Juxtasomal Biocitina Etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales

Summary

Para entender la estructura de las redes neuronales, la caracterización morfológica y funcional de las neuronas individuales es una necesidad. Aquí, nos demuestran etiquetado juxtasomal biocitina, la cual permite que los registros electrofisiológicos en la configuración extracelular, aún mantiene la capacidad de etiquetar de forma intracelular de la neurona para la reconstrucción post hoc de dendríticas y la arquitectura axonal.

Abstract

La corteza cerebral se caracteriza por múltiples capas y muchos tipos de células diferentes que juntos como una red son responsables de muchas funciones cognitivas superiores, incluyendo la toma de decisiones, el comportamiento sensorial guiada o la memoria. Para entender cómo estas redes neuronales complejas que de tales tareas, un paso crucial es determinar la función (o la actividad eléctrica) de tipos de células individuales dentro de la red, de preferencia cuando el animal está realizando una tarea cognitiva relevante. Además, es igualmente importante para determinar la estructura anatómica de la red y la arquitectura morfológica de las neuronas individuales para permitir la ingeniería inversa de la red cortical. Avances técnicos disponibles en la actualidad permiten el registro de la actividad celular en despierto, comportándose animales con la opción valiosa de post hoc identificar las neuronas registradas. Aquí, nos demuestran la técnica de etiquetado biocitina juxtasomal, que implica la acción de grabación de potenciómetroal clavar en la configuración extracelular (o floja-patch) utilizando pipetas de parche convencionales. La configuración de la grabación juxtasomal es relativamente estable y aplicable a través de condiciones de comportamiento, incluyendo anestesiado, sedado, despierto cabeza fija, e incluso en el animal se mueve libremente. Por lo tanto, este método permite la vinculación de tipo celular específico acción potencial durante Rematar comportamiento de los animales a la reconstrucción de las neuronas individuales y en última instancia, la totalidad de microcircuito cortical. En este manuscrito de vídeo, se muestra cómo las neuronas individuales en la configuración juxtasomal se pueden marcar con biocitina en ratas anestesiadas con uretano para la identificación post hoc y la reconstrucción morfológica.

Introduction

Redes neuronales consisten en múltiples tipos de células, que se caracterizan por propiedades morfológicas y fisiológicas altamente específicos ^1-7. Como consecuencia de ello, los tipos de células individuales realizan tareas especializadas dentro de la red (véase, por ejemplo Gentet et al. ⁸ y Burgalossi et al. ^9). Sólo estamos empezando a entender las funciones específicas del tipo de células a través de redes neuronales y queda aún mucho por descubrir. Para este fin, muchos laboratorios están aplicando enfoques experimentales que permiten el análisis de las propiedades morfológicas de la misma población neuronal de la que se han obtenido parámetros fisiológicos ^1,10-15. Aquí, se demuestra la técnica de etiquetado juxtasomal ^16,17 que implica registros electrofisiológicos usando pipetas de parche convencionales en la configuración extracelular (de este modo no invasivo) en combinación con la electroporación de la neurona registrada con biocitina. Laimportante ventaja de este enfoque es que la naturaleza no invasiva asegura que el potencial de acción Rematar de las neuronas individuales se registra sin alterar (por ejemplo, diálisis) el contenido intracelular de la célula. Seguido por electroporación, el enfoque juxtasomal proporciona la opción de identificación post hoc celular y la reconstrucción de enlace de función (fisiología) a la estructura (morfología). Típicamente, la reconstrucción morfológica consiste en la reconstrucción de la morfología dendrítica y axonal que se puede extender a la cuantificación de la columna vertebral y / o Bouton densidades o incluso la reconstrucción de la morfología neuronal en resolución nanométrica utilizando microscopía electrónica. La técnica de grabación juxtasomal se puede utilizar para las grabaciones en vivo de varios tipos de células a través de las capas corticales o en áreas subcorticales en una gama de especies, aunque la mayoría de los estudios han aplicado la técnica en pequeños roedores tales como ratones o ratas. Nuestra investigación se centra en el registro y etiquetado de las neuronasde rata corteza somatosensorial primaria (S1) e implica la identificación visual de las neuronas registradas ^18, reconstrucciones dendríticas en combinación con un registro preciso en un marco de referencia estandarizada para ingeniería inversa redes corticales ^4,19 y reconstrucción detallada de la arquitectura axonal caracterizar específica del tipo celular local y proyección a largo plazo dirigido a ^20.

