Interferometría Bio-capa para Cinética de interacciones proteína-proteína y alostéricos Efectos ligando medición

Interacciones proteína-proteína son importantes para muchos procesos biológicos, y los métodos ópticos de etiqueta libre como resonancia de plasmón superficial (SPR) se han utilizado in vitro para estudiar la cinética de la unión y la disociación ^1. La mayoría de los métodos de etiquetado libre inmovilizar una biomolécula en una superficie del sensor y el uso de una señal óptica para detectar una pareja de unión de la solución, ya que se asocia con la biomolécula inmovilizada ^1. Mientras SPR es un método altamente sensible, es propenso a la interferencia debido a los cambios en el índice de refracción de la solución que fluye sobre el sensor ^2. Aunque no es tan sensible como la SPR, Bio-capa de Interferometría (BLI) se ve menos afectada por cambios en la composición de la muestra ^1,3. BLI utiliza biosensores de fibra óptica que tienen un recubrimiento biocompatible patentada en la punta. El sistema utilizado aquí (Octeto-RED96) contiene ocho espectrofotómetros. La luz blanca se canaliza a una fila de sondas que se mueven en un brazo robótico. Los sensores de fibra óptica are recogido por las sondas y se trasladó a una placa de 96 pocillos que contenía las muestras. Una de las moléculas diana se inmoviliza sobre la superficie del biosensor. Entonces sensores se mueven a los pocillos que contienen la pareja de unión en solución. BLI supervisa asociación de la pareja de unión con la molécula inmovilizada y, a continuación, controla la disociación después de mover los sensores a la solución sin la pareja de unión. La unión de moléculas a la superficie del biosensor conduce a cambios en la interferencia óptica entre las ondas de luz que reflejan de nuevo a los espectrofotómetros de una superficie interna y desde la interfaz externa entre el sensor y la solución. Estos cambios en la interferencia pueden ser cuantificados y se utilizan para determinar las constantes de transferencia de la unión y la disociación, que se resumen en la animación de la figura 1.

Hemos aplicado BLI para medir las interacciones entre el complejo catalítico de la ATP sintasa bacteriana y su subunidad ε, que puede auto-inhiben la enzima. Sy ATPnthase es un nanomotor rotatorio membrana embebido que cataliza la síntesis y la hidrólisis de ATP ^4. El complejo catalítico (F ₁₎ se puede aislar en una forma soluble que funciona como una ATPasa. Ε Subunidad tiene dos dominios: el dominio N-terminal (NTD) es necesario para el montaje correcto y el acoplamiento funcional de la enzima pero no interactuar directamente con las subunidades catalíticas, el dominio C-terminal (CTD) puede inhibir la enzima mediante la interacción con múltiples subunidades catalíticas ^5,6. Esta regulación ε-mediada es específico de ATP sintasas bacterianas y no se observa en el homólogo mitocondrial. ATP sintasa se ​​ha convertido en un objetivo para los fármacos antibacterianos, como lo demuestra la reciente aprobación de la FDA de bedaquiline para tratar la tuberculosis resistente a los medicamentos ^7. Por lo tanto, la orientación papel inhibidor de ε para el descubrimiento de fármacos podría producir antibacterianos que no inhiben la ATP sintasa mitocondrial. Con el complejo catalítico aislada (F _1), εse convierte en una subunidad disociable. Sin embargo, con ε unida a F _1, la εCTD puede sufrir un cambio conformacional dramática, parcialmente insertar en la cavidad central de la enzima y la formación de un estado de inhibición que es poco probable que se disocian directamente ^6,8. Utilizamos BLI para medir la cinética de F ₁ / ε de unión y de disociación, e indirectamente, para examinar los efectos alostéricos de sitio catalítico de ligandos sobre la conformación de ε.

