La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.
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Artículo de método
La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La respuesta inmune del huésped a patógenos es un proceso biológico complejo. La mayoría de los estudios in vivo empleado clásicamente para caracterizar las interacciones huésped-patógeno se aprovechan de inyecciones intraperitoneales de seleccionar las bacterias o los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) en ratones. Si bien estas técnicas han rendido enormes de datos relacionados con patobiología enfermedad infecciosa, los modelos de inyección intraperitoneal no siempre son apropiadas para estudios de interacción huésped-patógeno en el pulmón. Utilizando un modelo de inflamación pulmonar aguda en ratones, es posible llevar a cabo un análisis de alta resolución de la respuesta inmune del huésped innata la utilización de lipopolisacárido (LPS). A continuación, describimos los métodos para administrar el uso de la administración intratraqueal LPS orofaríngea no quirúrgico, el seguimiento de parámetros clínicos asociados con la patogénesis de la enfermedad, y utilizar el líquido de lavado broncoalveolar para evaluar la respuesta inmune del huésped. Las técnicas que se describenson ampliamente aplicables para el estudio de la respuesta inmune innata de acogida a un rango diverso de PAMP y patógenos. Del mismo modo, con pequeñas modificaciones, estas técnicas pueden también ser aplicadas en los estudios que evalúan la inflamación de las vías respiratorias alérgica y en aplicaciones farmacológicas.
Introducción
Las infecciones pulmonares asociadas a especies de bacterias patógenas son una causa frecuente de morbilidad y mortalidad global. La determinación de los mecanismos que conducen a la respuesta inmune del huésped a estos patógenos, promoverá el desarrollo de estrategias de prevención novedosas y agentes terapéuticos que atenuar el impacto de estas infecciones. El objetivo general del protocolo descrito aquí es proporcionar al usuario un método flexible para evaluar la respuesta inmune innata huésped a la infección del patógeno utilizando un patrón molecular asociado patógeno (PAMP) como un sustituto de bacterias vivas. La mayoría de los estudios previos de evaluación ....
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Protocolo
Se realizaron todos los estudios bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso (IACUC) de Virginia Tech y de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Intratraqueal (it) La inoculación de LPS mediante Administración de orofaringe
- Asegúrese de que cada animal se identifica unívocamente usando un punzón oído, marca auricular, u otro método aprobado institucionalmente.
- Anotar el peso corporal inicial y la temperatura corporal de cada animal.
- Preparar la solución de trabajo de LPS. Cada ratón recibe una dosis de 50 l de 1 mg /....
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Resultados
Las paredes celulares de las bacterias gram-negativas se componen de LPS, que es altamente abundante en el medio ambiente. La inhalación de LPS en las poblaciones humanas sensibles exacerba la reactividad de las vías respiratorias y es capaz de desencadenar una response11 inmune robusta. LPS es también un PAMP común utilizado en modelos de ratón para provocar una respuesta inmune innata robusta. En el protocolo descrito aquí, los ratones recibieron una dosis de LPS es aislado a partir de E. coli (serotipo 0111:.......
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Discusión
Los pasos más importantes para evaluar con éxito la respuesta inmune del huésped en los pulmones del ratón es el siguiente: 1) elegir la cepa de ratón apropiado y sexo para el modelo que se está evaluando; 2) optimizar la entrega de PAMP a los pulmones; 3) recopilar y procesar correctamente la BALF; y 4) fijan correctamente y preparar los pulmones para las evaluaciones histopatológicas.
La elección de la cepa de ratón es un factor importante en la evaluación de la respuesta inmune del huéspe.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad Regional del VA-MD de la medicina veterinaria para proporcionar núcleo y soporte técnico para este proyecto. Este trabajo es apoyado por un premio de Desarrollo Profesional de los NIH (K01DK092355).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| C57Bl/6J | Culata de The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Escala compacta | Ohaus Scale Corporation | 71142845 | |
| Termómetro rectal para animales pequeños | Braintree Scientific | TH 5 | |
| Sonda rectal para roedores | Braintree Scientific | RET 3 | |
| Punzón de oreja | Braintree Scientific | EP-S 901 | |
| Lipopolisacárido de E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB | |
| 1x Solución salina tamponada con fosfato | Life Technologies | 10010-023 | |
| Isoflurano | Baxter | 40032609 | |
| Intratraqueel Soporte de administración e inflado pulmonar | ICAP Manufacturing | n/a | |
| Soporte de intubación para roedores | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| (romas/afiladas)Pinzas | Fisher Scientific | 13-806-2 | |
| (rectas) | Pinzas Fisher Scientific | 22-327-379 | |
| (45º, curvas) | Tijeras Fisher Scientific | 10-275 | |
| (romas/romas) | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pipeta (200 µ l Capacidad) | Gilson | F123601 | |
| Ethanol | Sigma 459844 | ||
| 1 ml Jeringa | BD Medical | 301025 | |
| 10 ml Jeringa | BD Medical | 301604 | |
| 27 G x 0,5 en aguja | BD Medical | 305109 | |
| Microcentrífuga refrigerada | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Cánulas traqueales de 1,2 mm con adaptador Luer | Aparato Harvard | 732836 | |
| Solución salina equilibrada de Hank | Life Technologies | 14025-076 | |
| 4-0 Sutura quirúrgica trenzada de seda | Ethicon | A183 | |
| Kits de conectores Luer a tubo | Aparato Harvard Kit | de | |
| Aparato Harvard | 721664 | ||
| Tygon formula E-3603 Tubo de laboratorio | Sigma | R-3603 | |
| Solución de formalina, tamponado neutro, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Ratón IL-1 y beta; OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 | |
| Ratón IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 | |
| Ratón TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 | |
| Hemocitómetro | Hausser Scientific | 3520 | |
| Cubreobjetos | Thermo Scientific | 22-021-801 | |
| Trypan | Blue Thermo Scientific | SV3008401 | |
| Clips de embudo de citología | Fisher Scientific | 10-357 | |
| embudos de citología | Fisher Scientific | 10-354 | |
| Tarjetas de filtro | Fisher Scientific | 22-030-410 | |
| Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Cubreobjetos | Fisher Scientific | 12-540A | |
| Cytospin Citocentrífuga | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Diff Kit de tinción rápida | Fisher Scientific | ||
| Medio de montaje Permount | Fisher Scientific | SP15-500 |
Referencias
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al.
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Reimpresiones y permisos
