Borrado de imágenes Sistemas Biológicos intactos a nivel celular por 3DISCO

Resumen

Para obtener imágenes de alta resolución de células marcadas con fluorescencia dentro de tejidos grandes, idealmente, las muestras biológicas deben ser visualizadas sin seccionar. 3DISCO es un procedimiento sencillo de limpieza de tejidos basado en la incubación secuencial con disolventes orgánicos. Al aclararse, los órganos se vuelven transparentes, lo que permite un escaneo láser de extremo a extremo del espécimen.

Resumen

La limpieza de tejidos y la posterior obtención de imágenes de órganos transparentes es un método poderoso para analizar células y moléculas marcadas con fluorescencia en 3D, en órganos intactos. A diferencia de los métodos histológicos tradicionales, en los que se secciona el tejido de interés para obtener imágenes fluorescentes, las imágenes 3D del tejido aclarado permiten examinar las células y moléculas marcadas en toda la muestra. Con este fin, los tejidos ópticamente opacos deben hacerse transparentes haciendo coincidir los índices refractarios en todo el tejido. Posteriormente, se pueden obtener imágenes del tejido de una sola vez utilizando microscopios de escaneo láser para obtener una imagen 3D completa de alta resolución de la muestra. Una lista cada vez mayor de protocolos de limpieza de tejidos, incluidos 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 y SeeDB, proporciona nuevas formas para que los investigadores obtengan imágenes de su tejido de interés en su conjunto. Entre ellos, 3DISCO es un método altamente reproducible y sencillo, que puede eliminar diferentes tipos de tejidos y se puede utilizar con diversas técnicas de microscopía. Este protocolo describe este sencillo procedimiento y presenta sus diversas aplicaciones. También se analizan las limitaciones y las posibles dificultades y cómo superarlas.

Introducción

El examen histológico de los tejidos biológicos es un enfoque fundamental en la comprensión de la naturaleza de las moléculas / células en su contexto natural. Idealmente, imágenes de alta resolución de todo el órgano es más informativo y deseada. Debido a que la luz tiene una profundidad de penetración limitada, debido a la dispersión ^1, los órganos fijos tienen que ser seccionado para realizar imágenes microscópicas de alta resolución. Por lo tanto, la mayor parte de los estudios histológicos se realizan en pocas secciones de tejido que representan sólo una pequeña parte del órgano. En algunos estudios, por ejemplo, las destinadas a trazar las conexiones neuronales en el cerebro o la médula espinal, todas las secciones de tejido de los órganos diana se recogen y se va a examinar para una reconstrucción 3D. Sin embargo, seccionar los tejidos y la posterior obtención de imágenes de secciones individuales tiene varias limitaciones. Estos incluyen ser mucho tiempo y que conduce a una reconstrucción 3D incompleta del tejido, debido a las distorsiones mecánicas y difícilIES en la alineación de las imágenes resultantes.

Recientemente, de compensación y de imágenes transparentes órganos intactos se ha desarrollado como una solución importante a este defecto ^{de 2,3.} Tras la limpieza, todo el órgano se vuelve transparente permitiendo a la luz imágenes de viajar de extremo a extremo (Figura 1) para producir imágenes de alta resolución del órgano unsectioned usando un microscopio de barrido láser como un fotón o hojas luz multi microscopio ( la Figura 2). Varios grupos de investigación han desarrollado nuevos protocolos de limpieza y eliminación de tejido para ser capaz de imagen de su tejido de interés para diferentes propósitos. Estos incluyen disolvente orgánico ^{2-5, 6,7} agua y electroforesis basada ⁸ protocolos de compensación. Entre ellos, de formación de imágenes 3-dimensional de disolvente se aclaró órganos o 3DISCO es un protocolo fácilmente aplicable en una variedad de muestras biológicas incluyendo el sistema nervioso central (SNC) órganos, órganos inmunes y tumores sólidos. En adicde iones, que se puede combinar con diferentes técnicas de microscopía tales como microscopía de luz hoja de fluorescencia (LSFM), múltiples fotones y microscopía confocal de barrido láser. 3DISCO se basa en la limpieza con reactivos fácilmente disponibles y baratos tales como tetrahidrofurano (THF) y éter de dibencilo (DBE) ^4. El protocolo completo puede tomar tan corto como 3-4 hr. Por lo tanto, 3DISCO es una técnica robusta y rápida en comparación con los métodos histológicos tradicionales que pueden tardar semanas o meses para completar ^9.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con IACUC (Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso) regulaciones sobre los ratones ~ 3-5 meses de edad. El autor declara no los intereses financieros de la competencia.

