Cromatográfico en capa fina (TLC) Separaciones y bioensayos de extractos vegetales para identificar compuestos antimicrobianos

Resumen

Se describen procedimientos para cromatografía en capa fina (TLC) separación de extractos de plantas y el contacto bioautografía para identificar metabolitos antibacterianos. Los métodos se aplican a la selección de compuestos fenólicos de trébol rojo que inhiben las bacterias productoras de amoniaco hiper (HAB) nativas para el rumen bovino.

Resumen

Una pantalla común para los compuestos antimicrobianos de plantas consiste en la separación de extractos de plantas por papel o cromatografía en capa fina (PC o TLC), la exposición de los cromatogramas a las suspensiones microbianas (por ejemplo hongos o bacterias en caldo o agar), dejando tiempo para que los microbios para crecer en un ambiente húmedo, y la visualización de zonas sin crecimiento microbiano. La eficacia de este método de detección, conocido como bioautografía, depende tanto de la calidad de la separación cromatográfica y el cuidado con las condiciones de cultivo microbianos. Este artículo describe los protocolos estándar para TLC y el contacto bioautografía con una novedosa aplicación a los amino ácidos bacterias que fermentan. El extracto se separa en (aluminio con respaldo) placas de TLC de sílice flexibles, y las bandas se visualizaron bajo luz ultravioleta (UV). Las zonas se cortaron y se incubaron boca abajo en agar inoculado con el microorganismo de ensayo. Bandas inhibidoras se visualizaron por tinción de la placa de agars con tetrazolio rojo. El método se aplica a la separación de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland) compuestos fenólicos y su programación para la actividad contra Clostridium sticklandii, una bacteria productora de amoníaco hiper (HAB) que es nativa al rumen bovino. Los métodos de TLC se aplican a muchos tipos de extractos de plantas y otras especies bacterianas (aeróbicas o anaeróbicas), así como hongos, pueden ser utilizados como organismos de prueba si las condiciones de cultivo se modifican para adaptarse a los requisitos de crecimiento de las especies.

Introducción

El ensayo para compuestos antimicrobianos en las plantas requiere la separación de los componentes de un extracto de la planta, la exposición de un microorganismo de ensayo a los componentes, y la determinación de si el crecimiento del microorganismo es inhibido por cualquiera de los compuestos. Separaciones por papel o la cromatografía en capa fina (PC o TLC) son convenientes porque muchos compuestos pueden ser separados en una superficie plana. La separación se basa en la polaridad, con algunos compuestos que se unen fuertemente al adsorbente (celulosa en el caso de la PC, y una variedad de adsorbentes en el caso de TLC) y la migración de menos que otros ^1. La Figura 1 proporciona un ejemplo de las posiciones relativas de compuestos fenólicos polares y no polares después de separación en una placa de TLC de sílice.

Figura 1. Diagrama que ilustra las distribuciones de compuestos de diferentes polaridades después de separación en una capa fina de sílice para cromatografía (TLC) placa. Compuestos fenólicos de trébol rojo (Trifolium pratense L.) se utilizan como un ejemplo. Los compuestos polares, tales como clovamide, tienen una fuerte afinidad por un adsorbente polar como sílice y permanecen cerca del origen (O), mientras que los compuestos polares menos, tales como las tres isoflavonas cerca de la frente del disolvente (SF), partición más fácilmente en los disolventes (que son menos polares que a menos que la sílice se incluyen agua, ácidos o bases) y migrar más arriba de la placa.