En nuestro sistema, ε fue elegido para la inmovilización en la superficie del sensor ya que la señal de BLI (como SPR) es sensible a la masa de las moléculas de unión en la superficie. La subunidad ε es pequeño (~ 15 kDa) en relación con el principal complejo de F ₁ (~ 347 kDa). Por lo tanto, una señal de BLI más grande será el resultado de la unión de F ₁ a ε inmovilizada. Con el fin de supervisar F ₁ disociación, que puede ser muy lento, ε deben estar fuertemente inmovilizado. Por lo tanto se optó por biotinilar; E inmovilizarlo sobre biosensores recubiertas con estreptavidina. Las proteínas pueden ser biotinilados por (i) modificación aleatoria de lisinas superficiales ^9, (ii) reacción de una cisteína nativo o de ingeniería único con un reactivo de maleimida-biotina ¹⁰ o (iii) añadir genéticamente un péptido específico de biotina-aceptor que está biotinilado durante enzimáticamente la expresión in vivo de la proteína marcada ^11. En nuestro sistema, ε está biotinilado utilizando el método (iii) ^8. Una vez ε-biotina marcado se inmoviliza sobre sensores de estreptavidina, BLI puede medir la unión y la disociación de F ₁ que ha sido empobrecido de la subunidad ε (F ₁ (-ε)). Para los experimentos descritos aquí, los ensayos preliminares se han realizado para determinar una cantidad razonable de la proteína biotinilada para inmovilizar en los sensores. Esto puede variar, dependiendo del peso molecular de la proteína y su pareja de unión, pero el objetivo es determinar una cantidad mínima de proteína A inmovilizada tsombrero proporciona (i) aceptable señal-a-ruido para la cinética de unión con una baja concentración de la pareja de unión (por debajo de K _D) y (ii) una distorsión mínima de la cinética de unión con la concentración cerca de la saturación de la pareja de unión. También, estequiometría de biotinilación puede variar (pero evite> 1 mol biotina / mol de proteína), por lo que puede ser necesario algún ensayo inicial para cada nuevo lote de proteína biotinilada para confirmar que una señal de BLI consistente se puede lograr durante la inmovilización en el recubiertas con estreptavidina sensores.

1. Programación del Instrumento de Ensayo BLI

Encienda el instrumento por lo menos una hora de antelación para que la lámpara se caliente, lo que es necesario para minimizar el ruido y la deriva de la señal óptica durante el experimento. Ajuste la temperatura deseada a través de la pestaña instrumento para precalentar el soporte de la placa de la muestra. Entonces pongo el diseño experimental en el software de adquisición de datos. Seleccione "Experimento Nueva Cinética" en la ficha Asistente Experimento. Esto presenta un menú con pestañas con todos los pasos que se deben definir.

1.1. Placa Definición

Definir las columnas para ser utilizado en la placa de muestra de 96 pocillos. Asignar columnas para contener tampón, proteína inmovilizada o pareja de unión. Para cada asociación bien, introduzca la concentración de la pareja de unión que se utilizará. Nota: la definición placa mostrada en la Figura 2 tiene opciones para ensayos distintos.

1.2. Ensayo Definición

1. Base
   Comenzar con un paso de línea de base breve (≥ 60 seg), con sensores en tampón de ensayo (Figura 2, columna 1), para establecer señales iniciales BLI en la placa de 96 pocillos.
2. Cargando (inmovilización de la proteína biotinilada en los sensores)
   Asignar los sensores a los pozos que van a contener la proteína biotinilada (Figura 2, columna 2). Utilice la función de umbral para alcanzar un nivel predeterminado de unión (véase la Introducción). Establezca la opción de umbral de modo que todos los sensores estarán movimientoD a la siguiente columna de pozos cuando uno cualquiera de los sensores alcanza el umbral.
3. Base
   Incluir un paso de línea de base en tampón (Figura 2, columna 3; típicamente> 5 min) para lavar las proteínas biotiniladas no inmovilizado a partir de los sensores y establecer nuevos, señales de línea de base estable. Para los ensayos básicos de unión / de disociación sólo (como en la Figura 3), incluir un paso adicional de línea de base (60 seg) con sensores en nuevos pozos de tampón (Figura 2, columna 4) antes de la etapa de asociación.
4. Asociación (de la pareja de unión a la proteína inmovilizada)
   Para un ensayo básico de unión / disociación (como en la Figura 3), seleccionar un rango de concentraciones de pareja de unión que se utilizará para diferentes sensores / pozos (Figura 2, columna 5). Ajustar el tiempo de paso de manera que al menos una concentración de saturación de la pareja de unión debe enfoque de equilibrio señal de unión. Para unaensayo para probar los efectos alostéricos de pequeños ligandos sobre la disociación del complejo proteína-proteína (como en la Figura 5), seleccionar un único alta concentración de pareja de unión (~ 10 veces por encima de la estimación de K _D) para su uso en todos los pocillos de asociación.
5. Disociación (de la pareja de unión)
   Para un ensayo básico de unión / disociación sólo (como en la Figura 3), designar los sensores para volver a la columna 4 (figura 2), los mismos pozos tampón tal como se utiliza para la línea de base extra antes de Asociación. Para un ensayo para probar los efectos alostéricos de pequeños ligandos, en lugar designar sensores para mover a la columna 6 (Figura 2), donde cada pocillo puede contener tampón más diferentes ligandos alostéricos.

