High Throughput Screening Expresión cuantitativa y Purificación Aplicada a Recombinante Disulfide ricos en proteínas del veneno Producido en E. coli

Summary

Un protocolo para el cuantitativa, de alta expresión rendimiento de la detección y purificación analítico de proteínas de fusión a partir de cultivos a pequeña escala de Escherichia coli se describe y se aplica a la expresión de dianas proteicas veneno de animales disulfuro-rica.

Abstract

Escherichia coli (E. coli) es el sistema de expresión más ampliamente utilizado para la producción de proteínas recombinantes para estudios estructurales y funcionales. Sin embargo, la purificación de proteínas a veces es difícil, ya que muchas proteínas se expresan en una forma insoluble. Cuando se trabaja con objetivos difíciles o múltiples por lo tanto se recomienda el uso de alto rendimiento (HTP) de detección de expresión de proteínas en una escala pequeña (1-4 ml de cultivos) para identificar rápidamente las condiciones para la expresión soluble. Para hacer frente a los diversos programas de genómica estructural de laboratorio, una cuantitativa (en un rango de 0,1 a 100 mg / L de la cultura de la proteína recombinante) y protocolo de detección de expresión de proteínas HTP fue implementado y validado en los miles de proteínas. Los protocolos fueron automatizadas con el uso de un robot de manejo de líquidos, pero también se pueden realizar de forma manual sin equipo especializado.

Proteínas del veneno disulfuro ricos están ganandoCada vez se reconoce por su potencial como clientes potenciales terapéuticos de la droga. Ellos pueden ser altamente potente y selectivo, pero sus complejas redes de enlace disulfuro que sean difíciles de producir. Como miembro del proyecto FP7 Venomics Europea ( www.venomics.eu ), nuestro reto es desarrollar estrategias de producción con éxito con el objetivo de producir miles de proteínas del veneno novedosas para la caracterización funcional. Con la ayuda de las propiedades redox del enlace disulfuro isomerasa DsbC, adaptamos nuestra línea de producción HTP para la expresión de oxidados, los péptidos del veneno funcionales en el E. citoplasma coli. Los protocolos también son aplicables a la producción de diversas proteínas disulfuro-rica. Aquí demostramos nuestra línea aplicada a la producción de proteínas del veneno animal. Con los protocolos descritos en la presente memoria es probable que las proteínas disulfuro-rica solubles se obtienen en tan poco como una semana. Incluso desde una pequeña escala, existe el potencial de utilizar ªe purificado proteínas para validar el estado de oxidación por espectrometría de masas, para la caracterización de los estudios piloto, o de micro-ensayos sensibles.

Introduction

Motivado por el avance de la genómica y la acelerada tasa de descubrimiento de nuevas proteínas, las tuberías de alto rendimiento han sido desarrollados para paralelizar los enfoques tradicionales para la detección e identificación de estrategias óptimas de producción de proteínas. Variables de potencial para ser optimizados incluyen, pero no se limitan a, diferentes cepas de expresión de ^1,2, temperatura de ^{3,4, 2,3} medios de comunicación, objetivo variantes de ^5, parejas de fusión ^6-13, co-expresión con chaperonas ^14,15, citoplásmica o expresión de ^16-18, y de amortiguamiento de purificación componentes periplásmicos ^3. Mediante la implementación de enfoques de rendimiento altos, muchas variables o muchos objetivos pueden ser probados en paralelo con un alto nivel de eficiencia, al tiempo que limita la variación de lote a lote. En nuestra experiencia, la estrategia también da una buena reproducibilidad en ampliación con el mismo cultivo (temperatura, medios de comunicación, la aireación, etc) y las condiciones de purificación (misma resiN, tampones, etc). Varias plataformas de alto rendimiento se han utilizado en la década pasada para identificar las condiciones para la expresión de proteína soluble, a saber, a través de diferentes parámetros tales como compañeros de fusión, las cepas de expresión o temperatura de ^19-23.