Después de la separación de un extracto en una placa de TLC, microorganismos de prueba pueden estar expuestos a todos los compuestos en la placa, acelerando así la identificación de los componentes activos de un extracto ^2. Si un cultivo fúngico o bacteriano se expone a la cromatograma, el crecimiento microbiano se producirá en todas partes excepto en áreas con crecimiento-inhibidorcompuestos y. Las zonas de inhibición a continuación, se pueden visualizar mediante la observación del contraste entre el crecimiento del micelio y las áreas de crecimiento libre de hongos si se han aplicado ³ o por pulverización con compuestos que cambian de color cuando se reduce o hidrolizado por las células vivas ^4. Aunque el uso de papel o de capa fina cromatogramas para los ensayos antimicrobianos se aplicó primero a los antibióticos y fungicidas ^{5 3,6,} extractos de plantas ahora son analizados con frecuencia para los compuestos antimicrobianos con este método, a menudo referido como bioautografía. Los protocolos descritos en el presente documento se aplican a bioautografía de los cromatogramas de capa fina. TLC se utiliza ampliamente debido a que es relativamente rápida y se puede realizar en diferentes adsorbentes (por ejemplo, sílice, almidón, alúmina), así como proporcionando buena resolución y sensibilidad ^1.

Los extractos de plantas se pueden preparar para TLC de muchas maneras. Los métodos comunes incluyen material vegetal de extracción en alcmezclas ohol-agua tales como etanol al 80% ^7,8, posiblemente con la adición de ácido o base ^9. Después de una extracción en tales disolventes, que contienen un poco de agua y son, posiblemente, ácido o básico, extractos deben concentrarse de manera que puedan ser aplicadas a placas de TLC en un volumen mínimo. La concentración de los extractos de alcohol-agua se puede lograr mediante la partición con disolventes orgánicos inmiscibles en agua ⁸ o con una mezcla de tales disolventes, tales como acetato de acetato de etilo-éter (1:1, v / v) ^10,11. Diferentes metabolitos vegetales se extraen en diferentes disolventes orgánicos, dependiendo de sus polaridades. Para garantizar que los ácidos o bases orgánicos vegetales se extraen en disolventes orgánicos en esta etapa, el pH de un extracto de alcohol y agua se puede subir o bajar con un ácido o base soluble en agua para convertir los analitos disociadas en sus formas no disociada, que luego se soluble en disolventes orgánicos neutros ^9. La fase orgánica puede entonces ser correovaporated bajo presión reducida o en atmósfera de nitrógeno y se ajustó hasta el volumen deseado para TLC. El pH del extracto es poco probable que sea letal para microorganismos de bioensayo debido a la compartimentación de los analitos en disolventes neutros, pequeño volumen final, y la evaporación del extracto sobre la placa de TLC antes de la separación.

Ambos hongos y bacterias se emplean como microorganismos de prueba en bioautografía de extractos de plantas ^2. Las esporas de algunos hongos, tales como Cladosporium cucumerinum, germinan en placas de TLC (aparte de las zonas con compuestos inhibidores) si se pulveriza sobre las placas en una solución nutriente y se incubaron en un ambiente húmedo durante varios días ^3. El micelio oscuro de la C. cucumerinum en zonas no inhibidor proporciona un fuerte contraste con las zonas francas de crecimiento del micelio. Aunque las bacterias se han aplicado a cromatografía en capa fina (TLC) placas de la misma manera ^4,12, las bacterias también se vierten sobre TLCsuperficies de las placas de agar se superpone a ^13,14. Levaduras, tales como Candida albicans, se puede aplicar en las capas de agar, así ^14. Alternativamente, las placas de TLC se pueden colocar boca abajo en agar inoculado con bacterias o levaduras ^{10,15 8,} un método conocido como el contacto bioautografía ^2.

Se describe un método para el contacto bioautografía para la detección de compuestos fenólicos antimicrobianos a partir de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland). El microorganismo de ensayo es Clostridium sticklandii, un hiper bacteria productora de amoníaco ruminal (HAB) y obligar anaerobio. Aunque las separaciones utilizadas no resuelven todos los componentes del extracto, facilitan la identificación de las zonas de actividad antimicrobiana, reduciendo de este modo el conjunto de posibles compuestos antimicrobianos. El protocolo utiliza procedimientos estándar para TLC ^1. El protocolo también describe algunas de las técnicas necesarias para obli cultivoanaerobios puerta de dicho ensayo, el uso de contactos bioautografía ¹⁵ y un método de visualización con una sal de tetrazolio, que tiñe las células vivas ^2,4.

