Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

Resumen

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. La utilización de la cromatografía en fase normal líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con el cambio de polaridad y un ciclo de trabajo rápido, se describe un protocolo para analizar la composición metabólica polar de material biológico con una alta sensibilidad, precisión y resolución.

Resumen

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. Sin embargo, las actuales plataformas tienen diferentes factores limitantes, como las preparaciones de mano de obra de la muestra, bajos límites de detección, la velocidad de barrido lento, optimización de método intensivo para cada metabolito, y la imposibilidad de medir tanto positiva e iones con carga negativa en los experimentos individuales. Por lo tanto, un nuevo protocolo de la metabolómica podría avanzar los estudios de metabolómica. Cromatografía hidrófilo a base de amida permite el análisis de metabolitos polares sin ninguna derivatización química. MS de alta resolución usando el Q-Exactive (QE-MS) ha mejorado la óptica de iones, aumento de velocidades de exploración (256 ms a una resolución de 70.000), y tiene la capacidad de llevar a cabo el cambio positivo / negativo. Utilizando una estrategia de extracción de metanol frío y acoplar una columna de amida con QE-MS permite la detección robusta de 168 metabolitos y miles polares dirigidos de características adicionales de forma simultánea. Datun procesamiento se lleva a cabo con el software disponible comercialmente en una forma altamente eficiente, y características desconocidas extraídas de los espectros de masas se puede consultar en las bases de datos.

Introducción

La metabolómica, definidas como un experimento que mide varios metabolitos simultáneamente, ha sido un área de intenso interés. La metabolómica proporciona una lectura directa de la fisiología molecular y ha proporcionado conocimientos sobre el desarrollo y la enfermedad como el cáncer de ^1-4. La resonancia magnética nuclear (RMN) y la cromatografía de espectrometría de masas de gases (GC-MS) se encuentran entre los instrumentos más utilizados ^5-9. RMN, especialmente se ha utilizado para los experimentos de flujo desde compuestos marcados de isótopos pesados, tales como ¹³ C etiquetados metabolitos, son RMN-activo ^10,11. Sin embargo, esta estrategia requiere relativamente alta pureza de la muestra y la gran cantidad de la muestra, lo que limita sus aplicaciones en la metabolómica. Mientras tanto, los datos obtenidos de RMN análisis de las necesidades de obra y asignación compuesta de los espectros de RMN complejo es difícil. GC-MS ha sido ampliamente utilizado para los metabolitos polares y los estudios de lípidos, pero requiere compoun volátilds y, por tanto, a menudo la derivación de metabolitos, que a veces implica la química compleja que puede llevar mucho tiempo e introduce ruido experimental.

La cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas de triple cuadrupolo utiliza el primer cuadrupolo para la selección de los iones primarios intactos, que son fragmentados a continuación, en el segundo cuadrupolo, mientras que el tercer cuadrupolo se utiliza para seleccionar fragmentos característicos o iones hija. Este método, que registra la transición de iones primarios a iones secundarios específicos, se denomina monitorización de reacción múltiple (MRM). MRM es un método muy sensible, específico y robusta tanto para moléculas pequeñas y cuantificación de proteínas ^12-15,21. Sin embargo, MRM tiene sus limitaciones. Para lograr una alta especificidad de un método MRM tiene que ser construido para cada metabolito. Este método consiste en la identificación de un fragmento específico y la correspondiente energía de colisión optimizado, que requiere conocimiento previo de la propertes de los metabolitos de interés, como la información de la estructura química. Por lo tanto, con algunas excepciones que implican la pérdida neutra de fragmentos comunes, no es posible identificar metabolitos desconocidos con este método.

En los últimos años, la espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) instrumentos han sido puestos en libertad, tales como la serie LTQ-orbitrap y Exactive, el QuanTof y TripleTOF 5600 ^16-18,22. HRMS pueden proporcionar una relación masa a carga (m / z) de los iones intactos dentro de un error de unas pocas ppm. Por lo tanto, un instrumento HRMS operado por la detección de todos los iones precursores (es decir, modo de barrido completo) puede obtener información estructural directa de la masa exacta y la composición elemental resultante del analito, y esta información puede ser utilizada para identificar los posibles metabolitos. De hecho, toda la información acerca de un compuesto se puede obtener con una masa exacta, hasta el nivel de los isómeros estructurales. Además, un completométodo de exploración no requiere conocimientos previos de los metabolitos y no requiere la optimización del método. Además, puesto que todos los iones con m / z caer en el rango de exploración pueden ser analizados, HRMS tiene una capacidad casi ilimitada en términos del número de metabolitos que pueden ser cuantificadas en un solo plazo en comparación con el método de MRM. HRMS también es comparable a un MRM de triple cuadrupolo de la capacidad cuantitativa debido al ciclo de trabajo corto que resulta en un número comparable de puntos de datos que se pueden obtener en un análisis completo de MS. Por lo tanto, HRMS proporciona un enfoque alternativo para la metabolómica cuantitativos. Recientemente, una versión mejorada de HRMS denomina espectrometría de masas Q-Exactive (QE-MS) se puede funcionar bajo la conmutación entre los modos positivos y negativos con tiempos de ciclo lo suficientemente rápido en un solo método, que amplía el rango de detección ^19. Aquí describimos nuestra estrategia metabolómica utilizando el QE-MS.