Hemos utilizado recientemente nuestro enfoque de selección de alto rendimiento para la expresión de proteínas disulfuro ricos solubles ^11. Las proteínas seleccionadas no eran sólo de fuentes venenosas, pero también incluían inhibidores de la enzima disulfuro ricos de una amplia gama de especies, incluyendo plantas, cerdos, vacas y seres humanos. El experimento comparó los efectos de 12 parejas de fusión diferentes y tres cepas de expresión diferentes en la solubilidad y el plegamiento de 28 proteínas disulfuro-reticulada. Hemos demostrado que el uso de DsbC como pareja de fusión para la producción en la cepa BL21 (DE3) pLysS enormemente outproduced (en tanto el rendimiento y el número de proteínas solubles obtenidos) cualquier otra combinación de cepa y la fusión prueba ^11. Laresultados de este experimento formaron la base para la adaptación de nuestra tubería original, en general de alto rendimiento (que se ha utilizado para el cribado de expresión de una amplia gama de proteínas) ^22,24 en uno más adecuado para la expresión de los objetivos de disulfuro-rica. Proteínas disulfuro ricos procedentes de venenos de animales son de particular interés. Venenos son una mezcla compleja de péptidos y proteínas bioactivos, con valor potencial farmacológicamente y terapéuticamente. Sin embargo, la expresión de proteínas que contienen enlaces disulfuro-no es trivial. Estas proteínas contienen generalmente de uno a siete enlaces disulfuro, y deben ser oxidados con los patrones de disulfuro de unión correctas con el fin de ser activo. Actualmente, la plataforma se está utilizando para la detección de la expresión de un gran número de proteínas de veneno de animales disulfuro-rica como parte del Proyecto VENOMICS Europea 7PM (www.venomics.eu) y la evaluación comparativa de nuevos protocolos para la expresión de alto rendimiento de miles de objetivos . Aquí, un método automatizadose proporciona para la detección de la expresión a pequeña escala de alto rendimiento y purificación (véase la figura 1) aplicada al disulfuro de proteínas ricas en veneno de animales. La estrategia para disulfuro péptidos y proteínas ricas utiliza una etiqueta de His para la purificación y la pareja de fusión redox-activo, DsbC, creando escindibles fusiones SU-DsbC para las proteínas diana (véase la Figura 2).

Aunque el foco de los protocolos en el presente documento es la automatización usando un robot de manejo de HTP y electroforesis líquido, estos métodos también son adecuados para un enfoque manual de alto rendimiento, lo que significa que incluso laboratorios con una configuración básica pueden tomar ventaja de los protocolos sin ningún requisito previo para un equipo costoso . Protocolos manuales para la transformación de la purificación y análisis (no específica a las proteínas disulfuro ricos) han sido publicados en otra parte ²⁴ y no se repetirán aquí. El rendimiento del procedimiento manual (del clon de expresión, producido por recombinaciónclonación nacional ^25, para análisis de los niveles de proteínas solubles) es 96 (usando la detección de SDS-PAGE) o 384 (4 x 96; utilizando dot blot y SDS-PAGE ²⁶⁾ los cultivos por semana (véase la Figura 1). Esto se puede aumentar si se realiza de una manera semi-automatizado (usando un robot de manejo de líquidos y de transferencia de puntos o electroforesis HTP ^26, tal como con un sistema de pinza de GXII LabChip ²² para el análisis de resultados) a un máximo de 1152 (12 x 96) culturas en paralelo más de una semana, tal como se describe en este documento. El cultivo se realiza en pozo profundo 24 Formato (DW24) de manera que las incubadoras temblorosas regulares se pueden usar en contraste con las culturas que crecen en el pozo profundo formato 96 (DW96), que requieren el uso de cortas incubadoras temblorosas alta velocidad orbital para una aireación suficiente (sacudidas a 800 rpm). El uso de los medios de auto-inducción ²⁷ también simplifica la expresión, la eliminación de la etapa de inducción manual. Incluso cuando los laboratorios ya utilizan la expresión y puri predefinidocondiciones ficación, estos pueden ser transferidos directamente en este sistema HTP simplemente para mejorar la eficiencia. Un esquema detallado de la tubería de selección de alto rendimiento para las proteínas disulfuro ricos se proporciona en la Figura 3. Los parámetros de la tubería fueron seleccionados sobre la base de extensos experimentos de cribado ^{11, 22,} lo que nos permitió elegir las condiciones más útiles para la producción de proteínas.

Caracterización se puede realizar en las proteínas etiquetadas purificados directamente de expresiones de pequeña escala en los estudios piloto en los que decenas de microgramos de muestra es suficiente, o para ensayos funcionales sensibles y ensayos de unión (por ejemplo, sistemas de bajo volumen de patch clamp HTP ^28). Lo mismo incluso se pueden realizar en los objetivos no etiquetadas después de la escisión, siempre la etiqueta y la proteasa se eliminan (por ejemplo, mediante HPLC en fase inversa). El control de calidad también se puede realizar por espectrometría de masas (para confirmar el tamaño esperado y la oxidación Stcomieron) o métodos cromatográficos (para confirmar la pureza o la heterogeneidad) ^29. A veces señal de corte es innecesario o incluso indeseable (en particular para las proteínas poco solubles ^30,31), lo que en este clivaje protocolo es opcional. Independientemente, en todas las construcciones hay un sitio de escisión de proteasa TEV (ENLYFQ / [G] ³²⁾ que precede directamente el gen diana para producir proteína nativa después de la escisión (véase la Figura 2 y Discusión). Si se desea la escisión de la etiqueta de la fusión, la escisión se puede probar (en la fracción de elución o 'de la columna') en la pequeña escala para analizar la eficiencia, optimizar las condiciones en caso necesario y obtener estimaciones fiables de los rendimientos de los experimentos posteriores de escalado.