En comparación con las técnicas de grabación en vivo alternativas (intracelulares o de células enteras), grabaciones juxtasomal son relativamente estables y por lo tanto pueden aplicarse a distintos estados de comportamiento incluyendo anestesiado ^21,22, sedados ^14, Pista de los animales-fijo ^23, o incluso se mueven libremente despiertos ⁹ . Aquí, mostramos etiquetado juxtasomal en S1 de una rata anestesiada con uretano, aunque hacemos hincapié en la aplicabilidad general de esta técnica para muchas preparaciones de elección.

Protocol

1. Preparación del animal

Todos los procedimientos experimentales se llevan a cabo de conformidad con la ley holandesa y después de una evaluación por un comité de ética local de la Universidad VU de Amsterdam, Países Bajos.

1. Anestesiar a un rata Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) con isoflurano (2-3% en oxígeno) y, posteriormente, con uretano (20% en 0,9% de NaCl, 1.6 hasta 1.7 g / kg) por inyección intraperitoneal. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante la supervisión de la retirada pellizco, los reflejos palpebrales, y los movimientos de vibrisas.
2. Administrar una dosis adicional de uretano (10% de la dosis inicial) en caso de que el animal no llega a suficiente profundidad de la anestesia o cuando se observan espasmos vibrisas durante el curso del experimento.
3. Colocar el animal anestesiado en el marco estereotáxico equipado con una almohadilla eléctrica, inserte la sonda de temperatura rectal y mantener la temperatura corporal del animal a 37,5 ± 0,5 ° C por una almohadilla térmica.
4. posición de la cabeza del animal en el marco estereotáxico; cortar el pelo en la parte superior de la cabeza con unas tijeras para hacer que la piel visible.
5. Inyectar 100 l 1% de lidocaína (en 0,9% de NaCl) por vía subcutánea para la anestesia local en el sitio de operación y esperar 3-5 minutos. Retire la piel que cubre la superficie del cráneo por el corte en la dirección-caudal a rostral y limpiar el tejido restante.
6. Limpiar el cráneo extensamente con 0,9% de NaCl y hisopos absorbentes.
7. Determinar las coordenadas de la zona de destino en el hemisferio izquierdo (para la corteza somatosensorial primaria (S1): 2,5 mm posterior y 5,5 mm lateral al bregma). Marque la ubicación en el cráneo con un rotulador quirúrgico de la piel.
8. Raspar el hueso suavemente por un taladro dental de la región de interés hasta que el hueso se vuelve transparente y los vasos sanguíneos son claramente visibles.
9. Hacer un 0,5 mm x 0,5 mm craneotomía mediante la reducción de una ventana en el cráneo adelgazada con un escalpelo (# 11), evitando daños a la duramadrey los vasos sanguíneos. Opcional: marca los bordes de la craneotomía utilizando un rotulador quirúrgico de la piel para mejorar la visibilidad.
10. Aplicar una capa delgada de pegamento en el cráneo seco y luego cemento dental para construir un baño (es decir, cámara de registro) que encierra la craneotomía.
11. Recorte los bigotes en el lado contralateral a exactamente 5 mm desde el folículo bigote. Opcional: poner de relieve los bigotes cortados con rímel negro.