1. Animal de perfusión y preparación de tejido

Tiempo: 30-60 min por ratón + posterior a la fijación (unas pocas horas a la noche).

1. Pesar el animal y anestesiar utilizando ketamina (80-200 mg / kg) y xilazina (7-20 mg / kg) o 2,5% Avertin (0,5 ml/25 g de peso corporal IP).
2. Espere unos minutos para que la anestesia surta efecto completo.
3. Pellizcar la punta y la cola del animal para asegurarse de que el animal está totalmente anestesiado.
4. Perfundir el animal primero a TA con tampón fosfato 0,1 M (PB) o 0,1 M tampón fosfato salino (PBS) durante 5-10 minutos hasta que la sangre se elimina por completo del tejido.
5. Cambie la perfusión de solución de fijación: 4% PFA en 0,1 M PB (o 0,1 M PBS) y continuar la perfusióncon 4% PFA durante 30-40 min a una velocidad de 3 ml / min.
6. Diseccionar el órgano / s de interés cuidadosamente sin dañar, por ejemplo, evitar perforar y apretando el tejido que está siendo diseccionado.
7. Retire el tejido adicional que rodea los órganos (tejido conjuntivo, las meninges o duramadre) en una placa de Petri llena de PBS.
8. Post-fijar los órganos en PFA al 4% para algunas horas o durante la noche a 4 º C. Evitar largo post-fijación porque PFA podría apagar la señal o aumentar el tiempo extra autofluorecense ¹⁰ especialmente para el canal de GFP (que es un problema menor en los canales rojo y rojo lejano).
9. Lavar los órganos 2-3x con PBS a temperatura ambiente justo antes de comenzar el procedimiento de compensación.

2. Compensación de Tejidos

Tiempo: 2-3 horas para los pequeños órganos y 1-4 días para los grandes órganos.

Notas: El etiquetado de fluorescencia de los tejidos mediante la expresión de los transgenes, transfección viral, trazado con tintas o anti-etiquetado cuerpo debe ser completado antes de borrar. Todos los pasos de limpieza y eliminación de tejido se llevan a cabo a temperatura ambiente. Las soluciones de compensación de THF, DBE, Babb (1 parte de alcohol bencílico y benzoato de bencilo parte 2) y diclorometano son tóxicos y por inhalación (llevar a cabo experimentos en campana de humos con ventilación adecuada) y el contacto directo con la piel debe ser evitado (use guantes de nitrilo).