1.3. Asignación de sensor

Indique las ubicaciones en la bandeja de sensor que contendrá sensores prehumedecida para el ensayo. Identifique las posiciones vacías ya que el experimento será FAIl si hay sensores son recogidos.

1.4. Experimento Comentario

Visualice todas las medidas planificadas para verificar si hay errores y volver a corregirlos.

1.5. Ejecutar Experimento

Introduzca los datos necesarios, incluyendo la ubicación de los archivos de datos. Introduzca la temperatura deseada para el experimento. Si los sensores todavía requieren prehumectación, seleccione la opción de aplazar el inicio del experimento. Por último, una vez que toda la preparación de la muestra es completa (paso 2) y tanto la placa de la muestra y la bandeja de sensor se cargan en el instrumento, haga clic en el botón Continuar para realizar el ensayo.

2. Preparación de la muestra

1. Preparar un tampón de ensayo adecuado. Tampón utilizado para los experimentos mostrados en las Figuras 3 y 5: 20 mM de MOPS (3 - (N-morfolino) propanosulfónico), Tris (Tris (hidroximetil) amino-metano) (añadido para ajustar el pH a 8,0), 50 mM de KCl. Incluya BSA (albúmina de suero bovino, libre de ácidos grasos, 0.5mg / ml final) en el tampón para todas las etapas del ensayo y para todas las diluciones de la proteína biotinilada o pareja de unión para minimizar la unión no específica de proteínas a los sensores.
2. Diluir la proteína biotinilada (ε) en tampón de ensayo a una concentración apropiada (véase la introducción).
3. Preparar diluciones de la pareja de unión (F ₁ (-ε)) en tampón de ensayo (véase la discusión para el rango de concentraciones para usar).
4. Prehumedecido los sensores recubiertas de estreptavidina durante al menos 10 minutos para eliminar el recubrimiento de sacarosa protector. Retire el bastidor que contiene el sensor-de la bandeja de sensor y insertar una placa de 96 pocillos en la parte inferior de la bandeja, deslizando una esquina de la placa en la muesca de orientación en la bandeja. Para la columna de sensores para ser utilizado, añadir 200 l de tampón de ensayo por pocillo en que la columna de la placa de 96 pocillos. Devuelva el estante de los sensores a la bandeja con la orientación correcta (con pestañas en las ranuras).
5. Como asignado durante la programación en el paso 1, llenar los pozos of la placa de muestra con tampón de ensayo o las diluciones de proteínas apropiadas, como en la Figura 2. Evitar la introducción de burbujas, ya que pueden causar ruido en la señal óptica. Incluir uno o más pocillos de referencia que omiten o bien (i) la proteína biotinilada o (ii) la pareja de unión.
6. Abra la puerta del aparato e inserte la bandeja de sensor en la etapa (a la izquierda), con las lengüetas de la bandeja se insertan en las ranuras de la etapa. Introduzca la placa de la muestra en el soporte de la placa (a la derecha), asegúrese de que la placa está sentado plana y en la orientación correcta, tal como se indica en el soporte de la placa. Cierre la puerta y comience el análisis del programa de adquisición de datos (paso 1.5).

3. Proceso de datos

1. Después de que el ensayo se ha ejecutado, abre el software de análisis de datos y la carga de la carpeta que contiene los datos. Haga clic en la pestaña de "elaboración", para ver un menú por pasos de procesamiento (a la izquierda) y los datos cinéticos primas, con cada sensor (AH) asignado un color diferente (verLa Figura 3).
2. Bajo "Selección de datos", haga clic en el botón "Selección del sensor". En el "Mapa Sample Plate", designar a los pozos para 1 o 2 sensores de control (G, H en el ensayo de la Figura 3) como pozos de referencia. En el menú Procesamiento, marque la casilla "Resta" y seleccione "Referencia Wells" para restar la señal de referencia (simple o promedio) de la señal de cualquier otro sensor.
3. Alinear todos los rastros que Y = 0 utilizando el paso "Alinear eje Y". Seleccione "Línea Base" como el paso de alineación (que es la última línea de base antes de la etapa de Asociación). Para el "Intervalo de tiempo", introduzca los últimos 10 seg de que la línea de base (es decir, 50 a 60 segundos para una línea de base de 60 segundos, como en la figura 3).
4. Marque la casilla "Inter-paso de corrección" para reducir al mínimo los cambios de señal entre los pasos de asociación y disociación. Seleccione alinear a línea de base o disociación.
5. Seleccionar la función de filtrado Savitzky-Golay en la mayoría de los casos y haga clic en "Proceso de datos!" para proceder. Inspeccione visualmentelos datos finales procesados ​​(panel inferior derecho). Con ensayos destinados para el análisis global de datos (como en la Figura 4), ​​si trazas de señal muestran un cambio significativo entre la Asociación y pasos de disociación, cambiar la selección de la disociación o de línea de base para la "Corrección Inter-paso" y volver a procesar los datos antes de proceder a los datos Análisis.