Protocolo

1. Preparación de LC-MS Reactivos, Establecimiento de un método de cromatografía, y establecimiento de procedimientos de operación del instrumento

1. Preparación de disolventes LC
   1. Preparar 500 ml fases móviles. A es acetato de amonio 20 mM y 15 mM de hidróxido de amonio en 3% de acetonitrilo / agua, pH final 9,0; y B es 100% de acetonitrilo.
   2. Sin apretar tapar la botella, colocarlo en un baño de ultrasonido agua, y someter a ultrasonidos durante 10 minutos sin calentamiento adicional. (Este paso es asegurarse de que todas las sales de amonio se disuelven por completo y que no hay burbujas de aire residuales.)
   3. Transferir 250 ml de disolvente a una botella de vidrio de 250 ml para el uso LC-MS, y mantener el resto a 4 ° C.
2. Preparar la solución de calibración rango de masa baja. Es importante utilizar una mezcla de calibración de gama baja masa a medida para aplicaciones de metabolómica para asegurar que las masas exactas se detectan en pesos moleculares bajos.
   1. Pesar 5 mg de ambos sodium fluoroacetato y ácido homovanílico y disolverlos en 5 ml de agua para hacer una concentración final de 1 mg / ml. Disolver diazinón en metanol para hacer una concentración final de 10 mg / ml.
   2. Para preparar 1 ml de la solución de calibración de masa negativa baja, mezclar 960 ml de solución de calibración térmica negativa con 20 ml de fluoroaceate de sodio y solución de ácido homovanílico. Para hacer 1 ml de solución positiva calibración baja masa, mezclar 990 ml de solución de calibración térmica positiva y 10 ml de solución de diazinon. (La solución de calibración de baja masa debe almacenarse a 4 ° C y ser preparado fresco cada 2 meses.)
3. Calibración de QE-MS en un rango bajo de masa
   1. Antes de realizar la calibración de bajo rango de masas, llevar a cabo una calibración de masas (m / z, 150-2,000) en los modos tanto positivos como negativos sobre la base de las instrucciones del fabricante.
   2. Una vez que pasa una calibración de masa regular, ajustar el rango de exploración de 60 a 900 m / z en el panel de control de instrumentosy se aplica un CID fuente de 25 eV para el modo positivo y 35 eV para modo negativo. (Esto le dará señales robustas del ión fragmento de la cafeína y el ión sulfato. El rango de exploración aquí es fijo, porque la última m / z no debe ser mayor de 15x de la m el inicio / z)
   3. Una vez que la fuente de iones es estable, a continuación, realizar la calibración personalizada. Nota: Una fuente estable se define como menos de 10% de la variación de la corriente total de iones en el modo positivo, y menos de 15% en modo negativo. Los iones de calibración correspondiente personalizados y m / z se enumeran en la Tabla 1.
4. Establecer la instrumentación LC-MS para el análisis de metabolitos polares. LC está acoplado a un QE-MS para la separación y detección de metabolito.
   1. Equipar el QE-MS con una sonda de ionización electrospray calentado (H-ESI). Establezca los parámetros de ajuste pertinentes para la sonda que se enumeran: la temperatura del calentador, 120 ° C; gas envolvente, 30; gas auxiliar, 10; barrer de gas, 3; voltaje, 3,6 kV para rociarmodo positivo y 2,5 kV para modo negativo. Ajuste la temperatura del capilar a 320 º C, y S-lente a 55.
   2. Construir un método de exploración completa de la siguiente manera: Completo Rango de escaneado: de 60 a 900 (m / z); Resolución: 70000; tiempo máximo de inyección: 200 mseg con tiempos típicos de inyección de alrededor de 50 ms; control automático de ganancia (AGC): 3.000.000 iones. Estos ajustes dan lugar a un ciclo de trabajo de alrededor de 550 ms para llevar a cabo exploraciones en modo positivo y negativo.
   3. Establecer el método de cromatografía. Emplear una columna de amida (100 x 2,1 mm di, 3,5 mm) para la separación de compuestos a temperatura ambiente ^13,15. La fase móvil A es como se describe anteriormente, y la fase móvil B es acetonitrilo. Utilice un gradiente lineal de la siguiente manera: 0 min, 85% de B; 1,5 min, 85% de B, 5,5 min, 35% de B; 10min, 35% de B, 10,5 min, 35% de B, 14,5 min, 35% de B, 15 min, 85% de B, y 20 min, 85% de B. El caudal es de 0,15 ml / min de 0 a 10 min y 15 a 20 min, y 0,3 ml / min 10,5 a 14,5 min.