1. Preparar 50% (vol / vol), 70%, y 80% de THF diluciones en agua destilada en frascos de vidrio separados de la siguiente manera: Para 50% de THF, por ejemplo, mezclar 25 ml de THF y 25 ml de agua destilada en una botella de vidrio con un volumen de mayores de 50 ml.
2. Mezcle las soluciones agitando suavemente la botella para un 1-2 min.
3. Etiquete la botella de vidrio claro.
4. Cierre bien las botellas y mantener las soluciones de trabajo en un armario oscuro. Para obtener los mejores resultados, no utilice las mismas soluciones de trabajo de más de 1-2 semanas. Por lo tanto, ordenar las soluciones de compensación como el menor volumen disponible para poder utilizar los reactivos de acciones nuevas.
5. Llene los frascos de vidrio (por ejemplo, 2-3 ml) con la primera solución de limpieza, 50% de THF, y la transferencia de los órganos de PBS en viales de vidrio para empezar claro.
6. Cierre bien los frascos de cristal con sus tapas y utilizar un rotador (por ejemplo, un agitador de rueda) para agitar.
7. Use papel de aluminio para cubrir y mantener los viales de vidrio en la oscuridad. Iniciar el rotador para agitar las muestras en los viales de vidrio durante el tiempo indicado (Tabla 1) a una velocidad constante (~ 30 rpm).
8. Eliminar la solución de limpieza y agregue la siguiente en el protocolo cuando se termina el tiempo en la Tabla 1.
9. Recoger los residuos de compensación en los contenedores de residuos de vidrio que se mantienen en una capucha.
   Repita el paso anterior para cada solución de limpieza en el protocolo hasta el final. Utilice una nueva pipeta pasteur cuando se añade una nueva solución de limpieza (por ejemplo, el cambio de THF a DBE).
10. En la etapa de compensación final con BABB o DBE, los tiempos de incubación pueden ser extendidos o shortened hasta que las muestras se vuelven completamente transparentes a la luz visible (o amarillento / transparente si se trata de un tejido muy grande, como el cerebro).
11. Mantenga despejados los órganos en la solución de limpieza final, en todo momento, incluyendo los pasos de formación de imágenes.

3. Preparación Órganos aclarados for Imaging

Tiempo: 5-15 min.

Nota: La imagen de los órganos despejadas tan pronto como se logre una compensación completa. Para ello, siga los siguientes pasos para preparar las muestras para microscopía de lámina de luz (por ejemplo, ultramicroscopía) o imágenes de microscopía confocal / multi-fotón.

Nota: Los órganos borrado, pierden su fuerza de fluorescencia con el tiempo (particularmente las proteínas fluorescentes por ejemplo, las buenas prácticas agrarias, el etiquetado de anticuerpos es más resistente e incluso puede dar mejores resultados con incubaciones más largas). Para formación de imágenes, diversas técnicas de microscopía de fluorescencia se pueden utilizar, siempre y cuando el manejo adecuado de los órganos en el CLEAse logra una solución anillo.

1. Para microscopía hojas luz
   1. Coloque o monte la muestra adecuada.
   2. Fijar el órgano autorizado girando manualmente el tornillo del soporte de la muestra ^4.
   3. Sumergir la muestra en la cámara de formación de imágenes (preferentemente de vidrio) de microscopio TheLight hojas que se llena con BABB o DBE, lo que se utilizó en el paso de compensación final.
2. Para múltiples microscopía fotónica / confocal
   1. Montar la muestra en una diapositiva de formación de imágenes (o una cámara de imágenes) con la solución de imagen final para ser capaz de imagen con un fotón múltiples o microscopía confocal, que suelen utilizar aceite o objetivos sumergidas en agua.
   2. Utilice cemento dental para hacer un borde alrededor del tejido.
   3. Llenar la piscina con BABB o DBE justo antes de cemento dental se pone totalmente rígido.
      Nota: El cemento dental se solidifica rápidamente; practicar un par de veces para familiarizarse con él antes de tratar las muestras reales.
   4. Coloque inmediatamentela muestra despejado en el centro de la piscina y se cubre con una cubierta de vidrio.
   5. Pulse el vidrio de cubierta hasta que esté completamente sellado por cemento dental y toca a la superficie del órgano despejado, lo que permitirá alcanzar la profundidad máxima de formación de imágenes por microscopía confocal / multi-fotón.
      Notas: Esto asegura que no hay solución de compensación será derramada durante la proyección de imagen. Evite la inmersión de la lente de imagen directamente en la solución de compensación, que puede dañar la lente a menos que sea resistente a la BABB / DBE o tiene una cubierta protectora.

Órganos 4. Imaging aclarados

Tiempo: 15-45 min.

