Interferometría Bio-capa para Cinética de interacciones proteína-proteína y alostéricos Efectos ligando medición

Resumen

Los protocolos siguientes describen ensayos cinéticos de las interacciones proteína-proteína con Interferometría Bio-capa. F-tipo ATP sintasa, que está implicado en el metabolismo de la energía celular, puede ser inhibida por su subunidad ε en bacterias. Hemos adaptado Interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones del complejo catalítico con el dominio del ε inhibidora C-terminal.

Resumen

Se describe el uso de la interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones inhibidoras de ε subunidad con el complejo catalítico de Escherichia coli ATP sintasa. Bacteriana de tipo F ATP sintasa es el objetivo de un nuevo antibiótico, aprobado por la FDA para combatir la tuberculosis resistente a los medicamentos. La comprensión de bacterias específicas auto-inhibición de la ATP sintasa por el dominio C-terminal de la subunidad ε podría proporcionar un nuevo medio para orientar la enzima para el descubrimiento de fármacos antibacterianos. El dominio C-terminal de ε sufre un cambio conformacional dramática cuando las transiciones de la enzima entre los estados activos e inactivos, y ligandos de sitio catalítico pueden influir en cuál de conformaciones de ε es predominante. El ensayo mide la cinética de unión / disociación de ε con el complejo catalítico, e indirectamente meaSures el cambio de ε unido a la enzima hacia y desde la conformación inhibidor aparentemente nondissociable. La señal de interferometría Bio-capa no es excesivamente sensible a la composición de la solución, por lo que también se puede utilizar para vigilar los efectos alostéricos de ligandos de sitio catalítico sobre los cambios conformacionales de ε.

Introducción

Interacciones proteína-proteína son importantes para muchos procesos biológicos, y los métodos ópticos de etiqueta libre como resonancia de plasmón superficial (SPR) se han utilizado in vitro para estudiar la cinética de la unión y la disociación ^1. La mayoría de los métodos de etiquetado libre inmovilizar una biomolécula en una superficie del sensor y el uso de una señal óptica para detectar una pareja de unión de la solución, ya que se asocia con la biomolécula inmovilizada ^1. Mientras SPR es un método altamente sensible, es propenso a la interferencia debido a los cambios en el índice de refracción de la solución que fluye sobre el sensor ^2. Aunque no es tan sensible como la SPR, Bio-capa de Interferometría (BLI) se ve menos afectada por cambios en la composición de la muestra ^1,3. BLI utiliza biosensores de fibra óptica que tienen un recubrimiento biocompatible patentada en la punta. El sistema utilizado aquí (Octeto-RED96) contiene ocho espectrofotómetros. La luz blanca se canaliza a una fila de sondas que se mueven en un brazo robótico. Los sensores de fibra óptica are recogido por las sondas y se trasladó a una placa de 96 pocillos que contenía las muestras. Una de las moléculas diana se inmoviliza sobre la superficie del biosensor. Entonces sensores se mueven a los pocillos que contienen la pareja de unión en solución. BLI supervisa asociación de la pareja de unión con la molécula inmovilizada y, a continuación, controla la disociación después de mover los sensores a la solución sin la pareja de unión. La unión de moléculas a la superficie del biosensor conduce a cambios en la interferencia óptica entre las ondas de luz que reflejan de nuevo a los espectrofotómetros de una superficie interna y desde la interfaz externa entre el sensor y la solución. Estos cambios en la interferencia pueden ser cuantificados y se utilizan para determinar las constantes de transferencia de la unión y la disociación, que se resumen en la animación de la figura 1.

