: la mosca debe ser suficientemente inmovilizado para manipular fácilmente.
  7. En condiciones de baja magnificación, retire suavemente las patas delanteras con un par de pinzas, mientras mantiene la estabilidad del tórax con el otro par de pinzas. Coloque la mosca en su parte ventral, frente a lado dorsal hacia arriba. Nota: Siempre tenga cuidado de no tocar el labelo con las pinzas en todo momento durante el proceso de preparación para reducir al mínimo los daños mecánicos.
  8. Mientras mantiene la marcha en su lugar con un par de fórceps, insertar el electrodo de referencia en la línea media de la parte posterior tórax dorsal. Un ángulo sugerido de entrada es de aproximadamente cuarenta y cinco grados, en la dirección de la cabeza (Figura 3A).
  9. Asegure el electrod referenciatitular e con plastilina de tal manera que la mosca es visible bajo el microscopio con una gran ampliación. Maniobra y el ángulo del electrodo de vidrio a través del cuello y la cabeza, deslizando la marcha hacia el soporte del electrodo de referencia utilizando dos pares de pinzas. Nota: Trabajar con rapidez, pero sin problemas, es más fácil de completar este paso, mientras que la marcha todavía está inmovilizado por el frío (Figura 3B).
  10. Extender suavemente la trompa con un par de fórceps, mientras desliza la marcha más abajo en el electrodo de referencia de vidrio, hasta que la punta del electrodo está dentro del labelo y la trompa está totalmente extendida (Figuras 3C y 3D). Nota: Tenga cuidado de no perforar cualquier parte del tejido probóscide o distender el borde del labelo con el electrodo de referencia, ya que esto puede dañar la marcha y / o sabor neuronas y afectar la calidad de la grabación.

3. Grabación desde Labellar Sensilla

figure-protocol-4
Figura 4. Grabación de mosca. (A) labelo de la preparación de la mosca en la izquierda con electrodo de registro alineados para el contacto a la derecha, con gran aumento. (B) electrodo de registro y solo sensillum el labelo en contacto, con gran aumento. Haz click aquí para ver la imagen más grande.

  1. Siempre tierra tocando la superficie metálica de la mesa anti-vibración o la plataforma antes de tocar cualquier equipo durante el proceso de grabación! Nota: Es muy importante que no se entregará una carga estática al headstage ya que puede dañar el circuito.
  2. Secure portaelectrodos referencia a micromanipulador montados en mesa de aire de recording plataforma. Coloque un lóbulo del labelo en microscopio de campo de vista, con gran aumento (típicamente al menos 140X), y en línea con la corriente de aire húmedo.
  3. Encienda el flujo de aire humidificado, ordenador, DAS, y el amplificador. Software de adquisición en Abrir.
  4. Enjuague y llene electrodo de registro de vidrio con saborizante deseado.
    1. Enjuague electrodo de registro de vidrio con agua ultrapura mediante el uso de una jeringa y un tubo de plástico 28 para tirar de pequeñas cantidades de agua a través del tubo de al menos diez veces.
    2. Enjuague electrodo de registro con saborizante al menos cinco veces. Llenar electrodo de registro de aproximadamente un tercio a medio camino completo con saborizante y retirar del tubo. Si hay burbujas de aire, toque para liberar o simplemente rellene el electrodo.
    3. Deslizar electrodo sobre alambre de plata de la headstage de forma rápida y sin problemas con el fin de no introducir burbujas de aire.
  5. Estimular sola sensillum con electrodo de registro saborizante lleno.
    1. Utilice la micromanipulator para llevar el electrodo de registro alineado con sensillum de interés.
    2. Presione el pedal para activar el modo de adquisición del amplificador.
    3. Avanzar el electrodo de registro con el mando de control fino de micromanipulador cuidadosamente hasta que haga contacto con la punta de sensillum y grabación comience.
    4. Quite el electrodo después de 1-2 segundos.
    5. Repita el paso 3.5 con otra sensilla, si se desea. Nota: Espere al menos 1 minuto entre presentaciones al mismo sensillum. Si se graba con un único saborizante durante un período prolongado de tiempo, la solución saborizante puede secarse y la solución en la punta puede ser más concentrado. Esto puede remediarse poniendo en contacto suavemente la punta del electrodo de vidrio con papel suave para extraer una pequeña cantidad de líquido por acción capilar.
  6. Para grabar las respuestas a otro saborizante, enjuague y electrodo de registro de carga con el nuevo saborizante y repita el paso 3.4. Nota: Completamente enjuagar el electrodo entre estimulantes del gusto es absolutely crucial para evitar la contaminación cruzada.
  7. Guarde los archivos de datos periódicamente con información de identificación, como la fecha, el genotipo y estimulantes del gusto. Nota: Es importante mantener un registro escrito de la saborizante y la identidad de cada sensillum presentación durante la sesión de grabación para el análisis de datos.