2. Juxtasomal Grabaciones y Biocitina Etiquetado

1. Hacer pipetas de parche de vidrio de borosilicato con diámetro de la punta dentro de ~ 1 m para obtener electrodos con 3-5 MΩ de resistencia. Nota: La morfología de la pipeta ideal para la grabación juxtasomal es una reducción gradual esbelto, un ángulo de cono y un ~ 1 m de la punta (Figura 1).
2. Dependiendo de la profundidad de grabación (con respecto a la superficie de la pía madre), las dimensiones de la forma cónica del electrodo de registro se deben ajustar. Es de importancia crítica es que tque se estrechan diámetro debe ser inferior a 75 micras, con punto de entrada en el cerebro para evitar daños mecánicos o estrés en el área de grabación. Esto indica que para las grabaciones corticales superficiales, se requiere una conicidad de 300-500 micras con un diámetro exterior máximo de 75 micras (Figura 1A), mientras que las grabaciones de relativamente profundas capas corticales requieren una conicidad más largo de 1.500-1.800 m, de nuevo con máxima externa diámetro de 75 micras (a 1.800 m de la punta del electrodo).
3. Cargue el parche pipeta con el timbre de la rata normal (NRR), complementado con un 2% biocitina (véase la Tabla 1 para las soluciones y reactivos) y montar el parche pipeta en una etapa de la cabeza fija a un micromanipulador.
4. Ajuste el ángulo del soporte de electrodo a 34 ° con respecto al plano sagital para dirigirse específicamente a la columna de la D2 de S1 de rata.
5. Conecte la etapa de la cabeza a un amplificador en modo puente (es decir, la pinza de corriente).
6. Coloque el parchepipetear en estrecha proximidad a la craneotomía. Llene la bañera con 0,9% de NaCl y determinar la resistencia del electrodo que debe estar entre 3-5 MΩ, evaluada mediante la aplicación de un pulso cuadrado con inyección de corriente positiva (1 nA, 200 msec on / off).
7. Establecer sobrepresión de 100 a 150 mbar y avanzar en la pipeta de parche en 1 m pasos mientras se aplica corriente positiva en forma de pulsos cuadrados (1 nA, 200 msec on / off). Monitorear el cambio de resistencia robusta al establecer contacto con la duramadre. En este punto, establecer las coordenadas del micromanipulador para "cero" para permitir mediciones precisas de la profundidad.
8. Avanzar en 1 m en modo paso hasta que el parche pipeta penetra la duramadre se indica por un descenso brusco de la resistencia del electrodo. Quite la presión de mantenimiento de la pipeta.
9. Búsqueda de unidades individuales mientras se avanza en 1 m pasos. Vigilar la resistencia del electrodo de forma continua mediante la aplicación de 200 ms on / off pulsos. Un aumento de la resistencia del electrodo typicaliado indica la proximidad de una sola neurona. Haga avanzar el electrodo hasta que el potencial de acción positiva (AP) formas de onda de ~ 2 mV se registran (Figuras 2A y 2B).
10. Opcional: grabar el patrón Rematar espontánea de la neurona y determinar bigote-evocado clavar por, por ejemplo, desviando caudalmente barbas individuales para 200 mseg en un ángulo de 3,3 ° utilizando un dispositivo piezoeléctrico ^18.
11. Haga avanzar el electrodo hasta que la resistencia es 25-35 MΩ y picos tienen amplitudes de 3-8 mV para obtener condiciones óptimas de llenado juxtasomal. Inicie el llenado juxtasomal aplicando pulsos cuadrados de corriente positiva (1 nA, 200 ms on / off). Poco a poco y gradualmente aumentar la corriente por pasos de 0,1 nA mientras que el control de la forma de onda de AP y la frecuencia (Figuras 2A y 2B).
12. Supervisar la apertura de la membrana como un claro aumento en la frecuencia de AP durante la fase en el pulso de bloque (Figura 2C ). La forma de onda de pico durante el llenado muestra un aumento de la anchura y la reducida (Figuras 2C y 2D) post-hiperpolarización. Parámetros adicionales incluyen el aumento de ruido o una pequeña (1-5 mV) cambio negativo de CC.
13. Aumenta o disminuye la corriente (1 nA) durante el llenado para mantener la infusión biocitina estable. Reducir o detener los impulsos de corriente en aumento repentino de la frecuencia AP para evitar la toxicidad por el exceso de afluencia de iones extracelulares, tales como iones de sodio. Nota: cada neurona responde de manera diferente a la inyección de corriente y juxtasomal parámetros de etiquetado deben ser ajustados en función de las condiciones de grabación individuales.
14. Seguir de cerca la señal después de detener la inyección de corriente. La forma de onda pico después de una sesión de relleno se suele ampliarse y muestra una fuerte reducción después de hiperpolarización. Esperar a que la recuperación de la neurona, que es evidente cuando la forma de onda de pico vuelve a sus propiedades originales (es decir, presencia denormal, la figura post-hiperpolarización 2).
15. Repita biocitina llenar sesiones después de la recuperación completa de la neurona para aumentar la carga biocitina para mejorar la calidad de la tinción.
16. Retraer la pipeta de parche en pasos de 1 m hasta que la amplitud pico disminuye para reducir cualquier tensión mecánica a la célula. Espere por lo menos 1 hora para la biocitina para difundir de forma intracelular, mientras que de cerca el seguimiento de la temperatura corporal del animal y de la respiración.