1. Se recoge una z-scan que cubre todo el tejido borrado (si la lente utilizada permite) a la mejor resolución que el microscopio puede ofrecer.
2. Zoom en las regiones de interés para recoger imágenes de mayor resolución.

5. Examen de los datos con el software Amira

1. Cargue la serie de imagens de software Amira con módulo ResolveRT.
2. Introduzca el tamaño de voxel correctas en la ventana y pulse ok "Imagen Read Parameter".
3. Seleccione el "Multi Planer View" sub-aplicación. A continuación, utilice el control deslizante "Grueso" para elegir el umbral óptimo para los valores de gris, el ajuste de los valores de 2D y 3D.
4. Visualice la muestra, navegando por las rebanadas en diferentes orientaciones 2D y utilizando el módulo de cultivos-corner en la vista 3D.
   Nota: Una guía detallada del protocolo de resolución de problemas se puede encontrar en Ertürk et al ^4.

Resultados

Las neuronas están altamente polarizadas células con morfología extremadamente larga. Su función depende de las conexiones que se forman entre sí y con otros tejidos. Por lo tanto, la cartografía de la organización estructural de las neuronas es muy importante para entender cómo funcionan en la salud y la enfermedad. Sin embargo, el paradero de tales enormes conexiones neuronales a lo largo de todo el sistema nervioso conectómica-recientemente nombrados ¹¹ - sigue siendo uno de los retos más difíciles de la neurociencia. Con este fin, tanto en la UE ¹² y EE.UU. ¹³ han puesto en marcha grandes proyectos para mapear el cerebro humano.

Mientras 3DISCO se puede emplear en diversos órganos, que ha sido particularmente útil para rastrear conexiones neuronales largos en la médula espinal y el cerebro. Por ejemplo, utilizando exploraciones ultramicroscopía de grandes segmentos de la médula espinal despejadas, las conexiones axonales pueden seguirse durante centímetros en el roedor de la médula espinal (La Figura 2). En forma similar, todo el cerebro aclarado de ratón (Figura 3a) y el hipocampo (Figura 3b) se pueden obtener imágenes a seguir conexiones neuronales en el cerebro.

Cuando se utiliza la microscopía confocal de fotón o múltiples en órganos despejadas, la resolución de formación de imágenes se puede mejorar de manera significativa, especialmente en dimensión z. Por ejemplo, múltiples de formación de imágenes de fotones de las médulas espinales de ratones de línea despejadas GFP-M (Figura 4A) logra una imagen sin fisuras a través de toda la profundidad (~ 1,5-2 mm) de la médula espinal. Microscopia confocal en la médula espinal despejado ofrece una mejor resolución de una forma similar (Figuras 4b y c). Múltiples imágenes de microscopía de fotones de cerebros despejadas proporciona imágenes de muy alta resolución para visualizar los detalles finos de las estructuras neuronales, incluyendo las espinas dendríticas (Figura 5). Las muestras para 3DISCO pueden ser etiquetados de varias maneras, incluyendo la expresión del transgen, virAl transfección, el trazado de colorante y el etiquetado de anticuerpos. Por ejemplo, es posible marcar toda la vasculatura del cerebro (figuras 6a y b) y la médula espinal (Figuras 6c y d) el uso de lectina conjugada trazadores fluorescentes ^4, que se puede utilizar para estudiar la barrera hematoencefálica (BBB ) en la salud y la enfermedad.

Ambos astrocitos y microglia son altamente implicados en la patología de la neurodegeneración, incluyendo las enfermedades de Alzheimer y lesiones traumáticas ^14,15. Uso de 3DISCO, su densidad y la distribución en la médula espinal (Figura 7) o el cerebro pueden ser estudiados.

Tejidos no neuronales también se pueden obtener imágenes. Por ejemplo, células de Clara en la totalidad de los pulmones de roedores pueden ser immunolabeled con anticuerpos y la imagen sin seccionar en un solo nivel de célula (Figura 8). Del mismo modo, es posible borrar y celdas de imagen, por ejemplo,células alfa en el tejido pancreático unsectioned (Figura 9).

