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Artículo de método

La tinción histoquímica de

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⸱

DOI:

10.3791/51381

⸱

13 de mayo de 2014

 , 
1Feedstocks Division, Joint Bioenergy Institute, 2Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

En este artículo

Resumen

La composición de la pared celular de la planta varía según el tipo de tejido y puede incluir lignina, celulosa, hemicelulosas y pectina. Se han desarrollado varias técnicas de tinción para visualizar las diferencias a nivel de tipo de célula. Este artículo es una recopilación de las técnicas de tinción de pared celular más utilizadas.

Resumen

Arabidopsis thaliana es un organismo modelo comúnmente utilizado para comprender y manipular diversos procesos celulares en las plantas, y se ha utilizado ampliamente en el estudio de la formación de la pared celular secundaria. La deposición de la pared celular secundaria ocurre después de que se establece la pared celular primaria, un proceso llevado a cabo exclusivamente por células especializadas, como las que forman tejidos de vasos y fibras. La mayoría de las paredes celulares secundarias están compuestas de celulosa (40-50%), hemicelulosa (25-30%) y lignina (20-30%). Se han aislado varias mutaciones que afectan a la biosíntesis de la pared celular secundaria, y los mutantes correspondientes pueden o no presentar cambios obvios en la composición bioquímica o fenotipos visuales, ya que estas mutaciones podrían estar enmascaradas por respuestas compensatorias. Los procedimientos de tinción se han utilizado históricamente para mostrar diferencias sobre una base celular. Estos métodos son exclusivamente medios de análisis visuales; Sin embargo, su papel en el análisis rápido y crítico es de gran importancia. El rojo Congo y el blanco de calcofluor son tinciones que se usan para detectar polisacáridos, mientras que Mäule y floroglucinol se usan comúnmente para determinar diferencias en la lignina, y el azul de toluidina O se usa para teñir diferencialmente polisacáridos y lignina. Las técnicas aparentemente simples de seccionamiento, tinción e imágenes pueden ser un desafío para los principiantes. Comenzando con la preparación de muestras utilizando el modelo de A. thaliana, este estudio detalla los protocolos de una variedad de metodologías de tinción que se pueden implementar fácilmente para la observación de la organización de células y tejidos en las paredes celulares secundarias de las plantas.

Introducción

La pared celular vegetal tiene una gran cantidad de información dentro de sus diversos componentes: lignina, celulosa, hemicelulosa (xilano, glucuronoxilano, xiloglucano, arabinoxilano, vinculación mixta de glucano, o glucomanano), y pectina. Técnicas histológicas proporcionan importantes pistas visuales en el estudio de las diferencias dentro de las paredes celulares secundarias en los niveles de organización y celulares. Diversas técnicas histológicas fueron desarrollados y se pueden encontrar en la literatura, pero estas técnicas puede ser difícil y requiere mucho tiempo para los principiantes debido a protocolos muy detalladas con instrucciones visuales simples son rara vez disponible. El objetivo de este estudio es proporcionar pautas sencillas para las técnicas de tinción histológica para obtener imágenes de alta calidad.

Seccionar el tejido del tallo es el primer paso en la visualización de las paredes celulares y formas celulares. Aunque las secciones cortadas a mano son baratos y requieren menos tiempo para prepararse, el uso de un vibratome ofrece consistencia yproduce imágenes de alta calidad. El uso de un vibratomo permite producir mejor calidad de los datos mediante la generación de incluso secciones con el mismo espesor, lo que ayuda a producir imágenes nítidas y reduce significativamente el riesgo de producir diferencias inexactas entre las muestras que se causada simplemente por una mala preparación de la muestra. El uso de resinas para fijar especímenes frescos puede ser un desafío para los principiantes y todavía puede llevar mucho tiempo, incluso para los expertos en el análisis que debe hacerse rápidamente. Además, se hace imposible para medir cualquier actividad biológica con la muestra cuando se ha incorporado en una resina. Una técnica simple que emplea agarosa y un molde casero es útil para la incrustación de tejidos del tallo, y también se puede utilizar en otras aplicaciones que requieren la disección de los tejidos blandos. En comparación con la incrustación de especímenes en la resina, este método tiene la ventaja de mantener los tejidos vivos y la reducción de la manipulación de la muestra. Seccionamiento tejidos a través de un vibratomo es altamente preciso y genera homogensecciones unidades organizativas, que, dependiendo del objetivo del estudio, a continuación, se pueden utilizar con varias técnicas de tinción diferentes.