Hay dos opciones para el volumen de los granos utilizados durante la purificación por afinidad, dependiendo de los objetivos y expectativas del experimento. Para poder captar la mayor cantidad de proteínas de lo posible (para purificar para ensayos piloto o MS o para EXTRAPOLcomió para los rendimientos de escala-hasta) un volumen final de 200 l de resina se debe utilizar, que permite la detección de la proteína soluble en el intervalo de 1-100 mg / l de cultivo antes de la saturación del sistema (véase el protocolo (A) en la Sección 8.1) . Sin embargo, si el objetivo del experimento es la detección de bajas cantidades de proteínas solubles entonces un volumen final de 50 l de resina es adecuado, que permite la detección de la proteína soluble en el intervalo de 0,1-25 mg / l de cultivo (véase el protocolo (B ) en la sección 8.2).

La producción puede ser ampliado, si es necesario, para obtener cantidades de miligramos de objetivos purificadas para estudios adicionales estructurales y funcionales utilizando las condiciones identificadas para la expresión soluble. Los detalles de los protocolos de escala-up utilizadas en AFMB se han discutido en otra parte ^22,24.

Más detalles de interés para el montaje experimental, los pasos críticos en el protocolo, modificaciones y resolución de problemas y limitaciones de la técnica se proporcionan en el discoussion. Por favor, lea la discusión antes de comenzar los experimentos.

A través de los protocolos que esperamos una tasa de éxito del 90% en cada paso (por ejemplo, al menos el 90% de los cultivos debe crecer en cualquier paso dado). Si la tasa de éxito de cualquier paso en el experimento cae por debajo del 90% de las muestras se descartan y el experimento se repite para la colección completa de las construcciones. Sin embargo, esta tasa de éxito no es aplicable al número de constructos que expresan proteínas solubles o como la proporción de construcciones que escinden con una eficiencia del 100%, ya que este será altamente dependiente de las proteínas de la prueba.

Los detalles específicos para la puesta en marcha de la mesa de trabajo del robot se proporcionan para cada protocolo (véase también la Figura 4), ​​sin embargo se pueden adaptar según sea necesario para la mesa de trabajo alternativa set-ups. El hardware del robot (Tecan) consiste en un brazo de 96 multicanal (MCA96), manipulador robótico (Roma) y el jefe de manejo de líquidos de 8 canales (LiHa). Todos los pasos que utilizan el MCA96 también se pueden realizar usando el LiHa si un MCA96 no está disponible, sin embargo, se necesitará más tiempo debido a que el LiHa tendrá que ser lavados entre los pasos. Mientras que el robot no es técnicamente un entorno estéril, la inclusión de antibióticos en general, se asegura de que no hay problemas con la contaminación o la esterilidad.

Protocol

Parte A: Transformación y Expresión de prueba

Manual de procedimientos para la clonación ²² y la transformación de la purificación se discuten en otro lugar ^24. El protocolo de transformación se puede realizar totalmente en el robot ^26, pero por lo general es hacerlo manualmente más eficiente en el tiempo. Por lo tanto los protocolos de aquí comienzan a partir de la inoculación de los cultivos previos de expresión y de las planchas de la transformación de la transformación conmocionado calor se mezcla de forma manual. Para más detalles sobre los procedimientos de clonación y transformación manual de ver las referencias relevantes ^22,24.