3. Perfusión del animal y extracción del cerebro

1. Preparar la configuración de la perfusión, enjuague y precargar el tubo con 0,9% de NaCl.
2. Coloque el animal sobre una bandeja quirúrgica y asegurar con cinta de etiquetado estándar. Asegurar suficiente profundidad de la anestesia; pizca pie y los reflejos de los párpados deben estar ausentes.
3. Hacer una incisión medial a lateral (5-6 cm) a través de la pared abdominal justo debajo de la caja torácica y proceder en la dirección posterior-anterior para exponer el esternón.Tire del esternón por delante y separar cuidadosamente el hígado desde el diafragma.
4. Hacer una pequeña incisión en el diafragma, cortar a través de las costillas inferiores y continuar la incisión a lo largo de toda la longitud de la cavidad abdominal para exponer el corazón.
5. Retire el pericardio.
6. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo y hacer una incisión en la aurícula derecha. Perfundir con 0,9% de NaCl (~ 8 ml / min) hasta la decoloración del hígado es completa.
7. Cambie la infusión de 4% de paraformaldehído (PFA), hasta que la rigidez de la pata delantera y la mandíbula inferior es aparente.
8. Decapita a la rata con un par de tijeras
9. Quitar los músculos del cuello que quedan y exponer el cráneo completo.
10. Coloque las tijeras en el tronco cerebral en la parte dorsal y cortar el hueso con cuidado a lo largo de la sutura sagital, el mantenimiento de la posición dorsal.
11. Retirar los huesos de ambos lados de la sutura sagital para exponer el cerebro usando fórceps. Retire con cuidado la duramadre para evitar damage.
12. Inserte con cuidado una espátula roma para la parte ventral del cerebro y quitar el cerebro suavemente.
13. Posterior a arreglar toda la noche a la mañana en el cerebro PFA a 4 ° C. Cambie el cerebro a tampón fosfato 0,05 M (PB) y almacenar a 4 ° C.

4. Cortando el cerebro en las secciones tangenciales

1. Tome el cerebro fuera de la M PB 0.05 y lo puso en un papel de filtro frente anterior. Utilice una hoja de afeitar afilada para cortar el cerebelo a lo largo del plano coronal y separar los hemisferios cortando a lo largo mediados el plano sagital.
2. Aplique pegamento en la plataforma de montaje y montar el hemisferio izquierdo en su plano sagital con anterior frente a la derecha. Asegure la plataforma de montaje en un ángulo de 45 ° en un vibratome y sumergir el cerebro en 0,05 M PB.
3. Asegure una hoja de afeitar en la vibrátomo y asegurarse de que el primer contacto con la superficie del cerebro se encuentra en el centro del plano anterior-posterior del hemisferio. Cortar 24 100 msecciones y recogerlas en una placa de 24 pocillos que contenía 0,05 M PB.

