Artículo de método

Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus

DOI:

10.3791/51362

⸱

26 de junio de 2014

 ,  , 
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El virus de la hepatitis C (VHC) es un importante patógeno humano que causa trastornos hepáticos, como cirrosis y cáncer. Un sistema de cultivo de células infecciosas del VHC es esencial para comprender el mecanismo molecular de la replicación del VHC y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. Aquí describimos un protocolo para investigar varias etapas del ciclo de replicación del VHC.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virus de Hepatitis C (VHC) afecta a 3% de la población mundial y causa graves enfermedades del hígado incluyendo hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular. El VHC es un virus de ARN con envoltura que pertenece a la familia Flaviviridae. El tratamiento actual no es totalmente eficaz y causa efectos secundarios adversos. No existe una vacuna contra el VHC disponible. Por lo tanto, se requiere un esfuerzo continuado para el desarrollo de una vacuna y mejor terapia. Un sistema de cultivo celular VHC es crítica para el estudio de varias etapas de crecimiento del VHC incluyendo la entrada del virus, la replicación del genoma, el envasado, y la salida. En el procedimiento actual presentado, se utilizó un virus de tipo salvaje intragenotype 2a quimérico, FNX-VHC, y un virus FNX-Rluc recombinante que lleva un gen indicador de luciferasa de Renilla para estudiar la replicación del virus. Una línea celular de hepatoma humano se utilizó (basa Huh-7) para la transfección de transcritos in vitro de VHC ARN genómicos. Sobrenadantes de cultivo libres de células, lisados ​​de proteínas y tARN otal se recogieron en varios puntos de tiempo después de la transfección para evaluar el crecimiento del VHC. VHC estado de la replicación del genoma se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa y la visualización de la presencia de VHC ARN de doble cadena. La expresión de la proteína del VHC se verificó por transferencia de Western y ensayos de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para las proteínas del VHC NS3 y NS5A. Células transfectadas de ARN del VHC liberadas partículas infecciosas en sobrenadante de cultivo y el título viral se midió. Se utilizaron ensayos de luciferasa para evaluar el nivel de replicación y la infectividad del VHC reportero. En conclusión, se presentan varios ensayos virológicos para la caracterización de las diferentes etapas del ciclo de replicación del VHC.

Introducción

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Virus de Hepatitis C (VHC) causa la cirrosis y cáncer de hígado. Afecta a 170 millones de personas en todo el mundo, con 350.000 personas que mueren cada año 1-3. El VHC es un virus ARN de cadena positiva con un tamaño de genoma de 9,6 kb. El genoma del HCV se traduce como una sola poliproteína de ~ 3.000 residuos de aminoácidos que se escinde proteolíticamente por diversas proteasas celulares y virales en 10 polipéptidos. VHC es el virus prototipo del género Hepacivirus y pertenece a la familia Flaviviridae 4. Tras la exposición, el VHC establece la infección crónica en el 80% de los individuos. La infección generalmente es asintomática y oportuno diagnóstico puede permitir la intervención terapéutica para evitar el deterioro del hígado. El tratamiento actual es subóptimo y no se dispone de vacuna 5,6.

La etiología de la hepatitis C fue descrita por primera vez en 1989 7. Estudiar la replicación del VHC es importante para la vacuna contra la hepatitis C y la investigación del tratamiento, pero había sidolargo obstaculizada por la falta de un sistema de cultivo viral eficiente. Un clon molecular del VHC ha demostrado ser infecciosa en los chimpancés a la inoculación intrahepática 8. Posteriormente, replicones del VHC sub-genómicas se describen, lo que permitió a diseccionar la etapa de la replicación del genoma viral en un 9,10 sistema de cultivo celular. El descubrimiento de un VHC genotipo 2 bis aislar JFH-1 (hepatitis fulminante-1 japonés), capaz de infectar un cultivo celular abierto nuevas vías para la investigación la replicación del VHC 11-13. Cepa del genotipo 2 bis JFH-1 basada virus quiméricos inter e intra-genotípica y el genotipo 1 del VHC sistemas de cultivo basados ​​infecciosas son disponibles también 14-18.