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Resultados

La Figura 5A muestra la respuesta de un sensillum L para un azúcar, sacarosa. La misma sensillum no responde a un compuesto amargo, berberina. Figura 5B muestra que un sensillum de tipo I, que contiene una neurona de respuesta amarga, muestra grandes picos de amplitud en respuesta a la berberina, y más pequeños picos de amplitud en respuesta a la sacarosa. L sensilla mostrar una mínima respuesta de fondo para el control de disolvente, TCC, mientras yo muestro sensilla prácticamente ning...

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Discusión

Sensilla Labellar varían en la facilidad de la grabación debido a las diferencias en la morfología y organización anatómica. A veces, un sensillum no responde a ningún estimulantes del gusto, incluso uno que se conoce para provocar una respuesta positiva. La frecuencia con la que ocurre esto varía dependiendo del tipo de sensillum. L sensilla son más consistentemente sensible y son relativamente fáciles de acceder debido a su longitud. En general, S sensilla son consistentemente sensible, pero su corta longitud y posici...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca predoctoral 1F31DC012985 NRSA (RD) y por el NIH subvenciones a JC

Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Linnea Weiss por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, el doctor Ryan Joseph para ayudar a compilar las cifras, y el Dr. Frederic Marion-Poll de asesoramiento técnico útil. También nos gustaría agradecer los útiles comentarios de cuatro colaboradores.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio estereoscópicocon zoom OlympusSZX12 DFPLFL1.6x PF oculares: WHN10x-H/22capaz de aumentar ~150X con soporte de montaje en mesa de larga distancia de trabajo
Mesa antivibratoriaKinetic SystemsBenchMate2210
MicromanipuladoresNarishigeNMN-21
Soportes magnéticosENCOModelo #625-0930
Referencia PortaelectrodosHarvard ApparatusESP/W-F10NSe puede montar en una pipeta serológica de 5 ml para un rango extendido
Alambre de plataWorld Precision InstrumentsAGW15100,3-0,5 mm de diámetro
retortagenérico
Tubo de plásticogenérico, 1 cm
de diámetro Tubo de plástico flexibleNalgene8000-0060VI grado 1/4 en diámetro interno 
cónico de 500 ml, con brazo lateral
Bomba para acuariosJardines acuáticosAirpump 2000
Fuente de luz de fibra ópticaDolan-Jenner IndustriesFiber-Lite 2100
White Card/PaperWhatman1001-110
Digital Acquisition SystemSyntechIDAC-4Alternativa: National Instruments NI-6251  
HeadstageSyntechDTP-1Tasteprobe
Amplificador Tasteprobe SyntechDTP-1Tasteprobe
Pinzas de cocodriloGrainger1XWN7Cualquier marca está bien
Cable eléctrico aislado Genéricode
oro Pines de conectorWorld Precision Instruments5482
OrdenadorpersonalDellVostroCompruebe la compatibilidad con el sistema de adquisición digital y el software
Software de adquisición SyntechAutospike Autospike funciona con IDAC-4; alternativamente, utilice LabView con papel de aluminio NI-6251
y/o jaulaBlindaje electromagnético contra el ruido
Capilares de vidrio de borosilicatoPrecision Instruments1B100F-4
Extractorpipetas Sutter Instrument CompanyModelo P-87 Extractor de micropipetas Flaming/Brown Beadle
SigmaT0252-100G
Microscopio estereoscópicoOlympusVMZ 1x-4xCapaz de aumento de 10-40X
Cubo
Genérico p200 Puntas
Genérico Aguja espinalgenérica TerumoSN*2590
Jeringa de 1 mlBeckton-Dickenson301025
Aspirador de moscasEnsamblado a partir de puntas de pipeta P1000, tubos de plástico flexible y malla
Arcillagenéricas
Fine Science Tools By Dumont11252-00#5SF (puntas superfinas)
Jeringa de 10 mlBeckton-Dickinson301029
Tubo de plásticoTygonR-3603
Soporte de de salida Matraz genérico de Faraday World de y Ephrussi Ringer Solution Ver receta en la sección de protocolo Citrato de tricolina, 65% de hielo de pipeta para modelar Pinzas

Referencias

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