Figura 1. 3DISCO compensación tejido hace que los tejidos unsectioned transparentes para obtener imágenes de tejidos profundos. Sin declarar (a) y borrado (b) los tejidos de la médula espinal, como se ve por la luz visible. Tras la limpieza, el tejido de la microscopia de escaneo láser de profundidad se hace posible. (C) los tejidos de la médula espinal no liquidados y compensados ​​fueron imágenes por microscopía de 2 fotones. Las barras de escala en a, b = 0,5 mm y en c = 100 m.

Figura 2. 3DISCO de formación de imágenes de la médula espinal a seguir extensiones axonales. La médula espinal diseccionado de Thy-1 línea de ratón transgénico GFP (GFP-M) se divide en trozos más pequeños (~4 mm). Después de seguir el protocolo de compensación para pequeños tejidos (Tabla 1) las médulas espinales transparentes se visualizaron utilizando ultramicroscopía. Reconstrucciones en 3D de un segmento de 4 mm ~ médula espinal en horizontal (a), coronal (b) y vista sagital (c). (D) Representante trazó axones (rojo) se muestran en la vista transparente en escala de grises. (E) de visión de alta magnificación de la región indicada en (d). Las barras de escala en A, B, C, D = 0,5 mm y en e = 20 micras.

Figura 3. 3DISCO imágenes del cerebro y el hipocampo despejado. Ejemplos de cerebros y los hipocampos de ratones GFP-M despejadas fueron imágenes con una ultramicroscopio. Visualizaciones en 3D de todo el cerebro (a) y el hipocampo (b) que demuestran la netwo neuronalrks en los tejidos transparentes fotografiados. Las barras de escala en a = 2 mm y en b = 20 m.

Figura 4. Aclaración del tejido mejora la resolución obtenida por múltiples fotones y microscopía confocal. Segmentos de la médula espinal de ratones transparentes GFP-M fotografiada por las múltiples fotones (a) o microscopía confocal (b, c). Tenga en cuenta que la limpieza sustancialmente mejora la resolución y la profundidad de formación de imágenes revelando la estructura fina de los axones y dendritas. Las barras de escala en un = 100 micras y en b, c = 20 micras.

Figura 5. 3DISCO imágenes de las espinas dendríticas. Tejido cerebral de ratones transparente GFP-M fotografiados por múltiples fotones. Visualizaciones 3D de región de la corteza escaneada presentados en el versículoperspectivas ticos (a) y horizontales (b). (C) ~ 50 micras de proyección de los niveles indicados en (a, b). (D) de alta magnificación de la región indicada en (c) la demostración de los detalles finos de las estructuras neuronales, incluyendo las espinas dendríticas (puntas de flecha). Las barras de escala en a = 50 m, en b, c = 25 micras, en d = 5 micras.

Figura 6. 3DISCO de la vasculatura. Para etiquetar los vasos sanguíneos en los órganos enteros, se usa un colorante de lectina-FITC durante la perfusión (antes de la compensación) como se describe ^16. Vale la pena mencionar que se encontró que la inyección vena de la cola del trazador da una mejor señal sobre la perfusión cardiaca del trazador. Después de recoger los cerebros fijos y la médula espinal, se borran y imaged por ultramicroscopía. Visualización en 3D de toda la vasculatura del cerebro del ratón en el mapa de calor (a) y en escala de grises (a). (B) visualización en 3D de la vasculatura de un segmento de médula espinal de ratón en mapa de calor (C) y de escala de grises (D). Los mapas de calor se generan en función de la intensidad de la tinción de lectina; azul: baja intensidad (al fondo) y el rojo: alta intensidad (vasculatura). Las barras de escala en a = 2 mm, b = 1 mm, y en c, d = 250 m.