Hemos utilizado con éxito JFH-1 cepa y VHC intragenotype 2a virus quimérico obtener el mapa de alta resolución del perfil funcional de los dominios de la proteína y cis-elementos que actúan de ARN 19,20. De acuerdo con esto, aquí se describe un sistema de cultivo eficaz utilizado rutinariamente que permiteel estudio de las diversas etapas del ciclo de replicación del VHC y la interacción huésped-patógeno. Presentamos los ensayos virológicos para evaluar la replicación del genoma viral y la infectividad de novo de intragenotype VHC 2a y un reportero de VHC basado en la luciferasa de Renilla.

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Protocolo

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Un esquema general del protocolo se ilustra en la Figura 1.

1. Las células

  1. Preparar medio de crecimiento completo que contiene suero de 10-15% de bovino fetal (FBS), 10 mM de aminoácidos no esenciales, 10 mM de Hepes, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml), y 2 mM de L-glutamina.
  2. Mantener Huh-7.5.1 células 13 en medio de crecimiento completo que contienen los suplementos anteriores para el análisis in vitro de la hepatitis C ciclo de replicación viral.
  3. Cepas virales Cultura en Huh-7.5.1 células con el medio de cultivo complementado especificada a 37 ° C con 5% de CO 2.

2. Virus y Construcciones de plásmidos

  1. Generar la forma complementaria de ADN (ADNc) del ARN del VHC y clonar en un vector plásmido para la facilidad de manipulación genética. Nota: El descubrimiento de los japoneses hepatitis fulminante 1, JFH-1 (genotipo 2a HCV), aísle ha sido fundamental para la investigación y el VHC esutilizado principalmente para estudiar el ciclo de 11-13 replicación del VHC. Virus quiméricos inter e intragenotypic basados ​​en JFH-1 del VHC se utilizan comúnmente en la investigación 14-18. Construcción de intragenotype 2a sintética virus quimérico, FNX-VHC, y una cepa reportera quimérico monocistronic fue descrito previamente 19 y los detalles de construcción están más allá del alcance de este protocolo.
  2. Utilice el virus intragenotype 2a pFNX-VHC, ya que contiene una NTR 5 ', regiones y P7 estructurales, y parte de las regiones no estructurales NS2 (nucleótidos 1 hasta 2878) de la cepa parental J6CF (NCBI n º de acceso. AF177036), como así como los componentes no estructurales de la JFH-1 cepa viral (NCBI n º de acceso. AB047639). Nota: FNX-VHC se sintetizó basándose en la secuencia de Jc1 intragenotype 2a VHC quimérico se informó anteriormente 15.
  3. Generar un constructo monocistrónico quimérico reportero viral, el pFNX-Rluc, basado en la cepa pFNX-VHC (antes en la etapa 2.2) mediante la inserción de un Rgen de la luciferasa enilla entre el 5 'NTR y el gen del núcleo (entre nt 388 y 389). Posteriormente, conecte el gen de la luciferasa y el gen del núcleo de esta construcción usando un 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A) secuencia del péptido, que funcionaría como una señal de la escisión.
  4. Ingeniero de la ARN polimerasa nulo (Pol-) construcción viral utilizando el pFNX-VHC o el fondo viral pFNX-Rluc. Reemplazar los residuos catalíticos de la polimerasa NS5B, GDD (aa 2759-2761; nt 8615 a 8.623), de cualquiera de estas cadenas principales virales con residuos de aminoácidos de la AAG.