Hemos aplicado BLI para medir las interacciones entre el complejo catalítico de la ATP sintasa bacteriana y su subunidad ε, que puede auto-inhiben la enzima. Sy ATPnthase es un nanomotor rotatorio membrana embebido que cataliza la síntesis y la hidrólisis de ATP ^4. El complejo catalítico (F ₁₎ se puede aislar en una forma soluble que funciona como una ATPasa. Ε Subunidad tiene dos dominios: el dominio N-terminal (NTD) es necesario para el montaje correcto y el acoplamiento funcional de la enzima pero no interactuar directamente con las subunidades catalíticas, el dominio C-terminal (CTD) puede inhibir la enzima mediante la interacción con múltiples subunidades catalíticas ^5,6. Esta regulación ε-mediada es específico de ATP sintasas bacterianas y no se observa en el homólogo mitocondrial. ATP sintasa se ​​ha convertido en un objetivo para los fármacos antibacterianos, como lo demuestra la reciente aprobación de la FDA de bedaquiline para tratar la tuberculosis resistente a los medicamentos ^7. Por lo tanto, la orientación papel inhibidor de ε para el descubrimiento de fármacos podría producir antibacterianos que no inhiben la ATP sintasa mitocondrial. Con el complejo catalítico aislada (F _1), εse convierte en una subunidad disociable. Sin embargo, con ε unida a F _1, la εCTD puede sufrir un cambio conformacional dramática, parcialmente insertar en la cavidad central de la enzima y la formación de un estado de inhibición que es poco probable que se disocian directamente ^6,8. Utilizamos BLI para medir la cinética de F ₁ / ε de unión y de disociación, e indirectamente, para examinar los efectos alostéricos de sitio catalítico de ligandos sobre la conformación de ε.

En nuestro sistema, ε fue elegido para la inmovilización en la superficie del sensor ya que la señal de BLI (como SPR) es sensible a la masa de las moléculas de unión en la superficie. La subunidad ε es pequeño (~ 15 kDa) en relación con el principal complejo de F ₁ (~ 347 kDa). Por lo tanto, una señal de BLI más grande será el resultado de la unión de F ₁ a ε inmovilizada. Con el fin de supervisar F ₁ disociación, que puede ser muy lento, ε deben estar fuertemente inmovilizado. Por lo tanto se optó por biotinilar; E inmovilizarlo sobre biosensores recubiertas con estreptavidina. Las proteínas pueden ser biotinilados por (i) modificación aleatoria de lisinas superficiales ^9, (ii) reacción de una cisteína nativo o de ingeniería único con un reactivo de maleimida-biotina ¹⁰ o (iii) añadir genéticamente un péptido específico de biotina-aceptor que está biotinilado durante enzimáticamente la expresión in vivo de la proteína marcada ^11. En nuestro sistema, ε está biotinilado utilizando el método (iii) ^8. Una vez ε-biotina marcado se inmoviliza sobre sensores de estreptavidina, BLI puede medir la unión y la disociación de F ₁ que ha sido empobrecido de la subunidad ε (F ₁ (-ε)). Para los experimentos descritos aquí, los ensayos preliminares se han realizado para determinar una cantidad razonable de la proteína biotinilada para inmovilizar en los sensores. Esto puede variar, dependiendo del peso molecular de la proteína y su pareja de unión, pero el objetivo es determinar una cantidad mínima de proteína A inmovilizada tsombrero proporciona (i) aceptable señal-a-ruido para la cinética de unión con una baja concentración de la pareja de unión (por debajo de K _D) y (ii) una distorsión mínima de la cinética de unión con la concentración cerca de la saturación de la pareja de unión. También, estequiometría de biotinilación puede variar (pero evite> 1 mol biotina / mol de proteína), por lo que puede ser necesario algún ensayo inicial para cada nuevo lote de proteína biotinilada para confirmar que una señal de BLI consistente se puede lograr durante la inmovilización en el recubiertas con estreptavidina sensores.

Protocolo

1. Programación del Instrumento de Ensayo BLI

Encienda el instrumento por lo menos una hora de antelación para que la lámpara se caliente, lo que es necesario para minimizar el ruido y la deriva de la señal óptica durante el experimento. Ajuste la temperatura deseada a través de la pestaña instrumento para precalentar el soporte de la placa de la muestra. Entonces pongo el diseño experimental en el software de adquisición de datos. Seleccione "Experimento Nueva Cinética" en la ficha Asistente Experimento. Esto presenta un menú con pestañas con todos los pasos que se deben definir.