Figura 7. 3DISCO de células gliales en el tejido del SNC despejado. Las médulas espinales de ratones transgénicos que expresan GFP en microglia TGH (CX3CR1-EGFP) o astrocitos TgN (hGFAP-ECFP) fueron despejados y imágenes de microscopía de fotones múltiples. Representación 3D de microglia se muestra como el volumen de la visualización de la superficie (a) y la visión transparente ( (C) Una proyección óptica (~ 50 m) se presenta para mostrar los detalles de la microglia en la médula espinal. Representación 3D de astrocitos se muestra como la visualización de volumen de superficie (a) y la visión transparente (b). (F) Una proyección óptica (~ 50 m) se presenta para mostrar los detalles de los astrocitos en la médula espinal. Las barras de escala en a, b, d, e = 100 micras y en C, F = 50 micras.

Figura 8. 3DISCO de un lóbulo de todo el montaje de pulmón con la tinción de anticuerpos de las células Clara. Para la tinción de anticuerpos todo el montaje de los lóbulos pulmonares, 10 semanas de edad, los ratones Balb / c hembras fueron perfundidos a través del ventrículo derecho con PBS con el fin de eliminar la sangre de los pulmones. Los pulmones fueron posteriormente se inflaron con PFA al 4% y se fijaron O / N a temperatura ambiente en un fijador al menos tres veces el volumen de the tejido. Al día siguiente, los pulmones se enjuagaron brevemente en PBS y el lóbulo derecho fue puesto en 5 ml de 1% de Triton X-100 en PBS durante la permeabilización durante 48 horas o hasta que el tejido se hundió. Todas las tinciones se realizaron en 0,2% de Triton X-100 en PBS que contenía FBS al 5% y 2% de BSA y enjuagues estaban en 0,2% de Triton X-100 en PBS. La tinción con anti-CC10 fue durante 72 horas a 4 ° C, seguido de lavados extensivos para aproximadamente 6 horas. Etiquetado fluorescente del anticuerpo primario se logró con anti-cabra-Alexa Fluor-594 anticuerpo secundario durante la noche a 4 ° C, seguido de lavados extensivos durante 6 horas a durante la noche. El día siguiente, lóbulos teñidas se aclaró a través de 50%, 70%, y 80% de THF durante 30 min cada uno seguido por tres lavados de 30 min en 100% de THF, seguido por 20 min en DCM, seguido por 30 min en DBE. Las barras de escala en a y b = 1 mm y en c = 100 m.

Figura 9. 3DISCO de páncreas. Después de la perfusión de los ratones como se describió anteriormente en el protocolo, el páncreas se disecó y se aclaró con el protocolo corto. La fluorescencia se deriva de ROSA26 LSL tdTomato recombinación inducida por el tratamiento con tamoxifeno de ratones que portan un transgén de BAC 200 kb que abarca el locus de ratón glucagón endógeno con CreERT2 insertados en el ATG de glucagón. Las puntas de flecha señalan algunas de las células alfa marcados con fluorescencia en el islote. Las barras de escala en a, b y c = 1 mm, y en d = 500 m.

Tabla 1. Protocolos de limpieza y eliminación de tejido para diversos tejidos. Ejemplos de protocolos de limpieza y eliminación de tejido para diferentes tejidos. Tenga en cuenta que el tiempo de compensación para cada paso se puede reducir o ampliar, según sea necesario para mejorar el rendimiento de compensación. El peso aproximado de los tejidos pequeños es de ~ 20 a 100 mg y el cerebro es ~ 300-500 mg.TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