3. In vitro el ARN del VHC Transcripción

  1. Utilice un intragenotype 2a quimérico virus FNX-HCV y nulo Pol FNX-HCV (Pol-) HCV para la evaluación de la replicación viral (Figura 2A).
  2. Linealice los plásmidos virales con la enzima de restricción XbaI y después tratar con nucleasa de judía mung para generar extremos romos. Purifica los plásmidos digeridos por cromatografía de intercambio de aniones. Verificar la integridad of el plásmido linealizado de ADN sometiendo a electroforesis en gel de agarosa (Figura 2B).
  3. Transcribir los plásmidos virales linealizadas utilizando la T7 ARN polimerasa.
  4. Se purifica el ARN tratado con DNasa recién sintetizado usando un kit de purificación de ARN.
  5. Verifique la producción de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 2C).
  6. Cuantificar el RNA por espectrofotometría.
  7. Almacenar el ARN generados en -80 ° C en 10 g alícuotas de trabajo. Nota: Para minimizar la variación de la calidad del ARN dentro de cada diseño experimental por la transcripción de todos los ARN para cada muestra viral y de control al mismo tiempo.

4. VHC ARN transfección y toma de muestras

  1. Recoger las células Huh-7.5.1 usando tripsina.
  2. Para enjuagar las células, centrifugar y resuspender la suspensión dos veces con los medios de comunicación en frío bajo suero. Resuspender las células en medios de baja de suero con 1 x 10 7 células por ml.
  3. Mezclar con un total de 10 & #956; g de ARN viral transcrito con 400 l de células resuspendidas (4 x 10 6 células) en una cubeta de electroporación de 0,4-cm. Transfectar las células mediante electroporación a 270 V, 100 Ω y 950 mF.
  4. Resuspender las células a electroporación en 10 ml de medio de crecimiento completo con 15% de FBS. Nota: El aumento de la supervivencia de las células sometidas a electroporación se observa cuando las células Huh-7.5.1 se cultivaron en 15% suero bovino fetal.
  5. Placa de las células en los dos matraces T-25 (~ 1,2 x 10 6 células por matraz) y las placas de 48 pocillos (1 x 10 4 células por pocillo) para cada uno de los siguientes puntos de tiempo: 4, 48 y 96 h.
  6. Reemplazar los medios de comunicación a 4-8 h después de la transfección con medio de crecimiento suplementado fresco con 10% de FBS para eliminar los residuos de células muertas de los matraces y placas de cultivo.
  7. Sobrenadantes de cultivo celular de cosecha en los 48, 96 puntos de tiempo hr y eliminar los desechos celulares de las muestras recogidas por centrifugación de las células a 1.500 rpm durante 10 min a 4 º C.
  8. Almacene los sobrenadantes libres de células a -80 º C. Lisar las células para la proteína y el análisis por Western blot de ARN y la transcripción inversa-PCR cuantitativa en los puntos de tiempo indicados.

5. Transcripción inversa-PCR cuantitativa (RT-qPCR) para la evaluación de las copias del VHC Genoma

  1. Realice una de dos etapa de RT-qPCR para determinar el número de copias de ARN genómico del VHC.
  2. Transcribir inversamente 1 g de ARN celular total utilizando la transcriptasa inversa y un cebador específico para el VHC cadena con sentido que se une a NTR 5 '(JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') o un cebador específico para el gen de mantenimiento peptidilprolil isomerasa G (R ppig : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 '). También transcribir inversamente FNX-HCV RNA (generado en el paso 3) de copias del genoma conocidos (enero 10-09 10 estándar), utilizando el sentido del VHC primer capítulo.
  3. Llevar a cabo qPCR utilizando 50 ng del ADNc transcrito resultante utilizando cebadores específicos de HCV (JFH RTQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 ') y el ADN vinculante tinte verde que contiene qPCR súper mezcla. Realice qPCR para la limpieza gen ppig también (cebadores ppig F: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 '; ppig R: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3') Nota: Para calcular el nivel de ARN del VHC intracelular exacta a través de muestras, utilice gen de mantenimiento celular, ppig , el nivel de expresión (ciclo Ct) para la normalización. Utilice el número de copias del genoma FNX-VHC como el estándar para la determinación del número de copias.
  4. Utilice las siguientes condiciones cuando se ejecuta qPCR para determinar el número de copias de ARN del VHC: 95 º C durante 15 segundos y 60   º C durante 30 segundos (40 ciclos) usando el sistema de PCR en tiempo real.
  5. Véanse las Figuras 3A y 3B para resultados replicación del genoma.