2. Preparation de muestras de metabolitos

1. Preparar un disolvente de extracción. Mezclar 40 ml de metanol (LC-MS grado) y 10 ml de agua (LC-MS de grado) en un tubo de 50 ml, y mantenerlo en -80 ° C congelador durante al menos 1 hora antes de su uso. Nota: Este procedimiento y los pasos siguientes pueden ser modificados para la extracción de los tejidos biológicos y muestras de fluidos.
   1. Cultura de colon HCT cáncer de 8 celdas de tres platos de 10 cm o placas de 6 pocillos con medio de cultivo completo RPMI 1640 suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino y 100 mil unidades / l de penicilina y 100 mg / l de estreptomicina.
   2. Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia, retire rápidamente el medio, y colocar el plato o plato encima de ^13,15 hielo seco. Añadir 1 ml de disolvente de extracción inmediatamente (80% de metanol / agua), y transferir la placa a la -80 ° C congelador. Para un plato de 10 cm, añadir 3 ml de disolvente de extracción a cada pocillo. (Trate de eliminar el medio de tanto como sea posible para evitar el efecto de supresión de iones debido a las sales residuales del medio.)
   3. Deje la placa durante 15 minutos. Retire del congelador, y raspar las células en el disolvente en hielo seco. Transferir la solución a 1,7 ml de tubos Eppendorf, y se centrifuga a la velocidad de 20.000 xga 4 ° C durante 10 min. (Preparar metabolitos celulares de tres platos separados para hacer tres muestras replicadas. El propósito de mantener dos tubos es tener una como una copia de seguridad.)
   4. Transferir el sobrenadante a dos nuevos tubos Eppendorf, y secarlos en el vacío la velocidad. Esto toma alrededor de 3-6 horas dependiendo de la velocidad de vacío utilizado. (Las muestras también se pueden secar durante la noche bajo gas nitrógeno.)
   5. Después de tubos de secado, las tiendas de cada muestra en el -80 ° C congelador. Cuando esté listo, reconstituir una muestra en 20 ml de agua (LC-MS grado), e inyectar 5 ml de LC-QE-MS para el análisis.

3. Configuración de la secuencia de muestras

1. Una vez que la calibración se ha llevado a cabo correctamente en el QE-MS, LC equilibrar la columna durante 5 min con 85% A en un flujotasa de 0,15 ml / min, que es la condición de inicio de la gradiente de LC.
2. Establecer la secuencia de muestras en orden aleatorio. Nota: En este modo, se distribuye las fluctuaciones introducidas por el LC-MS a cada muestra y se asegura de comparación más precisa entre las diferentes muestras. Cada 6 muestras, añadir una carrera de lavado, que comparte el mismo método de MS, excepto el gradiente de LC es 95% de A durante 10 min y seguido de un equilibrado de la columna 5 min a 85% de A con una velocidad de flujo de 0,15 ml / min. Añadir muestras en blanco (100% de agua) después de cada carrera de lavado de evaluar el fondo del sistema y transferir los niveles.
3. Guarde la secuencia y una vez que la columna de la LC muestra la presión estable, en torno a 400 psi, comience la secuencia de ejecución. Si no hay otra muestra se debe ejecutar después de esta secuencia, a continuación, agregar una carrera parada en el final de la secuencia, que tiene un caudal de 0 ml / min en el final del degradado y seleccione "modo de espera" después de terminar el secuencia.
4. Vuelva a ejecutar el mismo conjunto de muestras de 12 horas después de la calibración. (Este is de evaluar la fluctuación de error en masa después de la calibración.)