Los métodos más sencillos para visualizar la lignina y otros compuestos aromáticos emplean radiación ultravioleta (UV). La excitación de las moléculas de base de compuestos aromáticos por la luz UV es una técnica antigua, pero sigue siendo uno de los métodos más rápidos para la visualización de la lignina. Sin embargo, la visualización UV en realidad no es ideal para la detección de la lignina, porque la luz UV excitará otros compuestos aromáticos. La lignina se compone principalmente de tres componentes básicos, los monolignoles (alcoholes hidroxicinamil: alcohol coniferil, alcohol sinapílico y alcohol p-cumaril) 1-3. Mancha Phloroglucinol puede proporcionar pistas sobre la magnitud de cinnamaldehydes presentes en el xilema, fibras y tejidos traqueales 4. Floroglucinol es un buen indicador de cinnamaldehydes generales y puede diferenciar entre cinnamaldehydes y otros compuestos aromáticos. Los monómeros de alcohol sinapílico se pueden detectary diferenciados por el uso de Maule mancha. Azul de toluidina O es un colorante policromático y por lo tanto tiene la capacidad de manchar diferentes elementos de la pared celular en diferentes colores 5,6. El principal uso de azul de toluidina O es detectar pectina y 5,6 lignina. La ventaja de la utilización de azul de toluidina O es que muchos elementos de la pared celular pueden ser visualizados en un solo paso. Tanto calcoflúor blanco y rojo congo son fáciles de trabajar con y se pueden utilizar para visualizar celulosa. Calcofluor manchas blancas de celulosa, callosa, y otros β-glucanos, no sustituidos o sustituidos débilmente 6-9, mientras que el congo manchas rojas directamente a β-glucanos (1 → 4) y, en particular y celulosa 10,11. El objetivo de este estudio es proporcionar pautas sencillas para el uso de las técnicas de tinción antes mencionados para obtener imágenes de alta calidad a partir de A. thaliana tallos.