1. Precultivos y Plating

1. Preparar la mesa de trabajo del robot (véase la Figura 4 para las posiciones):
   1. Ponga una cubeta de 300 ml que contiene 150 ml de caldo estéril LB (suplementado con ampicilina (100 mg / ml) / cloranfenicol (34 mg / ml), u otro antibiótico apropiado) en la posición 8.
   2. Ponga un estéril DW96 en la posición 11. Deja 4x pre-preparado de 24 pocillos LB agar (Amp / CAM) placas de cultivo de tejidos (que contienen 2 ml de agar en cada pocillo) con sus tapas en posiciones 14 y 17.
   3. Ponga la placa de transformación (que contiene la transformación 96 se mezcla después de choque térmico) en la posición 13. Esto se utilizó para inocular los precultivos líquidos y placas de agar LB. Ponga una caja de puntas de pipeta 200 l estériles en la posición 18.
2. Usando el brazo 96-multicanal (MCA96) y 200 l consejos, aspirado de 200 l de caldo LB (8 posición), y dispensar en la DW96 en la posición 11. Repetir hasta que haya un volumen final de 1 ml de caldo LB en cada pocillo de la DW96. Esto se convertirá en el precultivo líquido.
3. Usando el manipulador robótico (Roma), retire la tapa de la primera de 24 pocillos placa de agar LB y colocarlo en otro lugar (por ejemplo, en un portador hotel) hasta que el forro está terminado para ese plato.
4. Utilizando el líquido de 8 canales manipulación (LiHa) cabeza, mezclar y aspirar 50 l de tque la primera columna de la mezcla de transformación en la posición 13. Este volumen de mezcla de transformación es justo lo suficiente para cubrir bien el LB-Agar.
5. Con los primeros 4 canales, dispensar en la primera columna de la primera 24-así placa de agar LB en la posición 14 (como se muestra en la Figura 5).
6. Con los últimos 4 canales, dispensar en la segunda columna de la primera 24-así placa de agar LB.
7. Lave todos los consejos a fondo después de la dispensación.
8. Continúe este proceso hasta que todas las transformaciones se han plateado en la primera placa en la posición 14, la transferencia de 96 - a 24 pocillos usando el régimen establecido en la Figura 5.
9. Una vez que la primera placa se ha completado, utilice los romaníes a colocar la tapa y retire la tapa de la siguiente placa en la posición 15. Continuar utilizando el esquema de planchas para los próximos 3 platos.
10. Una vez finalizada la galjanoplastia, establezca el Te-Shake de 1200 rpm y agitar todas las placas durante 1 minuto para tener una distribución homogénea de la mezcla de transformación.
11. Usando el MCA96 y las puntas de pipeta originales, mezclar y aspirar 60 l de la mezcla de transformación restante (posición 13) y se distribuye en la DW96 contiene caldo LB en la posición 11.
12. Selle las precultivos DW96 con lámina adhesiva transpirable para permitir que la cultura de aireación.
13. Colocar en una incubadora a 37 ° C con agitación a una velocidad máxima de O / N (200/800 rpm dependiendo de agitación).
14. Las placas de agar LB que deben ser colocados en una campana con sus tapas de hasta seco (10 min). Luego se colocan invertidos en un 37 ° C incubadora placa hasta la mañana siguiente.
15. El día siguiente, el precultivo se utilizó para inocular la expresión de prueba en un medio de auto-inducción y para la preparación de las existencias de glicerol. Coloque las placas de agar en un refrigerador, como una copia de seguridad. Si es necesario, a partir de las placas de agar o los stocks de glicerol, la expresión de prueba podría ser re-hecho mediante la inoculación de un cultivo previo LB fresco directamente.

2. Preparación de DW24 ZYP-5052 Placas

NOTA: Este procedimiento dura aproximadamente 5 minutos para completar cada juego de placas 4x DW24.

1. Make up 500 ml de medio autoinducción ZYP-5052 para cada réplica de 96 culturas (medianas 464 ml ZY, 250 l 2 M _MgSO4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS, en ese orden - las recetas de cada componente son proporcionado en la Tabla 1) suplementado con los antibióticos apropiados.
2. Preparar la mesa de trabajo del robot:
   1. Ponga dos 300 ml canales, cada uno contienen ~ 250 ml de medio en la posición 5 y 6. Ponga cuatro placas DW24 estériles en las posiciones 14 a 17. Ponga 200 l consejos en la posición 18.
3. Usando el MCA96 y 200 consejos mu l, 200 l aspirado de ZYP-5052 desde la posición 5 y dispensar en la primera placa DW24 en la posición 14. Haga esto un total de 5 veces (4 tips dispensará en un solo pozo a la vez por un total de 4 ml). Repita el procedimiento para los restantes 3 placas x DW24 en las posiciones 15 a 17, switching al ZYP-5052 en la posición 6 para las dos últimas placas DW24.

3. Inoculación y crecimiento de los cultivos de expresión de prueba

NOTA: La inoculación tarda aproximadamente 10 minutos para completar cada juego de placas 4x DW24, y el crecimiento continúa O / N.