5. Procedimientos histológicos

1. Realizar protocolos histológicos para la tinción citocromo oxidasa ²⁴ y el método de avidina-biotina-peroxidasa de acuerdo con los métodos descritos previamente ^25. Opcional: visualice biocitina utilizando conjugados de avidina fluorescente / estreptavidina-Alexa. Esto permite, además, de doble tinción con técnicas de rastreo retrógrado o anterógrado.
2. Secciones de lavado de 5 x 5 min con 0,05 M PB y preparar el tetrahidrocloruro 3,-3'-diaminobencidina (DAB) solución para la tinción de la citocromo oxidasa de visualizar barriles en la capa 4 (L4) de S1-que contiene (véase la Tabla 2 para las soluciones y reactivos). Incubar las secciones 6-12 de la pia en la solución precalentado durante 30 a 45 min a 37 ° C.
3. Enjuague secciones con 0,05 M PB de 6 x 5 min y la amortiguación actividad peroxidasa endógena por incubación de todas las secciones en el 3% de H ₂ O ₂ en PB 0,05 M durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
4. Enjuague secciones con 0,05 M PB de 5 x 10 min. Incubar las secciones en ABC-solución (véase la Tabla 3 para las soluciones y reactivos) la noche a 4 ° C.
5. Enjuague secciones con 0,05 M PB de 5 x 10 min y preparar la solución de DAB para visualizar la neurona biocitina lleno (véase la Tabla 4 para las soluciones y reactivos). Incubar las secciones en solución filtrada durante 45-60 min a TA.
6. Enjuague secciones con 0,05 M PB de 5 x 10 min. Mount secciones sobre portaobjetos de microscopio y cubreobjetos con Mowiol (véase la Tabla 5 para las soluciones y reactivos).
7. Determinar la calidad del etiquetado mediante microscopía de luz.

Results

El conocimiento detallado de la estructura 3D de las neuronas individuales es crucial para elucidar los principios organizativos de las redes neuronales. Nuestro método consiste en una tubería para lograr etiquetado biocitina alta calidad a partir de una preparación in vivo, lo que permite la clasificación de puestos neuronal hoc y la reconstrucción detallada de la arquitectura dendrítica y axonal de las neuronas individuales en alta resolución. Dependiendo de la calidad de etiquetado juxtasom...

Discussion

El método juxtasomal permite la grabación en vivo de acción potencial enriquecidas a partir de unidades individuales a través de las condiciones de comportamiento (anestesiados, despierto cabeza fija o moviéndose libremente) con la opción de biocitina-etiquetar la neurona registrada en post hoc clasificación de tipos de células y / o reconstrucción 3D. La principal ventaja es obtener parámetros fisiológicos en la configuración extracelular (de este modo no invasivo), sin embargo, ser capaz de etiquetar...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de control SM-6	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulador Amplificador X2
Lynx-8	Amplificador Neuralynx
Axoclamp-2B	Axon Instruments
Osada modelo EXL-M40	Osada, Inc.
Dispositivo piezoeléctrico	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, EE. UU.		LabView software
de adquisición Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, Universidad de Columbia, NY
Hisopos absorbentes Sugi	Kettenbach	30601
Citocromo C de corazón equino	Sigma	C2506
Catalasa de hígado bovino	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain estándar ABC-kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Uretano	Sigma	U2500
Isoflurano	Pharmachemie	45.112.110
Lidocaína	Sigma	L5647
Simplex cemento dental rápido	Kemdent	ACR308/ACR924
Biocytin	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
Trizma base	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Glicerol de grado analítico	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072