1.1. Placa Definición

Definir las columnas para ser utilizado en la placa de muestra de 96 pocillos. Asignar columnas para contener tampón, proteína inmovilizada o pareja de unión. Para cada asociación bien, introduzca la concentración de la pareja de unión que se utilizará. Nota: la definición placa mostrada en la Figura 2 tiene opciones para ensayos distintos.

1.2. Ensayo Definición

ONTENIDO "> Definir todos los pasos necesarios para el ensayo. Estos incluyen (i) Línea de base (varios), (ii) la carga, (iii) Asociación y (iv) La disociación de la pareja de unión. Entonces, tal como se describe a continuación, ligarse etapas de ensayo individuales con columnas de los pozos de la placa de la muestra mediante la selección de la etapa de ensayo y, a continuación, haga doble clic en la columna respectiva. Estos programas de los sensores que se mueven de una columna de pozos a otra durante el ensayo.

1. Base
   Comenzar con un paso de línea de base breve (≥ 60 seg), con sensores en tampón de ensayo (Figura 2, columna 1), para establecer señales iniciales BLI en la placa de 96 pocillos.
2. Cargando (inmovilización de la proteína biotinilada en los sensores)
   Asignar los sensores a los pozos que van a contener la proteína biotinilada (Figura 2, columna 2). Utilice la función de umbral para alcanzar un nivel predeterminado de unión (véase la Introducción). Establezca la opción de umbral de modo que todos los sensores estarán movimientoD a la siguiente columna de pozos cuando uno cualquiera de los sensores alcanza el umbral.
3. Base
   Incluir un paso de línea de base en tampón (Figura 2, columna 3; típicamente> 5 min) para lavar las proteínas biotiniladas no inmovilizado a partir de los sensores y establecer nuevos, señales de línea de base estable. Para los ensayos básicos de unión / de disociación sólo (como en la Figura 3), incluir un paso adicional de línea de base (60 seg) con sensores en nuevos pozos de tampón (Figura 2, columna 4) antes de la etapa de asociación.
4. Asociación (de la pareja de unión a la proteína inmovilizada)
   Para un ensayo básico de unión / disociación (como en la Figura 3), seleccionar un rango de concentraciones de pareja de unión que se utilizará para diferentes sensores / pozos (Figura 2, columna 5). Ajustar el tiempo de paso de manera que al menos una concentración de saturación de la pareja de unión debe enfoque de equilibrio señal de unión. Para unaensayo para probar los efectos alostéricos de pequeños ligandos sobre la disociación del complejo proteína-proteína (como en la Figura 5), seleccionar un único alta concentración de pareja de unión (~ 10 veces por encima de la estimación de K _D) para su uso en todos los pocillos de asociación.
5. Disociación (de la pareja de unión)
   Para un ensayo básico de unión / disociación sólo (como en la Figura 3), designar los sensores para volver a la columna 4 (figura 2), los mismos pozos tampón tal como se utiliza para la línea de base extra antes de Asociación. Para un ensayo para probar los efectos alostéricos de pequeños ligandos, en lugar designar sensores para mover a la columna 6 (Figura 2), donde cada pocillo puede contener tampón más diferentes ligandos alostéricos.

1.3. Asignación de sensor

Indique las ubicaciones en la bandeja de sensor que contendrá sensores prehumedecida para el ensayo. Identifique las posiciones vacías ya que el experimento será FAIl si hay sensores son recogidos.

1.4. Experimento Comentario

Visualice todas las medidas planificadas para verificar si hay errores y volver a corregirlos.

1.5. Ejecutar Experimento

Introduzca los datos necesarios, incluyendo la ubicación de los archivos de datos. Introduzca la temperatura deseada para el experimento. Si los sensores todavía requieren prehumectación, seleccione la opción de aplazar el inicio del experimento. Por último, una vez que toda la preparación de la muestra es completa (paso 2) y tanto la placa de la muestra y la bandeja de sensor se cargan en el instrumento, haga clic en el botón Continuar para realizar el ensayo.

