Un protocolo para el análisis de la hepatitis C de replicación del virus

Summary

El virus de la hepatitis C (VHC) es un importante patógeno humano que causa trastornos hepáticos, como cirrosis y cáncer. Un sistema de cultivo de células infecciosas del VHC es esencial para comprender el mecanismo molecular de la replicación del VHC y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. Aquí describimos un protocolo para investigar varias etapas del ciclo de replicación del VHC.

Abstract

Virus de Hepatitis C (VHC) afecta a 3% de la población mundial y causa graves enfermedades del hígado incluyendo hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular. El VHC es un virus de ARN con envoltura que pertenece a la familia Flaviviridae. El tratamiento actual no es totalmente eficaz y causa efectos secundarios adversos. No existe una vacuna contra el VHC disponible. Por lo tanto, se requiere un esfuerzo continuado para el desarrollo de una vacuna y mejor terapia. Un sistema de cultivo celular VHC es crítica para el estudio de varias etapas de crecimiento del VHC incluyendo la entrada del virus, la replicación del genoma, el envasado, y la salida. En el procedimiento actual presentado, se utilizó un virus de tipo salvaje intragenotype 2a quimérico, FNX-VHC, y un virus FNX-Rluc recombinante que lleva un gen indicador de luciferasa de Renilla para estudiar la replicación del virus. Una línea celular de hepatoma humano se utilizó (basa Huh-7) para la transfección de transcritos in vitro de VHC ARN genómicos. Sobrenadantes de cultivo libres de células, lisados ​​de proteínas y tARN otal se recogieron en varios puntos de tiempo después de la transfección para evaluar el crecimiento del VHC. VHC estado de la replicación del genoma se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa y la visualización de la presencia de VHC ARN de doble cadena. La expresión de la proteína del VHC se verificó por transferencia de Western y ensayos de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para las proteínas del VHC NS3 y NS5A. Células transfectadas de ARN del VHC liberadas partículas infecciosas en sobrenadante de cultivo y el título viral se midió. Se utilizaron ensayos de luciferasa para evaluar el nivel de replicación y la infectividad del VHC reportero. En conclusión, se presentan varios ensayos virológicos para la caracterización de las diferentes etapas del ciclo de replicación del VHC.

Introduction

Virus de Hepatitis C (VHC) causa la cirrosis y cáncer de hígado. Afecta a 170 millones de personas en todo el mundo, con 350.000 personas que mueren cada año ^1-3. El VHC es un virus ARN de cadena positiva con un tamaño de genoma de 9,6 kb. El genoma del HCV se traduce como una sola poliproteína de ~ 3.000 residuos de aminoácidos que se escinde proteolíticamente por diversas proteasas celulares y virales en 10 polipéptidos. VHC es el virus prototipo del género Hepacivirus y pertenece a la familia Flaviviridae ^4. Tras la exposición, el VHC establece la infección crónica en el 80% de los individuos. La infección generalmente es asintomátic....

Protocol

Un esquema general del protocolo se ilustra en la Figura 1.

1. Las células

1. Preparar medio de crecimiento completo que contiene suero de 10-15% de bovino fetal (FBS), 10 mM de aminoácidos no esenciales, 10 mM de Hepes, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 mg / ml), y 2 mM de L-glutamina.
2. Mantener Huh-7.5.1 células ¹³ en medio de crecimiento completo que contienen los suplementos anteriores para el análisis in vitro de la hepatitis C ciclo de replicación viral.
3. Cepas virales Cultura en Huh-7.5.1 células con el medio de cultivo complementado especificada a 37 ....

Results

Virus de la hepatitis C es un virus de ARN. Por lo tanto para el propósito de la manipulación genética, el ADNc genómico del VHC ha sido clonado en un plásmido vector bacteriano. Una secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 se introdujo inmediatamente antes del extremo 5 'del genoma del VHC. Un esquema general de flujo de trabajo de análisis de VHC se presenta en la Figura 1. Para generar ARN genómico del VHC con el extremo precisa 3 ', del genoma del VHC que contiene el plásmido se cortó con la enzi.......

Discussion

Esta ilustración describe un método para analizar el ciclo de replicación de la hepatitis C virus. HCV es un patógeno humano y el protocolo de bioseguridad prescritas tendrá que ser seguido estrictamente. Sistemas de cultivo celular de VHC infecciosas se han descrito anteriormente ^11-13,16,17. Hay algunos puntos cruciales que implementamos cuando se sigue el protocolo ilustrado. En primer lugar, es de gran importancia para tener una buena calidad de intacta longitud viral ARN genómico completo para estudios p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)	Fisher Scientific	10-017-CV
Aminoácido no esencial	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM Medio de suero reducido, sin fenol Red	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1		de Investigación Scripps	La línea celular fue amablemente proporcionada por el Dr. Francis Chisari al Dr. Arumugaswami en virtud de la MTA ejecutada entre el Instituto de Investigación Scripps y el Centro Médico Cedars-Sinai
Plásmidos (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc y pFNX-Rluc Pol null)		Médico Cedars-Sinai	Los plásmidos del VHC fueron sintetizados por el Dr. Arumugaswami utilizando oligonucleótidos superpuestos.
XbaI	Nueva Inglaterra Biolabs Inc.	R0145S
Nucleasa de frijol mungo	Nueva Inglaterra Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express Sistema de producción de ARN a gran escala	Promega	P1320
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Cubeta de electroporación (4 mm)	Bioexpress	E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total	System Bio-Rad	165-2660
anticuerpo monoclonal anti-dsRNA de ratón J2	Inglés & Consultoría Científica Kft.
Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
Paquete de membrana PVDF	Bio-Rad	162-0263
Bloqueador de grado secante Leche en polvo descremada	Bio-Rad	170-6404XTU
Tween-20	Bio-Rad	170-6531XTU
Anticuerpo NS3 contra el virus de la hepatitis C [8 G-2]	Abcam	ab65407
Anticuerpo NS3 contra el virus de la hepatitis C [H23]	Abcam	ab13830
IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP)	Laboratorios de Investigación Inmunológica de Jackson, Inc.	115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Reactivos de detección	GE Healthcare Ciencias de la Vida	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX con ROX	Sistema
ViiA 7	Kit
Renilla	Promega	E2810
DNasa libre de ARNasa	Promega	M6101
Sistema de detección múltiple GloMax-(luminómetro)	Promega