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Artículo de método

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

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DOI:

10.3791/51433

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12 de mayo de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physiological Genomics, Institute of Physiology, Ludwig Maximilians University Munich, 2Tumor Biology Lab, Neurosurgical Clinic, Ludwig-Maximilians University Munich, 3Institut für Biochemie, Emil-Fischer-Zentrum, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 4Institute of Physiological Chemistry and Focus Program Translational Neuroscience, Johannes Gutenberg University Mainz

En este artículo

Resumen

Atacar a las células cerebrales residente por linaje reprogramación directa ofrece nuevas perspectivas para la reparación del cerebro. Aquí se describe un protocolo de cómo preparar cultivos enriquecidos por pericitos cerebrales residente del adulto corteza cerebral humana y convertirlas en neuronas inducida por la expresión mediada por retrovirus de los factores de transcripción Sox2 y Ascl1.

Resumen

Linaje reprogramación directa de las células no neuronales en neuronas inducidas (INS) puede proporcionar conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la neurogénesis y permitir nuevas estrategias para el modelado in vitro o reparar el cerebro enfermo. La identificación de los tipos de células no neuronales del cerebro residente susceptibles de conversión directa en iNs podrían permitir el lanzamiento de un enfoque de este tipo in situ, es decir, dentro del tejido cerebral dañado. Aquí se describe un protocolo desarrollado en el intento de identificar las células derivadas de cerebro humano adulto que cumplen esta premisa. Este protocolo implica: (1) el cultivo de células humanas a partir de la corteza cerebral obtenidos a partir de biopsias de cerebro humano adulto; (2) la expansión in vitro (que requiere aproximadamente 2-4 semanas) y caracterización de la cultura por inmunocitoquímica y citometría de flujo; (3) el enriquecimiento por células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando anticuerpos anti-receptor de PDGF-β y los anticuerpos anti-CD146;(4) la transducción mediada por retrovirus con la transcripción neurogénica factores de Sox2 y Ascl1; (5) y, finalmente, la caracterización de las neuronas resultantes derivadas de pericitos inducidas (PdiNs) por inmunocitoquímica (14 días a 8 semanas después de la transducción retroviral). En esta etapa, el INS se puede probar por sus propiedades eléctricas mediante la grabación de patch-clamp. Este protocolo proporciona un procedimiento altamente reproducible para la conversión linaje in vitro de los pericitos cerebrales residente en iNs humanos funcionales.

Introducción

A diferencia de la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que a su vez están dotados de una gran cantidad de potenciales de diferenciación, la reprogramación directa tiene como objetivo para la conversión recta de un tipo específico de célula a otro. Con respecto a su aplicación en el contexto de la modelización de enfermedades y terapias basadas en células potenciales, ambos enfoques de reprogramación tienen ventajas y desventajas específicas. Reprogramación en iPSCs (i) ofrece una fuente casi infinita de células; (Ii) permite la ingeniería genética; (Iii) dota de un potencial de diferenciación casi ilimitada. Sin embargo, las principales desventajas de CMPI conllevan el riesgo de tumorigenicidad de las células no diferenciadas (la formación de teratomas in vivo) y la necesidad para el cultivo ex vivo y posterior trasplante si estas células se van a utilizar para las terapias basadas en células. Por el contrario, el linaje-reprogramación directa está limitado por el menor rendimiento de las células deseadasque se correlaciona directamente con el número de las células diana de la población de partida, sino que posee la ventaja de que las células de linaje-reprogramado parecen exhibir ningún riesgo tumorigénico en el trasplante 1,2; además, la reprogramación directa, incluso se puede lograr in situ, es decir, en el órgano donde se requerirían estas células, evitando así la necesidad de un trasplante.

Con esto en mente, nuestro laboratorio ha perseguido la posibilidad de las células cerebrales residente linaje reprogramación en iNs como un nuevo enfoque hacia las terapias basadas en las células de las enfermedades neurodegenerativas. Células cerebrales-residente que pueden ser considerados como potencialmente dianas celulares para el linaje-reprogramación comprenden diferentes tipos de macroglía (astrocitos, células NG2 y oligodendrocitos), microglia y células microvasculares asociadas (células endoteliales y los pericitos). Hemos estudiado ampliamente el potencial reprogramación in vitro de astroglia del cor cerebraltex de principios de ratones postnatales 3-5. En la búsqueda de fuentes de células de manera similar adecuadas para linaje reprogramación directa en el cerebro humano adulto, nos encontramos con una población de células que se pueden reprogramar con éxito en ins y características de exhibición de los pericitos. Aquí se describe un protocolo de cómo cosechar estas células de biopsias de cerebro humano adulto, para expandir y enriquecer estas células in vitro, y finalmente reprogramar con éxito una fracción sustancial de estas células in vitro en expandido (en el rango de 25-30%) en Ins. La reprogramación se puede lograr por mediada por retrovirus co-expresión simultánea de dos factores de transcripción, Sox2 y Ascl1. Se encontró que estas PdiNs para adquirir la capacidad de acción repetitiva potencial de fuego y para servir como dianas sinápticas de otras neuronas que indican su capacidad de integrarse en las redes neuronales. Nuestro protocolo proporciona un mecanismo sencillo para que el aislamiento y el linaje de conversión de pericitos cerebro humano adulto en Complementos.

