Este protocolo describe registro extracelular de los potenciales de acción respuestas disparados por las neuronas gustativas labellar en Drosophila.
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Artículo de método
Electrofisiológico Grabación desde
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Resumen
Resumen
La respuesta de sabor periférica de insectos puede ser poderosamente investigó con técnicas electrofisiológicas. El método aquí descrito permite al investigador para medir las respuestas gustativas directa y cuantitativa, lo que refleja la entrada sensorial que el sistema nervioso de los insectos recibe de estímulos de sabor en su entorno. Este protocolo describe todos los pasos clave en la realización de esta técnica. Los pasos críticos en el montaje de una plataforma de electrofisiología, como la selección de los equipos necesarios y un entorno adecuado para la grabación, se delinean. También describe cómo prepararse para la grabación haciendo electrodos de referencia y registro adecuados y soluciones saborizante. Se describe en detalle el método utilizado para preparar el insecto mediante la inserción de un electrodo de referencia de vidrio en la marcha con el fin de inmovilizar la trompa. Mostramos los rastros de los impulsos eléctricos disparados por las neuronas gustativas en respuesta a un azúcar y un compuesto amargo. Aspectos del protocolo son technically desafiante e incluimos una extensa descripción de algunos problemas técnicos comunes que se pueden encontrar, como la falta de señal o ruido excesivo en el sistema, y las posibles soluciones. La técnica tiene limitaciones, tales como la incapacidad para entregar estímulos temporalmente complejos, observar el fondo de disparar inmediatamente antes de la entrega a los estímulos, o utilizar compuestos de sabor insolubles en agua convenientemente. A pesar de estas limitaciones, esta técnica (incluyendo variaciones menores que se hace referencia en el protocolo) es un estándar, procedimiento ampliamente aceptado para la grabación de las respuestas neuronales de Drosophila para probar compuestos.
Introducción
El sentido del gusto permite un insecto para detectar una amplia gama de productos químicos solubles y juega un papel importante en la aceptación de una sustancia nutritiva, o el rechazo de un ser nociva o tóxica. Sabor también se cree que desempeñan un papel en la selección de la pareja, a través de la detección de feromonas 1-5. Estas funciones importantes y diversos han hecho que el sistema del gusto del insecto un objetivo convincente de investigación sobre cómo los sistemas sensoriales traducen señales del medio ambiente en las salidas de comportamiento pertinentes.
La unidad principal del sistema del gusto Drosophila ....
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Protocolo
El siguiente protocolo cumple con todas las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Yale.
1. Reactivos y Preparación del equipo
- Ajuste del equipo de grabación (Figura 1A).
- Elija una habitación para la configuración plataforma que está libre de grandes variaciones de temperatura o humedad, y también aislado de fuentes de ruido eléctrico y mecánico, como refrigeradores y centrifugadoras.
- Elija una habitación para la configuración plataforma que está libre de grandes variaciones de temperatura o humedad, y también aislado de fuentes de ruido eléctrico y mecánico, como refrigeradores y centrifugadoras.
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Resultados
La Figura 5A muestra la respuesta de un sensillum L para un azúcar, sacarosa. La misma sensillum no responde a un compuesto amargo, berberina. Figura 5B muestra que un sensillum de tipo I, que contiene una neurona de respuesta amarga, muestra grandes picos de amplitud en respuesta a la berberina, y más pequeños picos de amplitud en respuesta a la sacarosa. L sensilla mostrar una mínima respuesta de fondo para el control de disolvente, TCC, mientras yo muestro sensilla prácticamente ning.......
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Discusión
Sensilla Labellar varían en la facilidad de la grabación debido a las diferencias en la morfología y organización anatómica. A veces, un sensillum no responde a ningún estimulantes del gusto, incluso uno que se conoce para provocar una respuesta positiva. La frecuencia con la que ocurre esto varía dependiendo del tipo de sensillum. L sensilla son más consistentemente sensible y son relativamente fáciles de acceder debido a su longitud. En general, S sensilla son consistentemente sensible, pero su corta longitud y posici.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca predoctoral 1F31DC012985 NRSA (RD) y por el NIH subvenciones a JC
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Linnea Weiss por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, el doctor Ryan Joseph para ayudar a compilar las cifras, y el Dr. Frederic Marion-Poll de asesoramiento técnico útil. También nos gustaría agradecer los útiles comentarios de cuatro colaboradores.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio estereoscópico | con zoom Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF oculares: WHN10x-H/22 | capaz de aumentar ~150X con soporte de montaje en mesa de larga distancia de trabajo |
| Mesa antivibratoria | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
| Micromanipuladores | Narishige | NMN-21 | |
| Soportes magnéticos | ENCO | Modelo #625-0930 | |
| Referencia Portaelectrodos | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Se puede montar en una pipeta serológica de 5 ml para un rango extendido |
| Alambre de plata | World Precision Instruments | AGW1510 | 0,3-0,5 mm de diámetro |
| retorta | genérico | ||
| Tubo de plástico | genérico, 1 cm | ||
| de diámetro Tubo de plástico flexible | Nalgene | 8000-0060 | VI grado 1/4 en diámetro interno |
| cónico de 500 ml | , con brazo lateral | ||
| Bomba para acuarios | Jardines acuáticos | Airpump 2000 | |
| Fuente de luz de fibra óptica | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
| White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
| Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternativa: National Instruments NI-6251 |
| Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
| Amplificador Tasteprobe Syntech | DTP-1 | Tasteprobe | |
| Pinzas de cocodrilo | Grainger | 1XWN7 | Cualquier marca está bien |
| Cable eléctrico aislado Genérico | de | ||
| oro Pines de conector | World Precision Instruments | 5482 | |
| Ordenador | personalDell | Vostro | Compruebe la compatibilidad con el sistema de adquisición digital y el software |
| Software de adquisición Syntech | Autospike Autospike funciona con IDAC-4; alternativamente, utilice LabView con papel de aluminio NI-6251 | ||
| y/o jaula | Blindaje electromagnético contra el ruido | ||
| Capilares de vidrio de borosilicato | Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Extractor | pipetas Sutter Instrument Company | Modelo P-87 Extractor de micropipetas Flaming/Brown Beadle | |
| Sigma | T0252-100G | ||
| Microscopio estereoscópico | Olympus | VMZ 1x-4x | Capaz de aumento de 10-40X |
| Cubo | |||
| Genérico p200 Puntas | |||
| Genérico Aguja espinal | genérica Terumo | SN*2590 | |
| Jeringa de 1 ml | Beckton-Dickenson | 301025 | |
| Aspirador de moscas | Ensamblado a partir de puntas de pipeta P1000, tubos de plástico flexible y malla | ||
| Arcilla | genéricas | ||
| Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (puntas superfinas) | |
| Jeringa de 10 ml | Beckton-Dickinson | 301029 | |
| Tubo de plástico | Tygon | R-3603 |
Referencias
- Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense....
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