2. Preparación de la muestra

1. Preparar un tampón de ensayo adecuado. Tampón utilizado para los experimentos mostrados en las Figuras 3 y 5: 20 mM de MOPS (3 - (N-morfolino) propanosulfónico), Tris (Tris (hidroximetil) amino-metano) (añadido para ajustar el pH a 8,0), 50 mM de KCl. Incluya BSA (albúmina de suero bovino, libre de ácidos grasos, 0.5mg / ml final) en el tampón para todas las etapas del ensayo y para todas las diluciones de la proteína biotinilada o pareja de unión para minimizar la unión no específica de proteínas a los sensores.
2. Diluir la proteína biotinilada (ε) en tampón de ensayo a una concentración apropiada (véase la introducción).
3. Preparar diluciones de la pareja de unión (F ₁ (-ε)) en tampón de ensayo (véase la discusión para el rango de concentraciones para usar).
4. Prehumedecido los sensores recubiertas de estreptavidina durante al menos 10 minutos para eliminar el recubrimiento de sacarosa protector. Retire el bastidor que contiene el sensor-de la bandeja de sensor y insertar una placa de 96 pocillos en la parte inferior de la bandeja, deslizando una esquina de la placa en la muesca de orientación en la bandeja. Para la columna de sensores para ser utilizado, añadir 200 l de tampón de ensayo por pocillo en que la columna de la placa de 96 pocillos. Devuelva el estante de los sensores a la bandeja con la orientación correcta (con pestañas en las ranuras).
5. Como asignado durante la programación en el paso 1, llenar los pozos of la placa de muestra con tampón de ensayo o las diluciones de proteínas apropiadas, como en la Figura 2. Evitar la introducción de burbujas, ya que pueden causar ruido en la señal óptica. Incluir uno o más pocillos de referencia que omiten o bien (i) la proteína biotinilada o (ii) la pareja de unión.
6. Abra la puerta del aparato e inserte la bandeja de sensor en la etapa (a la izquierda), con las lengüetas de la bandeja se insertan en las ranuras de la etapa. Introduzca la placa de la muestra en el soporte de la placa (a la derecha), asegúrese de que la placa está sentado plana y en la orientación correcta, tal como se indica en el soporte de la placa. Cierre la puerta y comience el análisis del programa de adquisición de datos (paso 1.5).

3. Proceso de datos

1. Después de que el ensayo se ha ejecutado, abre el software de análisis de datos y la carga de la carpeta que contiene los datos. Haga clic en la pestaña de "elaboración", para ver un menú por pasos de procesamiento (a la izquierda) y los datos cinéticos primas, con cada sensor (AH) asignado un color diferente (verLa Figura 3).
2. Bajo "Selección de datos", haga clic en el botón "Selección del sensor". En el "Mapa Sample Plate", designar a los pozos para 1 o 2 sensores de control (G, H en el ensayo de la Figura 3) como pozos de referencia. En el menú Procesamiento, marque la casilla "Resta" y seleccione "Referencia Wells" para restar la señal de referencia (simple o promedio) de la señal de cualquier otro sensor.
3. Alinear todos los rastros que Y = 0 utilizando el paso "Alinear eje Y". Seleccione "Línea Base" como el paso de alineación (que es la última línea de base antes de la etapa de Asociación). Para el "Intervalo de tiempo", introduzca los últimos 10 seg de que la línea de base (es decir, 50 a 60 segundos para una línea de base de 60 segundos, como en la figura 3).
4. Marque la casilla "Inter-paso de corrección" para reducir al mínimo los cambios de señal entre los pasos de asociación y disociación. Seleccione alinear a línea de base o disociación.
5. Seleccionar la función de filtrado Savitzky-Golay en la mayoría de los casos y haga clic en "Proceso de datos!" para proceder. Inspeccione visualmentelos datos finales procesados ​​(panel inferior derecho). Con ensayos destinados para el análisis global de datos (como en la Figura 4), ​​si trazas de señal muestran un cambio significativo entre la Asociación y pasos de disociación, cambiar la selección de la disociación o de línea de base para la "Corrección Inter-paso" y volver a procesar los datos antes de proceder a los datos Análisis.