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Protocolo

1. Aislamiento y cultivo de células cerebro humano adulto

Los experimentos con el tejido humano se deben realizar de acuerdo con todas las regulaciones gubernamentales e institucionales pertinentes en relación con la utilización de material humano para fines de investigación. El presente protocolo fue desarrollado de acuerdo con la aprobación del comité de ética de la Facultad de Medicina de la LMU Munich y el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.

Este protocolo de culturas que se preparan de la corteza cerebral humano adulto se ha establecido el uso de muestras de pacientes de ambos sexos que sufren de epilepsia del lóbulo temporal u otras lesiones no traumáticas, no malignas profundas. El tejido obtenido de la sala quirúrgica que comprende exclusivamente el canal de acceso a la lesión del cerebro y por lo tanto se considera saludable. El rango de edad de los pacientes fue de 19 a 70 años.

  1. Preparar medio de crecimiento mediante la adición de suero de ternera fetal inactivado por calor(FCS) a DMEM de alta glucosa con GlutaMAX para obtener una concentración final de 20% de FCS. Añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina a un total de 500 ml de medio de crecimiento. Realice este y todos los pasos posteriores que requieren condiciones de cultivo estériles en una campana de flujo laminar adecuado.
  2. Mantener la biopsia de cerebro humano adulto obtenida de la habitación quirúrgica en solución salina equilibrada de Hanks con CaCl2 y MgCl2 (HBSS) medio que incluye HEPES (10 mM de concentración final) en hielo hasta el procesamiento. Inicie el procesamiento tan pronto como sea posible.
  3. Para iniciar la disociación en células individuales, transferir el tejido en una placa de Petri de 65 mm y picar en trozos pequeños usando dos escalpelos estériles de uso único. Para la digestión enzimática utilizar 3-6 ml TrypLE en un tubo cónico de 15 ml y se incuba durante 15-30 min a 37 ° C en un baño de agua.
  4. Añadir 1 volumen de medio de crecimiento precalentado para facilitar la disociación y se tritura suavemente la solución que contiene piezas de tejido arriba y hacia abajo por primera utilizandouna pipeta desechable de 5 ml, seguido por el uso de una pipeta Pasteur de vidrio hasta la homogeneización de la suspensión celular. Normalmente, algunos trozos de tejido residual, en su mayoría consisten en la sustancia blanca, permanecerán en la suspensión.
  5. Centrifugar a 157 xg durante 5 min y resuspender el precipitado en la cantidad apropiada de medio de crecimiento (10 ml por matraz de cultivo T75 no recubierto). Utilice un frasco de cultivo T75 para una biopsia de 5-10 mm de diámetro de tamaño y extrapolar a partir de esto en el caso de los especímenes más grandes.
  6. Colocar las células en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 y 5% de O 2.
  7. Reemplazar la mitad del medio cada 3-4 días hasta que las células han alcanzado la confluencia. Esto suele tardar hasta dos semanas (denominados pasaje 0 [P0]).