4. Análisis de Datos

Haga clic en la pestaña "Análisis" en el análisis de datos para comenzar. Nota: el ejemplo de los pasos a continuación son para el análisis global de múltiples curvas de unión / disociación (como en la Figura 3).

1. Por "paso a Analizar", elija asociación y disociación. Para el "Modelo", seleccione 1:01. Nota: Las demás opciones disponibles son limitados.
2. Para el "montaje", elija Global (Full). Para "Agrupar por" seleccione Color (como en el gráfico). Seleccione "R _max UNLINKED Por Sensor" para permitir la instalación independiente de R _max (respuesta de la señal máxima a saturar la unión del partner a la proteína inmovilizada). Nota: hacemos esto para la mayoría de los ensayos, como los sensores varían ligeramente en la cantidad de proteína inmovilizada (véase la Figura 3, cargando).
3. En la tabla que se muestra, asegúrese de que todos los rastros de los sensores para ser analizados tienen el mismo color, por lo que serán analizados como un conjunto global. Si es necesario, seleccione uno o más sensores traza omitir de ajuste mundial: en la columna "Incluir", haga clic en la posición del sensor deseado y seleccione "Excluir Wells".
4. Haga clic en "ajuste de curvas!" para iniciar el análisis de regresión no lineal. Examine los resultados apropiados, que incluyen (i) superposición de las curvas de regresión con los rastros de datos del sensor (como en la figura 4), ​​(ii) los gráficos de residuos de ajuste, y (iii) una tabla con valores de los parámetros determinados (constantes de velocidad, R _max, K _D) y la estadística (errores estándar de los parámetros, Chi-cuadrado, ^R2).
5. En la sección "Exportación de datos", guardar los resultados de ajuste haciendo clic en "Exportar tabla a. Csv Archivo". Para graphing o más análisis de datos / curvas ajustadas con otro software, haga clic en "Exportar resultados apropiados" para guardar los datos de cada sensor y curva ajustada en un archivo de texto.

De unión en tiempo real y la cinética de disociación BLI se muestra en la Figura 3. Este experimento se realizó con tampón de ensayo en asociación y disociación. Este experimento se inició con una etapa de línea de base 10 minutos ya que los sensores se han prehumedecido sólo brevemente. Siguiente, ε biotinilado se cargó en los sensores. No disociación detectable de ε se produjo a lo largo de todos los pasos restantes como se ve desde la curva de referencia (G), que no tenía pareja de unión agregó. Un segundo sensor de referencia (H) carecía de proteína inmovilizada y mostró baja unión no específica de la pareja de unión. Varias concentraciones de F 1 (-ε) se utilizaron en el paso de asociación para los sensores AF para poder adaptarse a los resultados a nivel mundial y obtener los mejores valores para k a, k d, y KD. Los resultados se procesaron como en el protocolo, dando los rastros de datos (azul) en la figura 4. En este caso, sensor de referencia de traza H se resta de la muestra TRases para corregir la unión no específica de la pareja y la señal del sistema de deriva vinculante. En la etapa de análisis de datos, todas las curvas eran globalmente ajuste con un modelo 1:1 (solo k una sola k d), el "Global (Full)" ajuste supone la disociación completa de la pareja de unión (señal volverá a cero al infinito tiempo) (Figura 4, rojo). Tenga en cuenta que, para las dos concentraciones más altas de F 1 (-ε), hay pequeñas pero significativas desviaciones de los datos de la, modelo global 01:01. Se utilizan bajos niveles de ligando inmovilizado (biotinilado subunidad "ε"), y el ajuste no se mejoró mediante la inclusión de un factor de transporte de masa en el modelo (no mostrado). Sin embargo, F 1 (- "ε") es un gran complejo (~ 350 kDa), y otros experimentos (no mostrados) sugieren que estas desviaciones se deben a la reducción de la accesibilidad de unión de una fracción de ligando inmovilizado, es decir, un F 1 unido a uno "ε" puede estéricamente obstaculizar el acceso a otro con biotina"Ε" obligado en el mismo tetrámero de estreptavidina.