4. Análisis de Datos

Haga clic en la pestaña "Análisis" en el análisis de datos para comenzar. Nota: el ejemplo de los pasos a continuación son para el análisis global de múltiples curvas de unión / disociación (como en la Figura 3).

1. Por "paso a Analizar", elija asociación y disociación. Para el "Modelo", seleccione 1:01. Nota: Las demás opciones disponibles son limitados.
2. Para el "montaje", elija Global (Full). Para "Agrupar por" seleccione Color (como en el gráfico). Seleccione "R _max UNLINKED Por Sensor" para permitir la instalación independiente de R _max (respuesta de la señal máxima a saturar la unión del partner a la proteína inmovilizada). Nota: hacemos esto para la mayoría de los ensayos, como los sensores varían ligeramente en la cantidad de proteína inmovilizada (véase la Figura 3, cargando).
3. En la tabla que se muestra, asegúrese de que todos los rastros de los sensores para ser analizados tienen el mismo color, por lo que serán analizados como un conjunto global. Si es necesario, seleccione uno o más sensores traza omitir de ajuste mundial: en la columna "Incluir", haga clic en la posición del sensor deseado y seleccione "Excluir Wells".
4. Haga clic en "ajuste de curvas!" para iniciar el análisis de regresión no lineal. Examine los resultados apropiados, que incluyen (i) superposición de las curvas de regresión con los rastros de datos del sensor (como en la figura 4), ​​(ii) los gráficos de residuos de ajuste, y (iii) una tabla con valores de los parámetros determinados (constantes de velocidad, R _max, K _D) y la estadística (errores estándar de los parámetros, Chi-cuadrado, ^R2).
5. En la sección "Exportación de datos", guardar los resultados de ajuste haciendo clic en "Exportar tabla a. Csv Archivo". Para graphing o más análisis de datos / curvas ajustadas con otro software, haga clic en "Exportar resultados apropiados" para guardar los datos de cada sensor y curva ajustada en un archivo de texto.

Resultados

De unión en tiempo real y la cinética de disociación BLI se muestra en la Figura 3. Este experimento se realizó con tampón de ensayo en asociación y disociación. Este experimento se inició con una etapa de línea de base 10 minutos ya que los sensores se han prehumedecido sólo brevemente. Siguiente, ε biotinilado se cargó en los sensores. No disociación detectable de ε se produjo a lo largo de todos los pasos restantes como se ve desde la curva de referencia (G), que no tenía pareja de unión agregó. Un s...

Discusión

Instrumentos disponibles en la actualidad para BLI permiten el rendimiento y una flexibilidad significativa en los ensayos para las interacciones biomoleculares. Varias muestras de solución se dispensan en los pocillos de una placa de microtitulación de negro, y un conjunto de sensores de BLI paralelas están programadas para moverse adelante y atrás entre las columnas de pozos en la placa. Las muestras se agitan por agitación orbital durante todo el ensayo. El sistema utilizado aquí tiene 8 sensores y utiliza una placa ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Octeto-RED96	Pall/Forté Bio	30-5048
Albúmina sérica bovina	Sigma	A6003-10G	Biosensor libre de ácidos
grasos/Estreptavidina	Pall/Forté Bio	18-5019	Bandeja de 96 sensores
Placa de microtitulación	Greiner Bio-one	655209	Black, Polipropileno
Software de adquisición de datos	Pall/Forté Bio	Versión 6.4	Versiones más recientes disponibles
Software de análisis de datos	Pall/Forté Bio	Versión 6.4	Versiones más nuevas disponibles