Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Resumen

Atacar a las células cerebrales residente por linaje reprogramación directa ofrece nuevas perspectivas para la reparación del cerebro. Aquí se describe un protocolo de cómo preparar cultivos enriquecidos por pericitos cerebrales residente del adulto corteza cerebral humana y convertirlas en neuronas inducida por la expresión mediada por retrovirus de los factores de transcripción Sox2 y Ascl1.

Resumen

Linaje reprogramación directa de las células no neuronales en neuronas inducidas (INS) puede proporcionar conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la neurogénesis y permitir nuevas estrategias para el modelado in vitro o reparar el cerebro enfermo. La identificación de los tipos de células no neuronales del cerebro residente susceptibles de conversión directa en iNs podrían permitir el lanzamiento de un enfoque de este tipo in situ, es decir, dentro del tejido cerebral dañado. Aquí se describe un protocolo desarrollado en el intento de identificar las células derivadas de cerebro humano adulto que cumplen esta premisa. Este protocolo implica: (1) el cultivo de células humanas a partir de la corteza cerebral obtenidos a partir de biopsias de cerebro humano adulto; (2) la expansión in vitro (que requiere aproximadamente 2-4 semanas) y caracterización de la cultura por inmunocitoquímica y citometría de flujo; (3) el enriquecimiento por células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando anticuerpos anti-receptor de PDGF-β y los anticuerpos anti-CD146;(4) la transducción mediada por retrovirus con la transcripción neurogénica factores de Sox2 y Ascl1; (5) y, finalmente, la caracterización de las neuronas resultantes derivadas de pericitos inducidas (PdiNs) por inmunocitoquímica (14 días a 8 semanas después de la transducción retroviral). En esta etapa, el INS se puede probar por sus propiedades eléctricas mediante la grabación de patch-clamp. Este protocolo proporciona un procedimiento altamente reproducible para la conversión linaje in vitro de los pericitos cerebrales residente en iNs humanos funcionales.

Introducción

A diferencia de la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que a su vez están dotados de una gran cantidad de potenciales de diferenciación, la reprogramación directa tiene como objetivo para la conversión recta de un tipo específico de célula a otro. Con respecto a su aplicación en el contexto de la modelización de enfermedades y terapias basadas en células potenciales, ambos enfoques de reprogramación tienen ventajas y desventajas específicas. Reprogramación en iPSCs (i) ofrece una fuente casi infinita de células; (Ii) permite la ingeniería genética; (Iii) dota de un potencial de diferenciación casi ilimitada. Sin embar....

Protocolo

1. Aislamiento y cultivo de células cerebro humano adulto

Los experimentos con el tejido humano se deben realizar de acuerdo con todas las regulaciones gubernamentales e institucionales pertinentes en relación con la utilización de material humano para fines de investigación. El presente protocolo fue desarrollado de acuerdo con la aprobación del comité de ética de la Facultad de Medicina de la LMU Munich y el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.

Este protocolo de culturas que se preparan de la corteza cerebral humano adulto se ha establecido el uso de muestras de pacientes de ambos sexos....

Resultados

El primer resultado de este protocolo después de establecer con éxito una cultura de un espécimen de ser humano adulto corteza cerebral consiste en la identificación de la composición celular de la cultura. La inmunocitoquímica de proteínas específicas de tipo celular revela un grado considerable de heterogeneidad entre los cultivos derivados de muestras de diferentes pacientes (Figura 1A). Tal como se cuantifica por citometría de flujo no es siempre una fracción sustancial de las células que expresan P.......

Discusión

El presente protocolo describe la expansión in vitro y el enriquecimiento de las células derivadas de pericitos después del aislamiento por parte del adulto corteza cerebral humana y la posterior conversión en iNs por la expresión mediada por retrovirus de la transcripción neurogénica factores Sox2 y Ascl1. Tal protocolo experimental proporciona un sistema in vitro para estudiar el linaje de conversión de las células cerebrales-residente en neuronas y glía, potencialmente, también, con el objetivo en m.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anti-CD140b-PE	BD Biosciences	558821	uso 1:100
anti-CD146-FITC	AbD Serotec		MCA2141FT uso 1:100
anti-CD13-FITC	AbD Serotec		MVA1270A488T uso 1:100
anti-CD34-APC	BD Biosciences	560940	uso 1:100
anti-PDGFRβ	Señalización celular	3169S	uso 1:200
anti-CD146	Abcam	Ab75769	uso 1:400
anti-NG2	Millipore	AB5320	uso 1:400
anti-SMA	Sigma-Aldrich	A2547	uso 1:400
anti-y beta; III-tubulina	Sigma-Aldrich	T8660	uso 1:400
anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M4403	uso 1:200
anti-GFAP	Sigma-Aldrich	G3893	uso 1:600
anti-GFP	Aves Labs	GFP 10-20	uso 1:1.000
anti-RFP	Chromotek	5F8	uso 1:500
anti-S100β	Sigma-Aldrich	S2532	uso 1:300
anti-NeuN	Millipore	MAB377	uso 1:200
anti-GABA	Sigma-Aldrich	A2052	uso 1:500
anti-Calretinina	Millipore	AB5054	uso 1:500
anti-vGluT1	SYnáptico SYstálticos	135511	uso 1:1.000
Rat IgG1 control de isotipo FITC	AbD Serotec	11-4301-81	uso 1:100
Rata IgG1 control de isotipo PE	AbD Serotec	12-4301-81	uso 1:100
Rat IgG1 control de isotipo APC	AbD Serotec	17-4301-81	uso 1:100
TrypLE	Invitrogen	12605-010
DMEM, alta glucosa, GlutaMAX	Invitrogen	61965
B27 suplemento sin suero	Invitrogen
suero fetal para terneros	Invitrogen	10106-169	realiza la inactivación del calor por incubación a 56 & grados; C durante 30 min
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140122
HBSS (Solución salina equilibrada de Hanks)	Invitrogen	24020-091
PBS de Dulbecco sin CaCl2 y MgCl2 (D-PBS, 1x)	Invitrogen	14190
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Poly-D-lisina bromuro de hidrobromuro (PDL)	Sigma-Aldrich	P0899
PFA (paraformaldehído)	Sigma-Aldrich	P1648
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A9418
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-fenilindol) dilactato	Sigma-Aldrich	042M4005
Aqua-Poly/ Mount	Polysciences	18606-20
Tubos de fondo redondo de polipropileno	BD Biosciences	352063
Tubos de poliestireno de fondo redondo con tapa de filtro de células	BD Biosciences	352235
Placas de 24 pocillos	Orange Scientific 5530305
matraces de cultivo de 75 cm2	Greiner Bio-One	658175
matraces de cultivo de 25 cm2	Greiner Bio-One	690175
Pipetas desechables 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Glass Pasteur pipetas (150 mm)	Fisherbrand	FB50251
Cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro	Menzel	CB00120RA1
Bisturíes quirúrgicos desechables	B. Braun	5518083
Placas de cultivo de tejidos	Greiner Bio-One	633180
Tubos cónicos 15 ml	BD Biosciences	352095
			flujo laminar
Centrífuga y rotor basculante con adaptadores para tubos de 15 ml y 50 ml	Hettich Lab Technology	1406
Clasificador de células por citometría de flujo: FACSAria l con software FACSDiva	BD Biosciences
cultivos celulares humificados	Eppendorf Galaxy 170R
Baño de agua a 37 ° C
FACSFara fluido de vaina de bajo	BD Biosciences	342003
Microscopio de epifluorescencia BX61	Olympus
Microscopio confocal LSM710	Zeiss

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