Discusión

Métodos de limpieza y eliminación de tejido tienen como objetivo reducir la dispersión de la luz de imagen, haciendo coincidir los índices de refracción de las diferentes capas de tejido en los órganos de inmediata disposición. Como resultado, la luz de formación de imágenes puede penetrar profundamente en los tejidos y estimular las células marcadas / moléculas. Este viejo concepto de tejido de compensación ¹⁷ se ha ganado cada vez más atención después de la primera aplicación sofisticada de la técnica en los cerebros de ratón intactas por Dodt y colegas ^2. Desde entonces, hay una creciente lista de nuevos métodos de compensación incluyendo 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY y SeeDB ^3,4,7,18-20. En esencia, todos ellos tienen como objetivo hacer que los órganos transparentes para imágenes de tejidos profundos mediante la preservación de la etiqueta fluorescente. Entre ellos, 3DISCO se destaca como uno de los métodos más sencillos y reproducibles. Se compara con relativa rapidez a otros métodos de compensación mencionados anteriormente (1-5 días vs 2-3 semanas para los cerebros adultos, respectivamente) ^21. Ya ha sido el éxitoplenamente aplicado a diferentes órganos, como el cerebro, la médula espinal, los ganglios linfáticos, el bazo, el pulmón, los tumores sólidos, el páncreas y las glándulas mamarias ^3,4,9. Además, varias publicaciones de grupos de investigación independientes que ya utilizan este método para obtener imágenes como resultado ^22,23. Sin embargo, diferentes procedimientos de compensación de tejido podrían ser ventajoso para diferentes condiciones. Por ejemplo, mientras Sca / ey SeeDB se aplican mejor en tejidos embrionarios ^6,7, son los métodos de compensación a base de agua, que podrían ser más fáciles de manejar durante la exploración. En contraste, la claridad es un método de compensación complicado y costoso. Sin embargo, puede ser ventajoso en el contexto del etiquetado de anticuerpos, especialmente en las grandes tejidos tales como cerebro ^8.

El paso más crítico para obtener los mejores resultados de las imágenes de 3DISCO es etiquetado tejido, que se realiza antes de la limpieza del tejido. Es fundamental comenzar con la señal fluorescente fuerte posible. Esto puede be conseguirse de varias formas que incluyen la expresión transgénica de las proteínas fluorescentes, la localización por colorantes sintéticos, transfección viral o etiquetado de anticuerpos. Se debe tener en cuenta que cualquier procedimiento de compensación se reducirá la señal fluorescente de los tejidos. Por lo tanto, si la señal fluorescente no es lo suficientemente fuerte como al principio - es decir, que no es fácilmente detectable antes de que el intercambio de información de imágenes de los tejidos aclarados dará resultados pobres.

Hay algunas limitaciones de los métodos que están a la espera de mejoras despejar. Una limitación importante es que, puesto que los reactivos de compensación alteran la estructura de los órganos despejadas, no pueden ser utilizados en el tejido vivo. Por lo tanto, los experimentos tales como con mEos2 fotoactivable ²⁴ se deben realizar antes de la fijación y la limpieza. Tras la limpieza, super-resolución de imagen de la señal fluorescente de proteínas brillantes y fotoestable se hace posible. Además, debido a que el protocolo de intercambio de información disminuye elintensidad de las proteínas fluorescentes, los órganos despejadas no se pueden almacenar durante períodos prolongados. Es importante señalar que algunos órganos son más difíciles de ser limpiado. Sobre todo, si los órganos diseccionados retienen grandes cantidades de células de la sangre (por ejemplo, el bazo, el hígado), son relativamente difíciles de borrar y la imagen. También es relativamente más difícil de lograr una compensación completa para grandes tejidos, tales como roedores cerebro adulto. Tales tejidos pueden necesitar tiempos de incubación más largos, lo que podría, por otra parte, reducir la señal fluorescente. Además, el desarrollo de métodos de microscopía que puede imagen grandes órganos transparentes a la vez en una de alta resolución es una necesidad a la espera de ser tratados. Otra limitación importante de la técnica es etiquetado tejido. Mientras que una señal fluorescente fuerte a través de la expresión genética o el virus es ideal, no cada célula o molécula pueden ser etiquetados genéticamente o de forma viral. Por otro lado, el etiquetado de anticuerpos de tejidos gruesos no es un procedimiento directo o incluso no POssible en la mayoría de los casos. Se puede necesitarse protocolos permeabilización especiales y tiempos de incubación largos (varios días a unas pocas semanas) ^3. También es importante tener en cuenta que los tejidos se encogen ~ 20% en cada dimensión (medida para el tejido de la médula espinal) después de limpiar debido principalmente a la deshidratación y de eliminación de lípidos. Esta contracción se produce ratiometrically y debe corregirse en los pasos de cuantificación. Como se observa en los resultados presentados, estructuras marcadas fluorescentemente permanecen intactas, que es la indicación de la integridad de la proteína en los tejidos aclarados. Debido a la naturaleza hidrófoba del tejido aclarado final, no se puede teñir con más anticuerpos o incrustado en soluciones de agua contiene, por ejemplo, Focusclear-que se utiliza en glicerol CLARITY-o 80%. Finalmente, es un desafío para analizar abrumadoras tamaños de datos de imágenes. Por ejemplo, cuando toda una cerebro murino se escanea a una resolución celular, que sería muy difícil de localizar y cuantificar str deseadauctures (por ejemplo, redes neuronales o gliales) y comparar más de diferentes muestras de una manera automatizada. En resumen, mientras que los investigadores tratan de descubrir nuevos métodos de compensación, los diversos problemas mencionados (dificultad de limpieza de diversos tejidos, imágenes en alta resolución de las zonas más grandes, y el análisis de datos complicados) deberían mejorarse en paralelo.