2. Expansión in vitro y caracterización de células adultas del cerebro humano

  1. En la expansión in vitro:
    1. Aspirar el medio de cultivo y se lava con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se mantuvo en la sala de temperatura, antes de añadir 3 ml TrypLE.
    2. Se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos hasta que la mayoría de las células separadas. Golpee suavemente los frascos para facilitar la eliminación de las células; después de la adición de 3 volúmenes de medio de crecimiento, transferir las células a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 157 xg durante 5 min y resuspender las células en la cantidad apropiada de medio de crecimiento.
    3. Pasaje de las células en una proporción de 1:3 para un rendimiento óptimo en frascos nuevos de cultivo de células T75.
      Nota: Hemos pases estas células hasta P5, sin signos de reducción de la eficiencia de reprogramación. Mientras que en P0 el cultivo contiene una fracción considerable de células endoteliales (como se evaluó por la expresión de CD34), en pasajes posteriores su número se convierte en insignificante.
  2. Caracterización de las culturas del cerebro humano adulto:
    1. La inmunocitoquímica:
      1. Para la caracterización de las células, ~ 60.000 células de semillas en D-lisina recubierto con poli-cubierta de cristal se desliza en 500 l fresca mediu crecimientom en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 y 5% de O 2.
      2. Para el análisis inmunocitoquímico de las células cerebrales humanas cultivadas eliminar el medio y lavar 3 veces con 1 ml de PBS.
      3. Fijar las células mediante la adición de 500 l de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente.
      4. Transferencia de la cubierta de vidrio se desliza en una cámara humidificada tinción apropiado y bloquear con 80 l de PBS que contiene 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora a temperatura ambiente.
      5. Añadir anticuerpos primarios diluidos en la misma solución (para factores de dilución véase la tabla de reactivos y equipos específicos) y se incuba durante la noche a 4 ° C o 1 hora a temperatura ambiente.
        Nota: Una fracción sustancial pero variando de las células en esta fase de cultivo son inmunorreactivas para β del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), grupo de diferenciación 146 (CD146), Proteo condroitina sulfato de NG2glicanos y actina de músculo liso (SMA), es decir, marcadores característicos de pericitos microvasos asociada. Sólo una minoría (<1%) expresan la proteína glial fibrilar ácida marcadores astrogliales (GFAP) y S100β. Además, en esta etapa el cultivo debe ser desprovisto de cualquier células que expresan el marcador neuronal βIII-tubulina. Utilice múltiples combinaciones de anticuerpos primarios para la co-etiquetado de los diferentes marcadores. La confirmación adicional de la expresión de marcadores gliales, neuronales, endoteliales y pericitos puede obtenerse por transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (no descrito en este protocolo).
      6. Después de la incubación con los anticuerpos primarios se lavan tres veces con 1 ml de PBS y añadir los anticuerpos secundarios correspondientes (en las diluciones apropiadas) a la solución de tinción y se incuban 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Se lavan las células 3 veces con PBS. Si es necesario, antes de montar incluir tinción con DAPI durante 5 min a la habitacióntemperatura.
      7. Utilice antifading medio de montaje y analizar los cubreobjetos utilizando un microscopio de epifluorescencia o un microscopio confocal.
    2. La citometría de flujo:
      1. Para el análisis de expresión de marcadores de superficie utilizando citometría de flujo, crecer las células hasta la confluencia en T25 sin recubrir o frascos de cultivo celular T75.
      2. Separar las células mediante el uso de TrypLE como se ha descrito antes y volver a suspender en solución de tinción que consiste en PBS + 0,5% de BSA. Por reacción de tinción, resuspender 100.000-200.000 células en 100 l de solución de tinción. Preparar reacciones de tinción individuales por anticuerpos utilizados (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, anticuerpos de control de isotipo respectivos).
      3. Añadir anticuerpos conjugados con fluorocromo a cada solución de tinción (véase la tabla para diluciones de reactivos y equipos específicos) directamente en la suspensión celular y se incuba a 4 ° C durante 30 minutos en la oscuridad.
      4. Se lavan las células tres veces con 500 l de PBS y centrifugar entre cadaetapa de lavado a 157 xg durante 5 min.
      5. Resuspender el sedimento celular en 0,5-1 ml de solución de tinción y las células de transferencia a través de un filtro de células (70 micras) a tubos de FACS. Evita que la muestra de la exposición a la luz.
      6. Muestras Vortex antes de colocarlos en el instrumento FACS.
      7. Para el análisis de las células vivas y excluir a los desechos celulares y los agregados, portón para FSC-A y SSC-A. Dosillos celulares se gated específicamente por FSC-A y FSC-W. Para determinar las condiciones de activación periódica adecuadas para los marcadores de superficie celular que figuran las puertas con control de isotipo conjugado con el fluorocromo respectiva. A continuación, determinar la proporción de células productoras de anticuerpos de ruedas.