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Protocolo

1. Stem incrustación

  1. Hacer una solución de agarosa al 7% en agua (de 7 g de agarosa de electroforesis-grado en 100 ml de agua destilada). Disolver la agarosa en autoclave durante 20 min o en el microondas durante 20 min a una intensidad más baja (por ejemplo, intensidad de 10% de un horno de microondas 1250 vatios).
  2. Preparar un molde hecho en casa para incrustar los tallos usando viales de plástico.
    1. El uso de una hoja de afeitar, cortar la parte inferior cónica de un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca de 2 ml (Parte A). Con una aguja de jeringa, perforar un agujero en la tapa del tubo ligeramente mayor que el diámetro del vástago para ser incrustado. A continuación, cortar 0,5 cm de la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (Parte B).
    2. Añadir la porción de 0.5 cm de corte del tubo de microcentrífuga de 0,6 ml en el tubo de microcentrífuga de 2 ml de precorte. Selle las dos partes utilizando Parafilm (Figura 1). NOTA: La parte inferior del tubo se corta para facilitar la eliminación de la muestra incrustada después de la agarosa se ha solidificado. Tél agujero en la tapa será ayudar en la sujeción del vástago estacionario cuando el vástago está incrustado en agarosa. El molde que servirá para celebrar la agarosa y sostenga el tronco recto al incrustar. El Parafilm celebrará las dos partes, A y B, hasta que la agarosa se establece y el tallo está incrustado.
    3. Uso de una hoja de afeitar, cortar una sección de vástago de la zona de interés, (por ejemplo, medio de la primera entrenudo del tallo). NOTA: Idealmente, el tallo debe cortarse justo antes de la incorporación de evitar la destrucción por la deshidratación. Alternativamente, el vástago puede ser almacenado temporalmente en una placa que contiene un papel de filtro humedecido con agua. Esta placa se puede colocar en hielo hasta que esté listo para ser incorporado para prevenir la deshidratación del tejido y la deformación. Almacenamiento de la madre para períodos de más de 30 minutos sin elevada humedad hará que el vástago se seque.
  3. Derrita la agarosa en el microondas a baja intensidad. PRECAUCIÓN: La botella que contenía agarosa puede estar caliente. Utilice un guante para coger la botella. Deje que los s de agarosa fundidatand a temperatura ambiente (entre 20 ° C y 25 ° C) hasta que se enfría a aproximadamente 50 º C.
  4. Lentamente pipeta de 5 ml de la agarosa en el molde de plástico preparado de antemano para llenar el vial. NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire en los moldes. Las burbujas de aire hará que las brechas en el molde de agarosa y no cubren completamente la muestra madre, que finalmente conducirá a la corte desigual de las secciones de la muestra.
    1. Deje que la agarosa se enfríe durante 30 a 60 segundos para convertirse en semisólido. Pruebe con un pequeño palillo de dientes, asegurándose de que puede penetrar y permanecer de pie, pero no flotan, en la agarosa. NOTA: Si la madre se coloca cuando la agarosa esté todavía caliente se puede dañar la muestra por encogimiento del tallo, la destrucción de la morfología celular.
    2. Coloque el vástago en este vial de agarosa-llenado. Asegúrese de que el vástago se mantiene recta. Coloque la tapa perforada de una manera tal que la punta del vástago se lleva a cabo por la tapa. No gire el tapón de rosca. En algún momento más de un vástago (de una sola especie) puede ser embedded en un solo vial; pero en ese caso concreto, no utilice la tapa. NOTA: Si la tapa de rosca está activada, la madre recibirá retorcido.
  5. Agregar el vial a temperatura ambiente o a 4 º C durante 10-30 min, hasta que se solidifica.
  6. Retire el molde suavemente deslizándolo fuera del tubo. Abra el Parafilm. Empuje la parte inferior de la parte B del molde suavemente con el pulgar para soltar la agarosa solidificada de la Parte A en un portaobjetos de vidrio para microscopio.
  7. Cortar el tallo incrustado de agarosa en tres trozos aproximadamente iguales de 1,2 cm de longitud. Corte la parte del tallo que no estaba en la agarosa y descartarlo.
    1. Guarde estas piezas de agarosa con el embebido tallos en hermético 2 tubos de microcentrífuga ml en una caja oscura a 4 ° C hasta el momento de la sección. Alternativamente, almacenar los tubos a 4 º C durante un máximo de una semana. NOTA: El almacenamiento es posible, pero el experimentador tiene que ser consciente de que los tallos incrustado todavía están vivos y, dependiendo del experimento, Artefactos potencialmente podrían ser introducidos.

2. Stem Sectioning

  1. PRECAUCIÓN: Lea el manual vibratome cuidadosamente y siga todas las instrucciones de seguridad.
  2. Asegúrese de que la platina esté limpia y completamente seca (libre de cualquier sólido o líquido). Limpie la platina con una hoja de afeitar para eliminar cualquier pegamento residual de los experimentos anteriores y lavar con agua. Luego seque con una toalla de papel. NOTA: Esto asegurará que el adhesivo funciona bien y se une a la muestra de agarosa. Si este paso no se hace correctamente, es posible que los especímenes no podrán adherirse al disco y más tarde provocarán la muestra caigan fuera del disco durante el corte.
    1. Utilice papel suave limpia para eliminar la humedad del bloque de agarosa que contiene las muestras.
    2. Coloque una pequeña gota de adhesivo tisular en la platina. Racha a cabo el adhesivo para cubrir el área en el centro de la placa con la punta de la botella adhesivo. Rápidamente lugarel bloque de agarosa de manera que las muestras son o bien perpendicular a o en paralelo con la placa para transversal o secciones transversales longitudinales, respectivamente. Deje que el adhesivo para fijar la muestra a la platina a temperatura ambiente o a 4 º C durante 10-30 min. NOTA: Este es un paso sensible al tiempo.
  3. Fijar la platina en su lugar en el baño tampón o valle. El bloque / s de agarosa con las secciones deben estar en paralelo con la hoja de afeitar. Llene la bandeja de tampón con agua destilada a temperatura ambiente hasta que las muestras estén completamente sumergidos.
  4. Cortar una hoja de afeitar en la mitad y luego recortar los extremos con unas tijeras fuertes para que la hoja se queda completamente plano. Coloque la mitad de la hoja de afeitar de precorte en el soporte de cuchillo.
    1. Ajuste el ángulo del soporte de cuchillo a 84 °, la velocidad de 0,90 mm / seg (8 posición en el vibratome) y la frecuencia de 50 Hz (posición 5 en el vibratome). Cortar secciones de 100 micras de espesor. Utilice el modo continuo. NOTE: Este espesor se selecciona para asegurar que el tejido puede soportar los diversos tratamientos con ácido y base utilizados en algunos de los protocolos de tinción. Establece la ventana para seccionar y permitir 15-20 min en un modo continuo para la vibratome a la sección de un bloque de agarosa de aproximadamente 1,2 cm.
  5. Recoge las secciones con una pipeta de plástico desechable durante el corte en el baño tampón. Alternativamente, las secciones pueden ser transferidos desde la bandeja de tampón en un vaso de precipitados de vidrio y luego a una placa de Petri claro. Transferir algunas secciones de los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml. Nota: Las muestras se recogen de una placa de Petri, ya que es más fácil ver las secciones sobre un fondo claro, y porque el baño tampón pueden ser preparadas para la siguiente muestra.
  6. Las secciones se pueden almacenar en un tubo de 50 ml o recogidos y almacenados en 1,5 a 2 ml de tubos de microcentrífuga a 4 ° C durante 30 a 60 min. NOTA: El almacenamiento de las secciones por períodos más largos dará lugar a la mala calidad de imagen.