6. Análisis Western Blot para detectar la expresión de proteínas del VHC (Figura 3C)

  1. Utilice lisados ​​de células FRARN viral om transfectadas a 96 h después de la transfección de proteínas análisis Western Blot.
  2. Resolver el lisado celular utilizando SDS-PAGE y transferencia de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
  3. Bloquear la membrana utilizando una solución de bloqueo que contiene leche desnatada 5%, 0,2% de Tween 20 en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  4. Incubar la membrana con el anticuerpo primario monoclonal de ratón NS3 (1 en 1000 de dilución) y beta-actina (1 en 5000 de dilución).
  5. Añadir IgG de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (1 en 5000 de dilución) y detectar por quimioluminiscencia.

7. Ensayo de inmunofluorescencia (IFA)

  1. Fijar las células infectadas con el VHC y se transfectaron usando metanol durante 30 min a -20 º C para el ensayo de inmunofluorescencia.
  2. Lavar la célula con PBS tres veces y bloquear con tampón de bloqueo IFA.
  3. Utilice conejo policlonal anti-NS5A principalmente anticuerpo (amablemente proporcionados por el doctor Dasgupta, UCLA) o monoclonales de ratón anti-DSRNA J2 anticuerpo a una dilución de 1:200 (1 mg / ml) y se incuba durante 5 horas a la noche a 4 º C.
  4. Lavar las células con PBS tres veces después de que el anticuerpo primario.
  5. Añadir cabra anti-IgG de conejo-488 anticuerpo secundario policlonal o anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-594 anticuerpo secundario policlonal a una dilución 1:1.000 (1 g / ml) e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
  6. Lavar las células con PBS tres veces y núcleos de tinción utilizando colorante Hoechst y vista con microscopio de fluorescencia (Figura 3D).

8. Titulación de medición Virus

  1. Ingenuos células Plate Huh-7.5.1 en aproximadamente 3 x 10 3 células / pocillo utilizando una placa de 96 pocillos. Al día siguiente, realizar diluciones seriadas de 10 veces de sobrenadante de cultivo libre de células recolectadas a partir de células transfectadas de ARN del VHC utilizando medio de cultivo e inocular por triplicado en Huh-7.5.1 células.
  2. Fijar las células a las 72 horas después de la infección usando metanol (durante 30 min a -20 º C) y la inmunotinción de la proteína NS5A del VHC como se indica en la sección 7.
  3. Utilice la dilución más alta que contar para los focos NS5A positivo y calcular el número medio de foco unidad de formación (UFF) por mililitro. Consulte la Figura 4 para el título del VHC.

9. Renilla Luciferase reportero de ensayo para el genoma viral de replicación e infectividad

  1. Para la evaluación de la replicación del genoma viral, Huh-7.5.1 células de ARN-VHC a electroporación placa por triplicado en placas de 48 pocillos (1 x 10 4 células / pocillo).
  2. Lyse las células con 75 l de tampón de lisis pasiva al 6 horas, 48 ​​horas y 96 horas después de la transfección.
  3. Rock the placas suavemente durante 15 minutos a temperatura ambiente y se almacena a -80 º C.
  4. Para medir la actividad enzimática de luciferasa de Renilla, descongelar el lisado de proteínas y la luciferasa de Renilla reactivos de ensayo a temperatura ambiente.
  5. Añadir 20 l de lisado de proteína por pocillo de una 96-WEL l placa luminiscencia blanca y coloque la placa en un luminómetro.
  6. Vierta 100 l de Renilla luciferasa reactivo de ensayo (sustrato coelenterazina + buffer) por pozo y después de un retraso de 2 segundos antes de la lectura; integrar la luz emitida por 10 seg.
  7. Calcular la media y la desviación estándar para cada muestra a partir de los valores de luciferasa de triplicados biológicos y someter los datos a análisis estadístico (Figura 5).
  8. Para evaluar la infectividad, inocular 500 l de sobrenadante libre de células obtenidas a partir de células de ARN-VHC transfectadas para el tiempo indicado puntos (48 hy 96 h), por triplicado, en células de los animales Huh-7.5.1 en placas de 48 pocillos.
  9. Vuelva a colocar el inóculo viral con 500 l de medio fresco por pocillo después de las 6 horas después de la infección.
  10. Lisar las células en 48 horas después de la infección y sujetos a ensayo de luciferasa de Renilla tal como se describe en los pasos 8.2 a 8.7 (figura 5).
í tulo "> 10. Análisis estadístico