1. Preparar la mesa de trabajo del robot:
   1. Coloque la placa de DW96 que contiene los precultivos (del paso 1,15) en la posición 11. Pon los cuatro DW24 placas que contienen medio ZYP-5052 (de la etapa 2.3) en las posiciones 14 a 17.
2. Usando el aspirado LiHa 100 l de cultivo previo de la posición 11 para inocular los cultivos de expresión de prueba (1/40 de dilución) mediante el régimen previsto en la Figura 5. Lavar la cabeza LiHa a fondo en la estación de lavado entre cada columna de los cultivos previos de 96 pocillos.
3. Sellar las placas con DW24 película transpirable e incubar a 37 ° C con agitación (200/400 rpm) durante 4 h. Este es el momento de la fase de crecimiento durante el cual Glucose desde el medio será preferentemente se haya agotado ^27.
4. Reduzca la temperatura a 17 ° C. Después de la 4 horas y el agotamiento de la glucosa, lactosa comenzará a ser metabolizado, dando lugar a la inducción de la expresión, proporcionando las condiciones óptimas de crecimiento para BL21 (DE3) pLysS o Rosetta 2 (DE3) pLysS, en este trabajo ^22. Deja que las células expresen O / N. Utilice el pre-cultivo restante para hacer reservas de glicerina.

4. Preparación de stocks de glicerol

NOTA: stocks de glicerol deben hacerse por triplicado para ser almacenados en diferentes lugares en caso de fallo del congelador.

1. Preparar la mesa de trabajo del robot:
   1. Poner las placas de microtitulación en la posición 5 a 7 para albergar los stocks de glicerol. Ponga una cubeta de 300 ml llena con 50 ml de glicerol al 100% en la posición 8. Ponga una DW96 que contiene 800 l de cultivo previo (después del paso 3.2) en cada pocillo en la posición 11. Dicho de 200 l consejos en la posición 18.
2. El uso de un SLOaspiración y dispensación w velocidad, utilizar el MCA96 y 200 l consejos para añadir glicerol al DW96 que contiene los cultivos previos.
   1. Aspirar 200 l de glicerol (de la posición 8).
   2. Dispensar 150 l (en la posición 11) primero, a continuación, hacer una pausa durante 20 segundos para permitir que el glicerol restante para llegar a la parte inferior de la punta. Vierta los 50 l restantes.
3. Utilizando los mismos consejos, mezclar la cultura y el glicerol en la DW96 en la posición 11, hasta que estén bien mezclados. La concentración final de glicerol es 20%. Aspirar 140 l de la DW96 y dispensan en la primera placa de microtitulación en la posición 5.
4. Repita el paso 4.3 para cada placa de microtitulación restante (posiciones 6 y 7).
5. Selle cada placa de microtitulación con cinta adhesiva de plástico y se almacenan a -80 ° C. Deseche la cultura que queda en la DW96, descontaminar con un agente antimicrobiano antes de su eliminación.

5. Evaluación del crecimiento de los cultivos

NOTA: No suele ser necesario evaluar la tasa de crecimiento final como el final OD ₆₀₀ suele ser el mismo para la mayoría de las culturas (alrededor de 12 en estas condiciones), sin embargo las culturas que no crecen deben tenerse en cuenta.

1. Tomar 50 l de cada cultivo (del paso 3.4) y dispensar en una placa de microtitulación de fondo plano, transparente que contiene 150 l de medio.
2. Medir el diámetro exterior _600, teniendo en cuenta la dilución de 4 veces. Si hay alguno que no crecen muy bien, tenga en cuenta esto para el análisis final.

6. Recoger las células

NOTA: Este procedimiento toma aproximadamente 45 minutos para completar.

1. Centrifugar las placas 4x DW24 (del paso 3.4) a 3000 xg durante 10 min y después descartar el sobrenadante en un recipiente de desechos con agente antimicrobiano. Toque en los platos, al revés, sobre papel absorbente para eliminar el exceso de cualquier medio.
2. Mientras tanto, la preparación de 100 ml de lisistampón (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, 10 mM de imidazol pH 8, u otro tampón preferido) que contiene lisozima (concentración final 0,25 mg / ml).
3. Preparar la mesa de trabajo del robot:
   1. Ponga el tampón de lisis en una cubeta 300 ml en la posición 5. Ponga un DW96 limpia en la posición 11. Ponga los 4 x placas DW24 que contienen los gránulos de las células (del Paso 6.1) en las posiciones 14 a 17. Ponga 200 l consejos en la posición 18.
4. Usando el MCA96 y 200 l consejos, aspirado 125 l de tampón de lisis de la posición 5 y se distribuye en cada placa DW24 (posiciones 14 a 17). Repita. NOTA: 4 consejos le dispense en un solo bien de una sola vez para un volumen final de 1 ml en cada pocillo de las placas DW24.
5. Agitan las placas en las posiciones 14 a 17 utilizando el Te-Shake (1000 rpm) durante 15 min de volver a suspender los pellets.
6. Una vez que los pellets se resuspendieron, utilizar los primeros 4 canales de la LiHa para aspirar 550 l de las muestras 1 a 4 (la primera columna de la primera DW24, en la posición 14), a continuación, utilizando la Last 4 canales de la aspirado LiHa 550 l de las muestras 5 a 8 (la segunda columna de la primera DW24). Dispense en la primera fila de la DW96 en la posición 11.
7. Repetir el paso 6.6, de modo que toda la suspensión de células se transfiere a la DW96.
8. Después de cada serie de muestras de lavar las puntas Liha en la estación de lavado.
9. Repita los pasos 6.6 a 6.8 para cada columna de cada placa DW24 (posiciones 15 a 17) con el régimen previsto en la Figura 5. Selle con la película plástica.
10. Para la purificación en el mismo día o la congelación a corto plazo, se almacena a -80 ° C durante un mínimo de 1 hora, de lo contrario almacenar a -20 ° C.