4. Publicar Análisis de instrumentos de limpieza y mantenimiento

1. Al final de la secuencia, lavar la columna con 95% de A a una velocidad de flujo de 0,2 ml / min durante 2 horas, y si es necesario, invertir la columna antes de lavar.
2. Retire la columna de la LC y conectar directamente el LC a la fuente de iones por un sindicato. Preparar disolvente de limpieza, / metanol / ácido fórmico agua (v: v: v, 90:10:0,2), configurar MS en el modo de espera, y sistema de lavado de LC-EM a una velocidad de flujo de 0,1 ml / min durante 1 h para eliminar el residuo precipitó sales u otras impurezas. Baje la velocidad de flujo si hay demasiada presión en el sistema.
3. Ajuste la temperatura del capilar a 50 º C, y quite la jaula de iones. Retire cuidadosamente el cono de barrido de iones y el tubo de transferencia de iones después de la temperatura del capilar se reduce a 50 ° C. Utilice una malla en bruto, tales como papel de lija, para eliminar las impurezas que quedan en la superficie del cono de barrido de iones.
4. Coloque la transferencia de ionestubo en un tubo Falcon de 15 ml que contiene 10 ml de 90% de agua / metanol con ácido fórmico al 0,1%. Después de sonicación el tubo en un baño de ultrasonido de agua durante 20 minutos, se decanta el disolvente en el interior, reemplazarlo con 10 ml de metanol puro y someter a ultrasonidos durante otros 20 minutos. (Si es necesario, la sonicación se puede hacer a 40 ° C o una temperatura aún más alta para lograr mejores resultados de limpieza.)

5. Análisis de CL-EM de datos

1. Para asegurar la secuencia de muestras se ejecuta sin problemas, después de terminar las dos primeras muestras de la secuencia, compruebe picos de metabolitos desconocidos. Utilice un archivo csv lista nombres de metabolitos, fórmula química neutral y modo de detección (ya sea positivo o negativo), como archivo de entrada y el archivo de salida contiene picos extraídos y error masivo en ppm. Si la forma del pico es anormal o el error de masas es apagado por más de 5 ppm, entonces el resto de la secuencia tiene que ser detenido y solución de problemas que hay que hacer.
2. Elija el método de la "alineación picoy la extracción de fotograma "en el software disponible en el mercado. Seleccione datos en bruto de LC-MS y los de grupo. Elige muestras en el medio de la secuencia de ejecución como muestra de referencia para el pico de cromatografía de alineación. Subir una semilla marco incluyendo metabolitos conocidos para el análisis de metabolitos apuntado con los datos recogidos y la semilla marco correspondiente.
3. Lleve a cabo el análisis de datos en modo positivo y negativo por separado. Utilice la configuración predeterminada para otros parámetros. Desactive la función de búsqueda de base de datos y ejecutar el flujo de trabajo. Exportar los datos tratados como una hoja de Excel que contiene el área del pico de cada cuadro. Los primeros conjuntos de marcos corresponden a los metabolitos en la lista de destino. Nota: Para un análisis de metabolitos dirigida, se obtiene la información de los metabolitos en base a los estudios previos ^13,15.
4. Para un análisis de metabolitos no directo, elija el método de "extracción de componentes". Cargue las muestras en blanco para la sustracción de fondo. Establecer pico de intensidad umbral de unt 10 ^5, ancho de m / z de 10 ppm y relación señal a ruido de 3.
5. Utilice la base de datos para la identificación humana metabolome compuestos desconocidos. Utilice un filtro de CV para eliminar los componentes con grandes CVs en muestras repetidas. Manualmente a través de cada componente y elegir aquellos con pico bien definido-o relativamente gran diferencia en diferentes tipos de muestras para la búsqueda de base de datos. Exportar datos con hits en la base de datos. (Alineación pico podría ser evitada si la puntuación pico alineación es demasiado baja.)

Resultados

La exactitud de la metabolómica datos depende en gran medida del rendimiento del instrumento LC-QE-MS. Para evaluar si el instrumento está operando en buenas condiciones, y si el método aplicado es adecuada, varios picos LC metabolito conocido se extraen de la cromatografía de iones totales (TIC), como se muestra en la Figura 1. Metabolitos polares, incluyendo aminoácidos, productos intermedios de la glucólisis , intermedios TCA, nucleótidos, vitaminas, ATP, NADP ⁺ y así sucesivamente tienen ...

Discusión

Los pasos más críticos para el metabolito de perfiles éxito en células utilizando este protocolo son: 1) controlar el medio de crecimiento y cuidadosa extracción de las células; 2) ajustar el método LC basado en configuración de métodos MS para asegurar que hay suficientes generalmente por lo menos 10) puntos de datos (a través de un pico para la cuantificación; 3) hacer una calibración de baja masa antes de ejecutar muestras; 4) la inyección de no más de 5 ml para evitar tiempo de retención desplazamiento y ensanchamie...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla de calibración positiva	Thermo Scientific	#88323	Es sensible a la luz. Tienda a 4 & grados; C
Mezcla de calibración negativa	Thermo Scientific	#88324	Almacenar a 4 & grados; C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	Provoca irritación en los ojos, por lo que trabaja en la capucha. Tienda a 4 & grados; Inserto
de aguja C H-ESI Fisher	Scientific	#1303200	Este podría reemplazarse o limpiarse con ácido fórmico al 5% / agua (retire el anillo de goma) si está obstruido.
Se recomienda la columna de protección Waters		#186004860	para aumentar la vida útil de la columna.