  1. Las barras de error en los gráficos indican las desviaciones estándar (DE). Los valores de p se calcularon por el test t no apareado.

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Resultados

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Virus de la hepatitis C es un virus de ARN. Por lo tanto para el propósito de la manipulación genética, el ADNc genómico del VHC ha sido clonado en un plásmido vector bacteriano. Una secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 se introdujo inmediatamente antes del extremo 5 'del genoma del VHC. Un esquema general de flujo de trabajo de análisis de VHC se presenta en la Figura 1. Para generar ARN genómico del VHC con el extremo precisa 3 ', del genoma del VHC que contiene el plásmido se cortó con...

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Discusión

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Esta ilustración describe un método para analizar el ciclo de replicación de la hepatitis C virus. HCV es un patógeno humano y el protocolo de bioseguridad prescritas tendrá que ser seguido estrictamente. Sistemas de cultivo celular de VHC infecciosas se han descrito anteriormente 11-13,16,17. Hay algunos puntos cruciales que implementamos cuando se sigue el protocolo ilustrado. En primer lugar, es de gran importancia para tener una buena calidad de intacta longitud viral ARN genómico completo para estudios p...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a F. Chisari por proporcionar la línea celular Huh-7.5.1. Nos gustaría agradecer a Justine Ho por editar el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Premio de Investigación Programática Institucional del Centro Médico Cedars-Sinai y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, Subvención UL1TR000124 a V.A.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)Fisher Scientific10-017-CV
Aminoácido no esencialFisher ScientificMT25025CI
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
Opti-MEM Medio de suero reducido, sin fenol RedLife Technologies11058-021
Huh-7.5.1de Investigación ScrippsLa línea celular fue amablemente proporcionada por el Dr. Francis Chisari al Dr. Arumugaswami en virtud de la MTA ejecutada entre el Instituto de Investigación Scripps y el Centro Médico Cedars-Sinai
Plásmidos (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc y pFNX-Rluc Pol null) Médico Cedars-SinaiLos plásmidos del VHC fueron sintetizados por el Dr. Arumugaswami utilizando oligonucleótidos superpuestos.
XbaINueva Inglaterra Biolabs Inc.R0145S
Nucleasa de frijol mungoNueva Inglaterra Biolabs Inc.M0250S
T7 RiboMAX Express Sistema de producción de ARN a gran escalaPromegaP1320
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
Cubeta de electroporación (4 mm)BioexpressE-5010-4
Gene Pulser Xcell TotalSystem Bio-Rad165-2660
anticuerpo monoclonal anti-dsRNA de ratón J2 Inglés & Consultoría Científica Kft.
Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA11008
Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
Paquete de membrana PVDFBio-Rad162-0263
Bloqueador de grado secante Leche en polvo descremadaBio-Rad170-6404XTU
Tween-20Bio-Rad170-6531XTU
Anticuerpo NS3 contra el virus de la hepatitis C [8 G-2]Abcamab65407
Anticuerpo NS3 contra el virus de la hepatitis C [H23]Abcamab13830
IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc.115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Reactivos de detección GE Healthcare Ciencias de la VidaRPN2236
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX con ROXSistema
ViiA 7Kit
RenillaPromegaE2810
DNasa libre de ARNasaPromegaM6101
Sistema de detección múltiple GloMax-(luminómetro)Promega
El Instituto Centro 10010200Sistema de PCR en tiempo real de PCR en tiempo real Life Technologies 11744500 de sistema de ensayo de luciferasa Life Technologies NA

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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