Parte B: Purificación y Análisis

7. Lisis celular

NOTA: Este procedimiento dura alrededor de 60 minutos para completar.

1. Descongelar las suspensiones de células congeladas (de la etapa 6.10) en un baño de agua (a temperatura ambiente o 37 ° C) durante aproximadamente 15 min y resuspender en la incubadora de agitación para una unaADICIONALES 10 min. Las culturas deben volverse viscosas.
2. Tomar 500 l de DNasa valores y mezclarla con 1 ml de _MgSO4 valores. Manualmente con una pipeta de 8 canales o con el robot LiHa, dispensar 15 l en cada pocillo de la DW96, para dar una concentración final de 10 g / ml de DNasa y 20 mM de _MgSO4.
3. Vuelva a sellar la placa con cinta de plástico y agitar durante 15 min. En este punto, los cultivos deben ser no viscoso. Compruebe con cuidado (por examen visual) que todas las culturas ya no son viscosas. NOTA: Esto es fundamental, si algunas culturas siguen siendo viscoso (por ejemplo, si la DNasa fue olvidado accidentalmente o no dispensada adecuadamente en algunos pozos), el filtro se obstruirá, generando una presión desigual de las muestras y de desbordamiento o la obstrucción total de la placa de filtro podría suceder durante la purificación.
4. Para las muestras de SDS-PAGE de todo el lisado celular, aspirado de 10 l de lisado y dispensar en una placa de 96 pocillos de PCR que contiene10 l de 4x tampón de muestra SDS-PAGE y 20 l de agua. Desnaturalizar durante 3 min a 95 ° C y congelar hasta que el análisis (fracción total). Si un sistema de electroforesis HTP está disponible, las muestras pueden ser analizadas en este lugar siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante para la preparación de muestras. Para más detalles sobre el análisis de las muestras véase la Sección 10.

8. Ni Purificación por Afinidad

NOTA: Una velocidad de aspiración lenta se debe utilizar para el pipeteado de todas las suspensiones de resina, como las suspensiones son bastante grueso. El exceso de secado de la resina se traducirá en una reducción de la capacidad de unión. Para la purificación, las concentraciones de imidazol especificados son aplicables a la resina de afinidad de níquel. Si se utilizan iones alternativos (por ejemplo, cobalto), a continuación, las concentraciones deben ajustarse en consecuencia.