3. Enriquecimiento de células derivadas de pericitos por fluorescencia de células activadas por la clasificación

  1. Se purifica la población de células de pericitos (se resuspendieron en medio de crecimiento) antes de la transducción a través de clasificación por FACS utilizando una boquilla de 70 micras. Utilice CD34-APC en combinación con CD140b-PE y CD146-FITC para seleccionar a los pericitos. Ordenar por, células CD140b-y CD146 positivas CD34 negativas.
  2. Recoger las células clasificadas en medio de crecimiento y placa sobre D-lisina recubierto con poli-cubierta de cristal se desliza en placas de cultivo tisular de 24 pocillos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 y el 5% de O 2.
  3. 48 h después de su clasificación sustituir el medio con medio de crecimiento fresco y llevar a cabo la transducción tal como se describe en el Protocolo 4.

4. Transducción retroviral de células derivadas de pericitos y Reprogramación en neuronas inducidas

Nota: Consulte las normas de bioseguridad locales al manipular partículas retrovirales. En Alemania, el uso de los retrovirus utilizados aquí requiere de bioseguridad de nivel 2. Para la producción de partículas retrovirales se refiere el protocolo 6. Para construcciones retrovirales utilizados para la reprogramación, consulte Karow et al. (2012). Los retrovirus fueron pseudotyped con VSV-G (virus de la estomatitis vesicular-glicoproteína) 5. Para la producción consulte Gavrilescu et al 6.

  1. 24 horas antes de la semilla de la transducción retroviral ~ 60.000 células en D-lisina recubierto con poli-cubierta de cristal se desliza en 500 l medio de cultivo fresco en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 y el 5% de O2 .
  2. Al día siguiente, reemplazar el medio de cultivo con 500 l medio de cultivo fresco, precalentado y añadir 1 l de los sobrenadantes concentrados respectivos que contienen partículas retrovirales (pCAG-IRES dsRed-para el control, sobre todo durante el establecimiento del protocolo en el laboratorio), pCAG-Ascl1 -dsRed IRES, pCAG-sox2-IRES-GFP.
  3. Un día después, extraiga el soporte incluyendo las partículas virales de las células y se añade 1 ml fresco, precalentado medio B27-diferenciación, compuesta de 49 ml de DMEM rico en glucosa con GlutaMAX y 1 suplemento libre de suero B27 ml. Mantener las células en cultivo a 37 ° C en 5% De CO 2 y el 5% de O 2 durante 4-8 semanas sin cambiar el medio como cambios de medio repetitivas se vuelven dañinos como iNs maduran.

5. Caracterización de neuronas inducida por inmunocitoquímica

  1. Para determinar la identidad celular de las células transducidas, en particular, para demostrar la adquisición de un fenotipo neuronal, realizar inmunocitoquímica contra antígenos neuronales tales como bIII-tubulina, MAP2, y NeuN (para los anticuerpos y las diluciones respectivas, ver tabla de reactivos específicos y equipo; seguir el mismo procedimiento como se indica en 2.2.1).
  2. Para mejorar la maduración de PdiNs, co-cultivo de estas células con las neuronas derivadas de ratón E14 cortezas cerebrales. Para este fin, diseccionar la corteza cerebral y disociar el tejido mecánicamente con una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego. Añadir 10.000-50.000 neuronas murinas a cultivos de células derivadas de pericitos 2-3 semanas después de la transducción con re-Sox2 y Ascl1-codificacióntroviruses y continuar el cultivo. Las células transducidas se pueden distinguir de las neuronas murinas por su reportero (GFP y dsRed) la expresión, ya sea por epifluorescencia vivo o después de inmunocitoquímica para GFP y dsRed.
  3. Para evaluar la formación de sinapsis en PdiNs por neuronas murinas, realizar inmunocitoquímica contra receptores de neurotransmisores vesiculares tales como transportador vesicular de glutamato 1 (VGLUT1).
  4. Sonda células transducidas para sus propiedades eléctricas (es decir, la capacidad de generar potenciales de acción) y el establecimiento de las sinapsis funcionales por electrofisiología de patch-clamp. Para más detalles sobre el procedimiento de ver Heinrich et al. (2011).

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Resultados

El primer resultado de este protocolo después de establecer con éxito una cultura de un espécimen de ser humano adulto corteza cerebral consiste en la identificación de la composición celular de la cultura. La inmunocitoquímica de proteínas específicas de tipo celular revela un grado considerable de heterogeneidad entre los cultivos derivados de muestras de diferentes pacientes (Figura 1A). Tal como se cuantifica por citometría de flujo no es siempre una fracción sustancial de las células que expresan P...

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Discusión

El presente protocolo describe la expansión in vitro y el enriquecimiento de las células derivadas de pericitos después del aislamiento por parte del adulto corteza cerebral humana y la posterior conversión en iNs por la expresión mediada por retrovirus de la transcripción neurogénica factores Sox2 y Ascl1. Tal protocolo experimental proporciona un sistema in vitro para estudiar el linaje de conversión de las células cerebrales-residente en neuronas y glía, potencialmente, también, con el objetivo en m...