La Figura 5 muestra un experimento diferente en el que la enzima se unió al sensor-ε inmovilizada en presencia de 1 mM de ATP / EDTA; este predispone la mayoría de los complejos de F 1 / "ε" para asumir la conformación no inhibidor, que se disocia fácilmente 8. Los sensores fueron luego se trasladó a la disociación pocillos que contenían tampón de ensayo con diferentes ligandos. Esto demuestra los efectos de diferentes ligandos en la conformación de ε. Por ejemplo, la exposición a MgADP / Pi desaceleró drásticamente disociación neta, lo que indica que ε se desplazó a la conformación, estado de inhibición herméticamente atado. Se observaron cinética de disociación complejos desde diferentes ligandos causaron diferentes turnos en la fracción de la F 1. Complejos ε con ε en los disociables () o inhibidoras conformaciones (nondissociable) activos. También es posible que los cambios conformacionales considerables de proteínas unidascontribuir directamente a los cambios en la señal de BLI pero, en nuestros estudios, esto parece ser insignificante en comparación con la señal para la unión / disociación del complejo F grande 1 (véase Shah et al 8, la Figura 5D;. transición a las curvas 3 y 6 muestran comportamiento muy similar, aunque sus condiciones favorecen conformaciones distintas de F cota 1). El software de análisis de datos no fue diseñado para este tipo de cinética de disociación complejos. Por lo tanto, hemos exportado los datos en archivos de texto para el análisis de regresión no lineal con otro software.

Figura 1. Principios de Interferometría Bio-capa. Animación resume la física subyacente para la detección de la interacción biomolecular por BLI. La luz que pasa a través de las sondas se refleja de nuevo a los espectrofotómetros (i) de la superficie interna del sensor y (ii) desde el exterior eninterfaz del sensor con la solución de muestra. Esto da lugar a un patrón de interferencia. La unión de moléculas a la superficie del sensor cambia el patrón de interferencia. Esto se puede trazar como un cambio de intensidad relativa nanómetros de longitud de onda vs. La supervisión de este cambio de nanómetros en el tiempo proporciona cinética de unión y disociación. Los gráficos se adaptaron con el permiso de ForteBio 12.

Figura 2. Disposición esquemática de las muestras en la placa de muestras de 96 pozos. Los sensores se pueden mover en paralelo de columna en columna y se pueden mover a la izquierda oa la derecha según se define en el protocolo de ensayo particular. Wells con color gris representan tampón de ensayo, mientras que rojo, azul y verde representan proteína inmovilizada, socio y liga de uniónNDS, respectivamente.

Figura 3. Captura de pantalla que muestra los datos en bruto de un ensayo de BLI. Líneas rojas verticales indican el movimiento de los sensores entre los pasos del ensayo del protocolo. Tipos de pasos se indican en la imagen. Ubicaciones de tampón y las muestras son como se muestra en la Figura 2. Como se ha indicado por los números a lo largo de la parte superior del gráfico, se trasladaron sensores recubiertas con estreptavidina entre las diferentes columnas de la placa de la muestra en el siguiente orden: 123454. La leyenda debajo de la gráfica indica el color de trazo los datos de cada sensor. En la etapa de carga, cada sensor excepto H se incubó con 50 nM biotina subunidad "ε". En la etapa de la Asociación, los sensores se incubaron con concentraciones nM de "ε" empobrecido F 1: 30 (A, H), 20 (B), 15 (C), 10 (D), 5 (E), 2.5 (F), 0 nM (G). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Captura de pantalla de los datos analizados de la prueba de BLI de la figura 3. Los datos se procesaron y equipado como se describe en el texto. A pocos pasos de asociación y disociación se muestran, dividido por una línea roja vertical. Las curvas de datos procesados ​​son de color azul, la regresión no lineal se ajusta de 1:1 análisis global se muestran en rojo. Resultados globales de ajuste: 8 k a = 2 x 10 5 m -1 s -1 (± 0,1%), k d = 4,8 x 10 -5 s -1 ("±" 0,1%), dando KD = 0,24 nM. Bondad de ajuste: R2 = 0,999054. El parámetro de unión máxima (Rmax) estaba en condiciones por separado para cada sensor, con valor medio = 0,813 nm ("±" 0,0803). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 5. Los resultados de un ensayo de BLI que muestra efectos alostéricos de ligandos sobre la conformación de ε. F 1 (-ε) fue obligado a ε sensor-inmovilizada en presencia de 1 mM de ATP / EDTA. El final de la fase de asociación y una porción de la fase de disociación se muestran. Durante la etapa de disociación, se incluyeron ligandos diferentes para F 1 páginas catalíticos (enumerados para cada traza) para observar sus efectos alostéricos en la disociación de la F 1

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.