1. A - Ni purificación por afinidad para la detección en el intervalo de 1-100 mg / L (volumen final de la resina = 200 l)
   NOTA: Tsu procedimiento de purificación toma alrededor de 1,5 horas en completarse, lo que significa que hasta 4 se pueden realizar en un día.
   1. Preparar la mesa de trabajo del robot:
      1. Poner 300 ml de canales que contienen tampón de unión (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, 10 mM de imidazol, pH 8), tampón de lavado (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 50 mM, pH 8) y tampón de elución (50 mM Tris, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazol, pH 8) en las posiciones 6 a 8, respectivamente.
      2. Deja un vacío de 300 ml a través de la posición 5 de la suspensión de resina. En la posición 9 y 10 titulares de la placa de venta. En la posición 10 poner un DW96 con el bloque de la SPE y la placa de filtro / receptor (20 micras) en la parte superior.
      3. Ponga la DW96 que contiene el lisado (del paso 7.3) en la posición 14. En la posición 18 y 19 poner los 200 consejos de ánima l de ancho y 200 l consejos, respectivamente. Ponga dos placas DW96 repuesto para el lavado y la elución en un hotel. NOTA: También podría ser puesto en un lugar alternativo en la mesa de trabajo si el hotel no está disponible.
   2. Preparar 105ml de equilibrado 33% suspensión de resina (35 ml de resina + 70 ml de tampón de unión). Añadir la suspensión de resina a la cubeta en la posición 5 inmediatamente antes de comenzar el procedimiento.
   3. Usando el MCA96 y 200 consejos calibre l ancho (posición 18), mezclar la suspensión de resina en la posición 5 a fondo antes de aspirar y dispensar 200 l de suspensión de resina en la DW96 que contiene el lisado en la posición 14. Repita dos veces para que 600 l de suspensión de resina se ha añadido al lisado, la mezcla de la suspensión de resina antes de cada aspiración.
   4. Realizar una etapa de mezcla 10 min utilizando el MCA96 en la posición 14 para permitir la encuadernación y para evitar que la resina de la granulación.
   5. Aspirar desde la posición 14 y dispensar 800 l (200 l en lotes) a la placa de filtro en la posición 9, la mezcla antes de cada aspiración de otro modo la resina será retenido en la parte inferior de la DW96.
   6. Girar el vacío en la en la posición 10 por aproximadamente 90 segundos para filtrar el lisado a través de la placa en elDW96 para recoger el flujo a través, teniendo cuidado de no secar la resina. Apague la aspiradora.
   7. Repetir los pasos 8.1.5 y 8.1.6 de manera que toda la resina se encuentra entonces en la placa de filtro.
   8. Usando el brazo RoMa mover el bloque de SPE que sostiene la placa de filtro desde la posición 10 a la posición 9 para que la próxima etapa de lavado va directamente a los residuos y transferir el DW96 que contiene el flujo a través en la posición 10 a otro sitio (por ejemplo, en un hotel portadora) hasta el final del procedimiento.
   9. Con un nuevo conjunto de puntas 200 l (en la posición 19), se lava la resina (en la posición 9) con un total de 800 l de tampón de unión (desde la posición 6), y aplicar el vacío en la posición 9 hasta que el tampón haya pasado a través . Repetir una vez más.
   10. Utilice el brazo de Roma a colocar una DW96 fresca en la posición 10 para recoger el lavado de imidazol 50 mM y mover el bloque de SPE y la placa de filtro de nuevo en la parte superior (posición 10).
   11. Añadir 800 l de tampón de lavado de la posición 7 a la posición 10, gire elde vacío hasta la memoria intermedia ha pasado a través. Apagar el vacío.
   12. Con el ROMA, quitar el bloqueo SPE y la placa de filtro en la posición 9 y el DW96 que contiene la muestra de lavado para el hotel, y mantener a un lado hasta el final del procedimiento.
   13. Lavar la resina con otros 800 l de tampón de lavado (de la posición 7 a la posición 9), aplicar el vacío hasta que el buffer ha atravesado. Repetir una vez más.
   14. Utilice los romaníes para colocar un DW96 fresca en la posición 10 y coloque el bloque de SPE y la placa de filtro de nuevo en la parte superior para recoger la elución.
   15. Añade un total de 500 l de tampón de elución (desde la posición 8 en la posición 9) e incubar in situ durante 3 min. Encienda el vacío hasta que el tampón ha atravesado.
   16. Opcional: para expresar proteínas altamente, una segunda elución puede realizarse en un DW96 fresca como en los pasos 8.1.14 y 1.8.15.
   17. Tomar muestras del flujo a través, lavar y elución / s para SDS-PAGE o electroforesis HTP.
       1. Para las muestras de SDS-PAGE del flujo a través, dispenso 10 l en una placa de 96 pocillos de PCR que contiene 10 l de 4X de tampón de muestra SDS-PAGE y 20 l de agua. Para las muestras de SDS-PAGE de lavado y elución / s dispensan 30 l en placas de PCR que contienen 10 l de 4x tampón de muestra SDS-PAGE. Desnaturalizar durante 3 min a 95 ° C y congelar hasta su análisis.