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Divulgaciones

Los autores tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Estamos muy agradecidos a la Dra. Magdalena Götz por su aportación durante el desarrollo de este protocolo. Agradecemos al Dr. Marius Wernig (Universidad de Stanford) por su generoso que nos proporciona la secuencia de codificación sox2. También estamos muy agradecidos a la Dra. Alexandra Lepier para la producción de virus. Este trabajo fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) y el BMBF (01GN1009A) a BB, y el Ministerio de Ciencias del Estado de Baviera, Investigación y las Artes a MK y BBCS recibieron financiación de la SYSTHER-binacional INREMOS Instituto Virtual (Ministerios Federal alemán y esloveno de Educación e Investigación) y la DFG (SFB 824).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
anti-CD140b-PEBD Biosciences558821uso 1:100
anti-CD146-FITCAbD SerotecMCA2141FT uso 1:100
anti-CD13-FITCAbD SerotecMVA1270A488T uso 1:100
anti-CD34-APCBD Biosciences560940uso 1:100
anti-PDGFRβSeñalización celular3169Suso 1:200
anti-CD146AbcamAb75769uso 1:400
anti-NG2MilliporeAB5320uso 1:400
anti-SMASigma-AldrichA2547uso 1:400
anti-y beta; III-tubulinaSigma-AldrichT8660uso 1:400
anti-MAP2Sigma-AldrichM4403uso 1:200
anti-GFAPSigma-AldrichG3893uso 1:600
anti-GFPAves LabsGFP 10-20uso 1:1.000
anti-RFPChromotek5F8uso 1:500
anti-S100βSigma-AldrichS2532uso 1:300
anti-NeuNMilliporeMAB377uso 1:200
anti-GABASigma-AldrichA2052uso 1:500
anti-CalretininaMilliporeAB5054uso 1:500
anti-vGluT1SYnáptico SYstálticos135511uso 1:1.000
Rat IgG1 control de isotipo FITCAbD Serotec11-4301-81uso 1:100
Rata IgG1 control de isotipo PEAbD Serotec12-4301-81uso 1:100
Rat IgG1 control de isotipo APCAbD Serotec17-4301-81uso 1:100
TrypLEInvitrogen12605-010
DMEM, alta glucosa, GlutaMAXInvitrogen61965
B27 suplemento sin sueroInvitrogen
suero fetal para ternerosInvitrogen10106-169realiza la inactivación del calor por incubación a 56 & grados; C durante 30 min
Penicilina-estreptomicinaInvitrogen15140122
HBSS (Solución salina equilibrada de Hanks)Invitrogen24020-091
PBS de Dulbecco sin CaCl2 y MgCl2 (D-PBS, 1x)Invitrogen14190
HEPESSigma-AldrichH3375
Poly-D-lisina bromuro de hidrobromuro (PDL)Sigma-AldrichP0899
PFA (paraformaldehído)Sigma-AldrichP1648
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA9418
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-fenilindol) dilactatoSigma-Aldrich042M4005
Aqua-Poly/ MountPolysciences18606-20
Tubos de fondo redondo de polipropileno BD Biosciences352063
Tubos de poliestireno de fondo redondo con tapa de filtro de células BD Biosciences352235
Placas de 24 pocillosOrange Scientific 5530305
matraces de cultivo de 75 cm2Greiner Bio-One658175
matraces de cultivo de 25 cm2Greiner Bio-One690175
Pipetas desechables 10 mlSarstedt86.1254.001
Glass Pasteur pipetas (150 mm)FisherbrandFB50251
Cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetroMenzelCB00120RA1
Bisturíes quirúrgicos desechables B. Braun5518083
Placas de cultivo de tejidos Greiner Bio-One633180
Tubos cónicos 15 mlBD Biosciences352095
flujo laminar
Centrífuga y rotor basculante con adaptadores para tubos de 15 ml y 50 mlHettich Lab Technology1406
Clasificador de células por citometría de flujo: FACSAria l con software FACSDiva BD Biosciences
cultivos celulares humificadosEppendorf Galaxy 170R
Baño de agua a 37 ° C
FACSFara fluido de vaina de bajo BD Biosciences342003
Microscopio de epifluorescencia BX61Olympus
Microscopio confocal LSM710Zeiss
17504044Campana de Incubadora de

Referencias

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