3. Microscopio y ajustes de la cámara para imágenes

  1. Ajustar la iluminación Koehler en el microscopio. Elija un objetivo. Enfoque la muestra primero. Traiga la intensidad de la luz a la mitad o menos. Cierre el diafragma de campo (FD) y la apertura (AP) o llevarlo a la posición más baja posible en ese objetivo particular.
    1. Cuanto mayor es la ampliación, más grande es el anillo será. Utilice el botón de enfoque del condensador para enfocar el iris de campo tan fuertemente como sea posible.
    2. Lentamente lleve la imagen del iris de campo (pequeño anillo en forma de hexágono) al centro con los mandos de centrado del condensador-(tornillos en forma de alfiler que rodean el condensador). Aumente poco a poco el diafragma (FD) de tal manera que el diafragma de campo alcanza el borde. Detener el aumento de la FD justo después del iris de campo ha superado el límite.
    3. Poco a poco aumentar la abertura (AP) para ajustar el contraste. Ajuste la intensidad de la luz según las necesidades. NOTA: la iluminación Koehler necesita ser ajustado para cada Objetivo, cada día experimental. Anote los números obtenidos después del ajuste para el día. Estos números se pueden volver a utilizar cada vez que se cambian los objetivos de ida y vuelta para ese día en particular.
  2. Ajuste la abertura, intensidad, tiempo de exposición, la ganancia y filtros como se describe en la Tabla 1. Esta información debe ser utilizado sólo como una guía.
  3. Utilice una cámara digital de alta resolución con un chip CCD interlineal de formato grande sin obturador mecánico para capturar imágenes de fluorescencia; y una alta resolución, cámara de alta velocidad de imágenes de campo brillante.
  4. Procesar las diapositivas utilizando software estándar. Cargue el software. Haga clic en "Acquire" y "Ajuste de la cámara / tabla," a continuación, seleccione la cámara que se utilizará. Haga clic en "Aceptar". Haga clic en "Adquirir" seguido de "ficha Color." Bajo "ficha Color," elegir "el método Bayer" seguido de "Promedio de cuatro." Añadir la ganancia sugerido (rojo, verde, azul) from Tabla 1. Seleccione la pestaña "Config salvar" y haga clic en el directorio en el que las imágenes han de almacenarse. Ajuste "Tiempo de exposición" de las sugerencias en la Tabla 1. Ajuste "Agrupación" a "1" y "hurgar en la basura en vivo" a "1". Centrarse en la región de interés y, a continuación, haga clic en "Guardar en vivo."
  5. Imágenes de salida en el software de la cámara están en el formato "TIF". Analizar las imágenes para histoquímica de los tipos de células. Utilice software estándar para usos intermedios de presentación y publicación.