Protocolo

1. Preparación del extracto de la planta

1. Ver Kagan y Flythe ¹⁰ para la extracción de compuestos fenólicos de cv Trifolium pratense. Kenland.
2. Para extraer otros compuestos en otras plantas, comprobar la literatura análisis fitoquímico para los métodos de extracción de plantas-o-metabolitos específicos (muchos se describen), o buscar protocolos tales como los de Khurram et al. ^7,8 que aíslan muchos compuestos con una amplia gama de polaridades.

2. Preparación de las placas de capa fina

1. Limpiar las placas de TLC mediante el desarrollo en uno o más disolventes polares y neutros, con el fin de mover los contaminantes adsorbidos lejos de la zona de desarrollo.
   1. En una campana de humos, preparar suficiente disolvente de limpieza (por ejemplo 15-100 ml de acetato de etilo-metanol 2:1, v / v) para cubrir la parte inferior de la cámara de desarrollo de TLC, así como el borde inferior de una placa de TLC cuando conjunto dentro de la cámara.
   2. Utilice comercialmentevidrio cialmente disponibles TLC desarrollando cámaras (diferentes tamaños disponibles, con tapas) o vasos de precipitados Pyrex de papel de aluminio cubierto o tarros de conserva.
   3. Utilice unas tijeras para cortar aluminio-o (flexibles) placas de gel de sílice con forro de plástico, que vienen en varios tamaños (20 cm x 20 cm y más pequeñas), para adaptarse a la cubeta de desarrollo disponibles. (Precaución: La sílice puede causar daño a los pulmones si se inhala Trabajar en una campana extractora, y manejar las placas de TLC con guantes para evitar los aceites de la piel sobre la sílice.).
   4. Inserte las placas dentro de la cámara, con las partes superiores se inclinan contra las paredes de la cámara. Las placas no deben tocarse. Cubra la cámara y dejar que el disolvente se mueven hasta la placa por acción capilar.
   5. Cuando disolvente haya alcanzado la parte superior de las placas, quite las placas de la cámara y disponer en una posición de pie dentro de la campana de extracción hasta que el disolvente se ha evaporado.
   6. Compruebe si las impurezas han emigrado cerca de la parte superior de la placa de TLC mediante la búsqueda de una banda amarilla bajo visibleluz, o una banda fluorescente bajo la luz ultravioleta (UV) (véase el "frente impureza" o si en la Figura 2B). Si la mayoría de la placa todavía tiene un tinte amarillento, repita el proceso de limpieza.
   7. Después de quitar las placas de TLC de la cámara, desechar el disolvente. Permitir que el disolvente residual se evapore por completo antes de utilizar la cámara para el Protocolo 2.
   8. Para eliminar la humedad residual que puede afectar a la migración de los compuestos sobre sílice ^16, apuntalar las placas en posición vertical en un horno de secado a 100 ° C (10-15 min para un 20 cm x 20 cm de placa, y 5 min de 7 cm x 10 cm placas ).
   9. Si un horno de secado 100 ° C no está disponible, placas de calor para un período de tiempo más largo a temperaturas más bajas (es decir, 40 min a 60 ° C).
   10. Después de que las placas están secas, deje que se enfríen a temperatura ambiente antes de la carga.

3. Preparación de Desarrollo de las Cámaras por la Separación Extract

1. Utilice unas tijeras para cortar un trozo de papel de filtro ligeramente por debajo de la altura de la cámara, y aproximadamente la mitad del perímetro de la cámara de ancho. Este documento actúa como una mecha para extraer los solventes hasta la pared de la cámara y saturar la cámara con los vapores de solventes, lo que mejora la reproducibilidad de las separaciones ^1.
2. En una campana de extracción, mezcla de disolventes (acetato de etilo-metanol 4:1, v / v, para este estudio). Vierta la mezcla de disolvente en la cámara y la tapa. Espere hasta que la mecha está mojada con solvente, lo que indica la saturación de la cámara, para poner las placas en la cámara.