En conclusión, las técnicas de limpieza y eliminación de tejido recientemente desarrollados, incluyendo 3DISCO, elegantemente demuestran que la alta resolución de imágenes en 3D de los órganos intactos, ahora es posible. El uso de estos métodos, los científicos pueden obtener información anatómica de las células y moléculas en el órgano intacto. Estos estudios de imagen en 3D pioneros sobre órganos transparentes inspiran un creciente número de investigadores a descifrar anatómica compleja y organizaciones moleculares de los tejidos / órganos en la salud y la enfermedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
		Thy-1 GFP (GFP-M)	se puede obtener de Jackson.
		CX3CR1 GFP	se puede obtener en el laboratorio Littman de la Universidad de Nueva York.
		TgN (hGFAP-ECFP)	Se puede obtener de Jackson.
Paraformaldehído	Sigma	P6148
Na2HPO4	Mallinckrodt	7917-16
NaH2PO4	Mallinckrodt	7892-04
2-2-2 Tribromoetanol	Sigma	T48402
2-metil-2-butanol	Sigma	152463	utilizado para preparar la solución de Avertin.
Salina	Braun
Tetrahidrofurano	Sigma	186562-12X100ML
Diclorometano	Sigma	270997-12X100ML
Éter dibencilo	Sigma	Sigma, 108014-1KG
Alcohol bencílico	Sigma	305197-100ML
Benzoato de bencilo	Sigma	B6630-250ML
Lectin FITC	Sigma	L0401-1MG
anti-CC10	Santa Cruz	SC-9772	0.3888888889
Heparina	APP productos farmacéuticos	504001	Utilizado en perfusión.
Viales de vidrio	VWR	548-0554
Pinzas	FST	11251-10
Mini Rotator	VWR	100498-878
Papel de aluminio	Fisherbrand	01-213-104
Botellas de almacenamiento de medios de 100 ml	Botellas de medios Kimax	EW-34523-00
Bomba de perfusión Minipuls evolution con cabezal de bomba de caudal medio MF4*	Gilson, Inc	F110701 y F117606
portaobjetos de microscopía	VWR	48311-703
FastWell	Grace Bio-Labs	FW20
Cubreobjetos	Corning	2940-245
Placa de Petri de vidrio	Corning Pyrex	3160-101
Cemento dental	Lang Dental	1223PNK
Prueba de peróxido Quantofix Tiras	Sigma	37206
Amira con RT módulo de microscopía de resolución	Visage Imaging	software
Imaris	Bitplane	software
ImageJ	NIH	freeware