4. Ultravioleta y Bright-campo Imaging

  1. Usar una pipeta de 1 ml con el corte de punta de la pipeta de manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente. Suavemente secciones pipeta en la punta y en un portaobjetos de microscopio. Cubrir las secciones con un cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo la luz ultravioleta o luz de campo brillante.

5. Floroglucinol-HCl (Wiesner) tinción 12

  1. Disolver 0,3 g de floroglucinol en 10 ml de etanol absoluto para preparar una solución de floroglucinol 3%. Mezclar un volumen de HCl concentrado (37 N) a dos volúmenes de 3% floroglucinol en etanol; esta solución es floroglucinol-HCl (pH-HCl) o Wiesner mancha. Nota: esta solución es que se recién hecho en el día de la tinción y no puede ser almacenado, ya que la solución se degradará con el tiempo y la tinción se convertirá en ineficaz. PRECAUCIÓN: HCl es altamente corrosivo, por lo que vaya con mucho cuidado al manipular la mancha Ph-HCl.
  2. Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir 1 ml de la solución de Ph-HCl al tubo que contiene las secciones y la tapa de inmediato debido a que el HCl en la mancha Ph-HCl es altamente corrosivo. Mueva suavemente el tubo para asegurar que todas las secciones se tiñen. Una alternativa a este paso es para mantener la tapa del tubo abierto de modo que el pH de la solución de HCl-se puede pipeteó arriba y abajo, preferentemente sin molestar a la SECciones. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta, ya que esto puede dañar esas secciones.
    1. Usar una pipeta de 1 ml con el corte de punta de la pipeta de tal manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente y sin daños. Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio. Cubrir las secciones con cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo iluminación de campo brillante. NOTA: El pH de la solución de HCl-seca en 5-10 minutos, provocando un deterioro de los especímenes. Por lo tanto, la imagen tiene que ser completado dentro de ese período de tiempo.

6. Maule tinción 13,14

  1. Disolver 0,2 g de permanganato de potasio en 40 ml de agua destilada para preparar una solución de permanganato de potasio 0,5%. Almacenar en una botella oscura a temperatura ambiente durante un máximo de 7 días.
    1. Preparar una solución de HCl 3,7% mediante la adición de 1 ml de HCl concentrado (37 N) a 9 ml de agua destilada (1:10). Prepare una solución fresca HCl 3,7% en eldía del experimento. Asegúrese de que la solución de HCl 37 N que se utiliza no es demasiado viejo. Solución de hidróxido de amonio concentrado (14,8 M) debe ser almacenado a 4 ° C para evitar la molaridad de la solución saturada de disminuir.
  2. Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir 1 ml de la solución de permanganato de potasio 0,5% al ​​tubo que contiene las secciones.
    1. Pipetear la solución de permanganato de potasio 0,5% arriba y hacia abajo suavemente, preferiblemente sin molestar a las secciones. Incubar durante 2 minutos y repetir la pipeta. Deje que el tubo de microcentrífuga reposar hasta que todas las secciones se calmen. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta como las secciones pueden ser dañados. Puede ser difícil de ver las secciones de tallo como la solución es oscura, por lo que mantener el tubo con las secciones sobre Gradilla y permitir que se asienten durante 2 min.
    2. Usando una pipeta de 1 ml, extraer 700 l de solución de permanganato de potasio 0,5%.Añadir 700 l de agua destilada para enjuagar la solución de permanganato de potasio. Repita 3-4x o hasta que la solución de agua permanece clara.
    3. Deseche el agua. Añadir rápidamente 1 ml de 3% de HCl hasta que el color de color marrón oscuro se descarga de las secciones. Esto puede suceder dentro de 3-5 min o puede requerir de 2 lavados de 5 min cada uno. Pipetear toda la solución de HCl al 3% y proceda inmediatamente al siguiente paso.
    4. Añadir 1 ml de solución concentrada de hidróxido de amonio. Usar una pipeta de 1 ml con la punta de corte de tal manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente y sin daños. Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio. Cubrir las secciones con un cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo iluminación de campo brillante. PRECAUCIÓN: Debido a que el hidróxido de amonio es extremadamente corrosivo, requiere especial cuidado y atención para evitar causar corrosión a la platina del microscopio o lente. NOTA: Los vapores de hidróxido de amonio pueden empañar el cubre, por lo que es difícil de observar la muestra. Por lo tanto tenga mucho cuidado antes de añadir el cubreobjetos. La solución se seca en 5-10 minutos, por lo que la imagen tiene que ser completado dentro de ese período de tiempo.