4. La carga y el Desarrollo de las placas de TLC

1. Marque ligeramente el origen con el lápiz. Si la placa de adsorbente TLC es suave y fácil de dañar, hacer marcas en los bordes. Los compuestos deben estar por encima de la superficie del disolvente de desarrollo cuando las placas se insertan en la cámara de TLC.
2. Disolver los extractos en disolvente orgánico suficiente (en este caso, metanol) para tener una solución concentrada en lugar de una turbiasuspensión.
3. Cargue las muestras y estándares como bandas estrechas con una jeringa de microlitro o micropipetas capilares, dejando un borde de 1 cm en los lados de la placa. Permita que las bandas se sequen (avivando la placa o cargarlo en una campana de humos ayuda).
4. Si se necesita una mayor concentración de la muestra en un plato, "overspot" de cargar las muestras una vez más en las bandas secas.
5. Con unas pinzas o tenazas, placa (s) situada en el interior de la cámara de TLC saturado. Las placas no deben tocar la mecha, ya que puede proporcionar solvente a las placas en los puntos de contacto, alterando así el camino de la migración compuesto. Cubierta de la cámara y dejar que las placas se desarrollan.

5. Preparación de las placas para valoración biológica

1. Quite la placa (s) de depósito de TLC antes de que el frente del disolvente alcance la parte superior de la placa, y marcar la altura de la frente del disolvente con un lápiz. Deje placa seca en la campana de humos.
   1. Desarrollar las placas de TLC restantes en la misma cámara de TLC, que es GEnerally utilizable para un día entero si se mantiene cerrado. Remake mezcla de disolvente para cámara de TLC si la cantidad de disolvente en la cámara disminuye notablemente.
2. Después de placas están secas, visualizar bandas bajo luz visible o UV, y delimitar las bandas con un lápiz. Una cámara de visión con una lámpara UV portátil es conveniente, especialmente si la lámpara puede detectar compuestos, tanto en 254 nm (UV de onda corta) y 365 nm (longitud de onda larga UV).
   Nota: En este momento o después de la etapa siguiente, las placas pueden ser envueltos en papel plástico, cubierto con papel de aluminio, y se almacenan a -20 ° C. El tiempo máximo de almacenamiento depende de la estabilidad del compuesto. Debido a que la sílice no es neutral, algunos compuestos se degradan mientras que en la placa de TLC.
3. Fotografiar o dibujar placas.
   1. Utilice un sistema de documentación fotográfica gel si uno equipado con UV por encima y / o luz visible está disponible.
   2. Si hay un sistema de documentación fotográfica comercial está disponible, placas fotografía dentro de una caja forrada con papel oscuro o de tela, with un conjunto de cámara en un trípode y una luz UV portable sujeta a un anillo de soporte ^17. Al fotografiar las placas que no tienen ningún indicador fluorescente, utilice un filtro de luz azul sobre el lente de la cámara para mejorar la apariencia de banda ^17.
4. Para ayudar en la caracterización de las bandas, calcular los valores del factor de retención _(Rf) midiendo las distancias recorridas por los compuestos y frente del solvente y dividiendo el primero por el segundo (Figura 2A).