7. Rojo Congo tinción 11,15

  1. Disolver 0,5 g de rojo Congo en 100 ml de agua destilada para preparar una solución de rojo Congo 0,5%.
  2. Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir 1 ml de la solución de rojo Congo 0,5% al ​​tubo. Pipetear suavemente la solución de rojo congo 0,5% arriba y abajo sin molestar a las secciones. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta, ya que esto podría dañar las secciones.
    1. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min y repetir el pipeteado. Siga con otro 3 min de incubación a temperatura ambiente.
    2. Utilice una pipeta de 1 ml para extraer 700 l de 0,5% solución de rojo congo. Añadir 700 l de agua destilada para enjuagar la solución de rojo congo. Repita el lavado 3-4x hasta que la solución de lavadoestá claro.
    3. Usar una pipeta de 1 ml con su corte de punta de tal manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente y sin daños. Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio, y los cubren con cubreobjetos. Tenga en cuenta las muestras en el portaobjetos de un microscopio bajo la luz azul de excitación utilizando un filtro con un paso de banda de 560/40. NOTA: No almacene las secciones en el agua por mucho tiempo antes de que el análisis microscópico, ya que el agua va a lavar el rojo congo en 10-30 min.

8. Calcoflúor Blanco tinción 9

  1. Disolver 0,02 g de abrillantador fluorescente 28 (calcoflúor blanco M2R) en 10 ml de agua destilada para preparar una solución madre de 0,2%. La solución de 0.2% puede ser almacenado durante seis meses en un frasco oscuro a 4 º C. Preparar una solución de trabajo de 0,02% diluyendo el 0,2% 10x solución madre con agua destilada.
  2. Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir al tubo 1 ml de la calcof 0,02%Luor solución blanco. Pipetear suavemente la solución blanca 0,02% calcofluor arriba y hacia abajo. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta, ya que esto podría dañar las secciones.
    1. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min y repetir el pipeteado. Incubar la sección para otro 3 min a temperatura ambiente. NOTA: Permita que las secciones se asienten en el fondo del tubo para que sea más fácil de pipeta la solución sin dañar las secciones.
    2. Utilice una pipeta de 1 ml para extraer 700 l de solución de blanco 0,02% calcofluor y añadir 700 l de agua destilada; espere 5 minutos para enjuagar la solución blanco calcofluor. Repita el lavado 3-4x. Usar una pipeta de 1 ml con el corte de punta de la pipeta de tal forma que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente y sin daños.
    3. Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio y cubrirlos con un cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo la luz ultravioleta.

9. Toluidina Blue O tinción 16,17

  1. Disolver 0,02 g de azul de toluidina O en 100 ml de agua destilada para preparar una solución 0,02%. NOTA: La solución de azul de toluidina O se puede almacenar durante dos semanas en una botella oscura a temperatura ambiente.
  2. Transferencia de secciones de tallo a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Añadir 1 ml de la solución de azul de toluidina O 0,02% al tubo. Pipetear suavemente la solución de azul de toluidina O 0,02% arriba y hacia abajo. A continuación, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min y repetir el pipeteo una vez. NOTA: Tenga cuidado de no pipetear las secciones en la punta de la pipeta, ya que esto podría dañar las secciones. Deje que el tubo de microcentrífuga se detiene hasta que las secciones se calmen. Esto puede ser difícil de ver, ya que la solución es oscura, por lo que mantener el tubo que contiene las secciones sobre Gradilla y permitir que se asienten durante 2 minutos a temperatura ambiente.
    1. Utilice una pipeta de 1 ml para extraer 700 l de solución de azul de toluidina O 0,02%. Añadir 700 l de agua destilada para enjuagar el azul de toluidina O sollución. Repita 3-4x o hasta que la solución de lavado que está claro. Usar una pipeta de 1 ml con el corte de punta de la pipeta de tal manera que las secciones se pueden pipetearon a cabo fácilmente sin dañarlos.
    2. Pipetear suavemente secciones en la punta y en un portaobjetos de microscopio y cubrirlos con un cubreobjetos. Tenga en cuenta las secciones bajo iluminación de campo brillante.