6. Bacteriana cultura y Ensayo

1. Preparar e inocular los medios de comunicación en condiciones anaeróbicas. El cultivo utilizado en este caso fue Clostridium SR cepa sticklandii, que se obtuvo de la colección de cultivos de James B. Russell, de la Universidad de Cornell, Ithaca, NY.
   1. Ver Flythe y Kagan ¹³ y la lista de materiales para una descripción de los medios de comunicación HAB.
2. Mantener el cultivo hasta la fase exponencial o estacionaria. Utilice techniqu anaeróbico estériles cuando se trabaja con microorganismos anaerobios.
3. Inocular la cultura (1% v / v) en agar fundido después que la temperatura del agar (0,75% W / V) ha disminuido a menos de 60 ° C. Mezclar suavemente y poner inmediatamente en una cámara anaeróbica (95% de CO ₂ 5% atmósfera de _H2 para medios HAB) para verter.
4. Vierta en x 100 mm placas Petri de plástico de 15 mm, y dejar que se solidifique.
5. Con unas tijeras, corte la placa de TLC en zonas que contienen la banda (s) de interés. Coloque bandas boca abajo sobre placas de agar, marcando bandas en el forro de la placa para realizar un seguimiento de la orientación del original en la placa de TLC. Colocar una tira de TLC no utilizada en una placa de agar como control.
6. Incubar las placas de agar, agar hacia abajo, en la cámara anaeróbica (24 hr, 39 ° C).

7. La visualización de las placas de agar bioensayan

1. Con unas pinzas, extraer bandas de placas de agar mientras están en la cámara anaeróbica.
2. Añadir 1% (w / v) de TErojo trazolium, preparada en agua, gota a gota sobre las superficies de las placas de agar. Deje que el color se desarrolle por lo menos durante 20 minutos, o hasta que la placa de control se vuelve completamente roja, antes de sacarlo de la cámara anaeróbica. Las bacterias anaerobias se comienzan a perder viabilidad después de la toma de la cámara anaeróbica, pero el color es estable durante más de 24 horas.
3. Fotografiar bajo luz visible.

Resultados

Representante separaciones TLC de sílice de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland) extractos, que contienen compuestos fenólicos, se muestran en la Figura 2. Separación de extracto de trébol rojo en acetato de etilo-hexano (9:1, v / v), más de 8,5 cm, dio lugar a cinco bandas, una forma incompleta resuelto desde el origen (Figura 2A). Sin embargo, la Figura 2B demuestra que alrededor del doble de las bandas fueron reveladas cuando una muestra diferente de...

Discusión

Este protocolo describe un método sencillo para la separación de un extracto en subconjuntos de compuestos y ensayando esos subconjuntos por contacto bioautografía. El método es bastante similar a uno utilizado por Chomnawang et al. ¹⁵ para la detección de metabolitos vegetales inhibitorios para las bacterias que causan la gonorrea. El tipo de bioautografía empleado para la detección de compuestos antimicrobianos de plantas depende de muchos factores, incluyendo el microorganismo de ensayo, la config...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sílice F254 Placas TLC, con respaldo de aluminio, 0,2 mm de espesor, 20 cm x 20 cm	EMD Chemicals	5554/7	Estas placas están recubiertas con sílice que contiene un indicador fluorescente a 254 nm. Los compuestos que se absorben en esa longitud de onda aparecen oscuros sobre un fondo verde fluorescente. Las fuentes alternativas incluyen Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Es posible que se necesiten adsorbentes distintos de la sílice. Las placas con respaldo de plástico pueden ser adecuadas, dependiendo de los solventes que se utilicen.
Tijeras afiladas y resistentes	cualquier empresa de suministros	de costura similar a Fiskars 175800-1002	para cortar placas TLC. También se puede usar un cortador de papel con una cuchilla afilada. No inhale polvo de sílice.
Horno de secado a 100 & grados; C (convección mecánica)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc., Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
Cámara TLC	Kimble Chase	416180-0000	Fuentes alternativas:  Aldrich. Los vasos de precipitados o tarros de conserva Pyrex se pueden utilizar para platos pequeños (por ejemplo, de 5 cm x 10 cm).  Cubra con papel de aluminio (las tapas de los frascos pueden contener material extraíble por vapores de solventes).
50 y micro; l Jeringa con punta de aguja plana	Hamilton	80965	Para cargar cantidades de patrón o muestra superiores a 5-10 µl.  Las fuentes alternativas son equivalentes.
Micropipetas	Drummond	2-000-001	Para cargar pequeñas cantidades de patrones o muestras. Fuentes alternativas:  VWR.  Además, las pipetas Pasteur se pueden estirar hasta un diámetro más delgado con un soplete de butano.
Papel de filtro (grado #1)	Whatman	1001 917	Sirve como mecha de cámara. Otros grados de papel de filtro están bien. Este tamaño se puede recortar para las cámaras que contienen placas de 20 cm x 20 cm.
Pinzas para vasos de precipitados	Fisher Scientific	15-186	Para colocar placas dentro y fuera de una cámara TLC grande. Fuentes alternativas: VWR
Pinzas de borde plano	Fisher Scientific	10-275	Para colocar placas dentro y fuera de una cámara pequeña. Fuentes alternativas: VWR
Pequeña lámpara UV portátil con bombillas de 4 W o 6 W para la iluminación con luz UV de onda corta y larga (254 y 365 nm, respectivamente)	Productos ultravioleta	95-0271-01	Fuentes alternativas: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Gabinete de visualización para uso con lámpara UV de mano	Productos ultravioleta	Chromato-Vue C-10E	Las bandas activas a los rayos UV se enmarcan más fácilmente en un círculo si las placas se pueden colocar aquí. Fuentes alternativas: Spectronics Corporation.
Sistema de fotodocumentación con lámpara UV de techo y lámpara visible	Kodak	Gel Logic 200	Fuentes alternativas: Productos ultravioleta (www.uvp.com).  Consulte el protocolo para la alternativa casera.
Cámara Anaeróbica, Tipo A, Vinilo	Coy	7150000	Esta cámara es apropiada para bacterias anaeróbicas, como Clostridium sticklandii, como se describe. Sin embargo, las condiciones de crecimiento deben adaptarse al organismo utilizado en el ensayo. Se debe tomar una cabina de bioseguridad y otras precauciones si se utilizan organismos patógenos. Fuentes alternativas: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, otros
Tetrazolio rojo	Sigma-Aldrich	T8877	Fuentes alternativas: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Ingredients for HAB media
Pyridoxamine · 2HCl	Sigma-Aldrich	P9380	Para esto y para todos los demás reactivos de esta tabla, las fuentes alternativas son equivalentes.
Riboflavina	Sigma-Aldrich	R4500
Tiamina HCl	Sigma-Aldrich	T3902
Nicotinamida	Sigma-Aldrich	N3376
D-Pantotenato de calcio	Sigma-Aldrich	C8731
Ácido lipoico	Sigma-Aldrich	T5625
ácido p-aminobenzoico	Sigma-Aldrich	A9878
Ácido fólico	Sigma-Aldrich	F8798
Biotina	Sigma-Aldrich	B4639
Cobalamina	Sigma-Aldrich	C3607
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Piridoxina	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Sulfato de hierro · 7H2O	Sigma-Aldrich	F8263
Sulfato de zinc · 7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
Cloruro de manganeso · 4H2O	Sigma-Aldrich	M8054
Ácido bórico	Sigma-Aldrich	B6768
Cloruro de cobalto · 6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Cloruro de cobre · 2H2O	Sigma-Aldrich
Cloruro de níquel · 6H2	O Sigma-Aldrich	203866
Molibdato de sodio · 2H2O	Sigma-Aldrich	331058
Tripticasa (digestión pancreática de la caseína)	Thermo Fisher	B11921
Fosfato de potasio monobásico anhidro	Thermo Fisher	P284
Carbonato de sodio · H2O	Thermo Fisher	S636
Agar	Thermo Fisher	50841063
Sulfato de magnesio · 6H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
Cloruro de calcio · 2H2O	Thermo Fisher	BP510
Cisteína HCl	Thermo Fisher	19464780
Potasio fosfato dibásico anhidro	Thermo Fisher	P290
Cloruro de sodio	Thermo Fisher	BP358