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Resultados

Stem inclusión y corte:
El uso del molde de plástico hecha en casa para incrustar los tallos en 7% de agarosa demostrado ser rápido y fácil (Figura 1). Las dos partes (A y B; Figura 1) del sistema vial incrustado hacen que sea sencillo para liberar fácilmente el vástago incrustado en agarosa, tal como la agarosa no se pegue a las partes de los viales que son inertes, mantener el sistema limpio. Los viales se pueden reutilizar varias veces por año. La conveniencia de almacenar el ...

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Discusión

Secciones de tallo de A. thaliana se utilizan ampliamente para estudiar la organización de las células en la pared celular secundaria y para examinar cualitativamente las diferencias entre el tipo salvaje y las plantas transgénicas. Las técnicas utilizadas para el corte de las muestras son de corte directo de las manos; o cuando las muestras están incrustados en agarosa o fijador, seccionamiento se puede hacer con un vibratome o microtomo. En contraste con el corte manual, los dos últimos permiten reducir el ri...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos financieros que revelar.

Agradecimientos

Estamos agradecidos a Sabin Russell para asistencia en la edición. Este trabajo formó parte de la Joint BioEnergy Institute DOE (http://www.jbei.org) apoyado por el Departamento de Energía de los EE.UU., Oficina de Ciencia, Oficina de Investigación Biológica y Ambiental, a través del contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley Laboratorio Nacional y el Departamento de Energía de EE.UU..

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarosaEMDMERC2125Número CAS: 9012-36-6
PhloroglucinolSigmaP 35021,3,5-trihidroxibenceno [Número CAS: 108-73-6]
Ácido clorhídricoEMDHX0603-75Número CAS: 7647-01-0
Hidróxido de amonioEMDAX1303-6Número CAS: 1336-21-6
Azul Toulidine OSigmaT3260Cloruro de bluteno, cloruro de tolonio [número CAS 92-31-9] 
Permanganato de potasioSigma 223468número CAS 7722-64-7 
Etanol 190 pruebaKOPTECV1401Número CAS: 64-17-5
Congo RedSigma C62773,3'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaftaleno 1-sulfonato) [Número CAS 573-58-0]
Abrillantador fluorescente 28/ Calcofluor White StainSigmaF3543 Ácido 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxietil)amino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]amino]estilbeno-2,2'-disulfónico [Número CAS 4404-43-7] 
VibratomeLeica Leica Microtomo de cuchilla vibratoria VT1000Shttp://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
RazorAmerican Safety empresa de maquinillas de afeitarArtículo # 60-0139-0000 Hoja de doble filo de acero inoxidable (Personna Super)
Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca (2 ml)VWR16466-044
Tubos de microcentrífuga (0,6 ml)Axygen ScientificMCT-060-C
MittBel-Art380000000SCIENCEWARE  Protector de manos caliente Mitt
Adhesivo para tejidosTed Pella Inc10033Tienda en 4 ° C o 20 ° C para 3 meses o más de almacenamiento
MicroondasPanasonicNN-SD762SPELCO Pro CA 44 Adhesivo instantáneo para tejidos 
Cámara con chip CCD sin obturador mecánico HamamatsuC4742-95
Cámara a color de alta velocidad     QImagingMicroPublisher 5.0 RTV
Software de cámara   Molecular DevicesMetaMorph versión 7.7.0.0
Imaginando análisis Adobe Photoshop CS4
Micro Cubreobjetos, Cuadrado, N.º 1VWR48366-06722 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Los cubreobjetos son resistentes a la corrosión y uniformemente gruesos y planos. El espesor n.º 1 es de 0,13 a 0,17 mm.
Microportaobjetos esmerilados, 1 mmVWR48312-00375 x 25 mm - 1 mm
Parafilm MAlcan embalajeBRNDPM998
TX2 Cubo de filtro TX2 FiltroLeica11513851/11513885utilizado para el análisis de rojo Congo con un paso de banda de 560/40.

Referencias

  1. Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).
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