       2. Para las muestras de electroforesis HTP, siga las instrucciones del fabricante. Para más detalles sobre el análisis de las muestras véase la Sección 10.
2. B - purificación por afinidad de Ni para la detección en el intervalo de 0,1-25 mg / L (volumen de resina final = 50 l)
   NOTA: Este procedimiento de purificación es de unos 30 minutos en completarse, lo que significa que hasta 12 se pueden realizar en un día.
   1. Preparar la mesa de trabajo del robot:
      1. Poner 300 ml de canales que contienen tampón de unión (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, 10 mM de imidazol, pH 8), tampón de lavado (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, 50 mM de imidazol, pH 8)y tampón de elución (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8) en las posiciones 6 a 8, respectivamente.
      2. Deja un vacío de 300 ml a través de la posición 5 de la suspensión de resina. En la posición 9 y 10 titulares de la placa de venta. En la posición 10 poner un DW96 con el bloque de la SPE y la placa de filtro / receptor (20 micras) en la parte superior.
      3. Ponga la DW96 que contiene el lisado (del paso 7.3) en la posición 14. En la posición 18 y 19 ponen 200 l consejos de calibre ancho y 200 l consejos, respectivamente. Coloque una placa de microtitulación de 96 pocillos de repuesto para la elución en un hotel. NOTA: Esto también podría ser puesto en un lugar alternativo en la mesa de trabajo si el hotel no está disponible.
   2. Preparar 50 ml de suspensión de resina se equilibró el 25% (12,5 ml de resina + 37,5 ml de tampón de unión). Añadir la suspensión de resina a la cubeta en la posición 5 inmediatamente antes de comenzar el procedimiento.
   3. Usando el MCA96 y 200 consejos calibre l ancho (posición 18), mezclar la suspensión de resina en la posición 5 a fondo antes de aspirar y Pinturas densing 200 l de suspensión de resina en el DW96 que contiene el lisado en la posición 14.
   4. Incubar a temperatura ambiente con agitación usando el Te-Shake a 1400 rpm durante 10 min para permitir la unión.
   5. Aspirar desde la posición 14 y dispensar el 1,200 l completo (en 200 l lotes) usando las puntas de gran diámetro (18) de posición sobre la placa de filtro en la posición 10. Mezclar antes de cada aspiración de otro modo la resina será retenido en la parte inferior de la DW96.
   6. Encienda la aspiradora en la posición 10 durante aproximadamente 30 segundos para filtrar el lisado a través de la placa en la DW96 para recoger el flujo a través, teniendo cuidado de no secar la resina. Apague la aspiradora.
   7. Usando el brazo roma, mover el bloque de SPE que sostiene la placa de filtro desde la posición 10 a la posición 9 para que la próxima etapa de lavado va directamente a los residuos y transferir el DW96 que contiene el flujo a través en la posición 10 a otro sitio (por ejemplo, en una hotel de portador) hasta el final del procedimiento.
   8. Con los 200 μconsejos l (en la posición 19), se lava la resina (en la posición 9) con un total de 800 l de tampón de unión (desde la posición 6), y aplicar el vacío en la posición 9 hasta que el tampón haya pasado a través. Repita.
   9. Utilice el brazo de Roma a colocar la DW96 fresca en la posición 10 para recoger el lavado de imidazol 50 mM y mover el bloque de SPE y la placa de filtro de nuevo en la parte superior (posición 10).
   10. Añadir 150 l de tampón de lavado de la posición 7 a la posición 10, a su vez el vacío hasta que el buffer ha atravesado. Apagar el vacío.
   11. Con el ROMA quitar el bloqueo SPE y la placa de filtro en la posición 9 y el DW96 que contiene la muestra de lavado para el hotel, y mantener a un lado hasta el final del procedimiento.
   12. Lavar la resina con otros 800 l de tampón de lavado (de la posición 7 a la posición 9), aplicar el vacío hasta que el buffer ha atravesado. Repita.
   13. Utilice los romaníes para colocar la microplaca en la posición 9 y coloque el bloque de SPE y la placa de filtro de nuevo en la parte superior para recoger the elución.
   14. Añadir 190 l de tampón de elución (a partir de la posición 8 en la posición 9) e incubar in situ durante 3 min. Aplicar el vacío hasta que todo haya pasado a través de búfer.
   15. Tomar muestras del flujo a través, de lavado y de elución de SDS-PAGE o electroforesis HTP.
       1. Para las muestras de SDS-PAGE del flujo a través, dispensar 10 l en una placa de 96 pocillos de PCR que contiene 10 l de 4X de tampón de muestra SDS-PAGE y 20 l de agua. Para las muestras de SDS-PAGE de lavado y elución / s dispensan 30 l en placas de PCR que contienen 10 l de 4x tampón de muestra SDS-PAGE. Desnaturalizar durante 3 min a 95 ° C y congelar hasta su análisis.
       2. Para las muestras de electroforesis HTP, siga las instrucciones del fabricante. Para más detalles sobre el análisis de las muestras véase la Sección 10.

9. Tag Cleavage (Opcional)

1. Añadir la proteasa TEV (2 mg / ml) a la proteína eluida (del paso 8.1.15 (y 8.1,16) o el paso 8.2.14) en una proporción de 1/10 (v / v).
2. Incubar a temperatura ambiente (o 4 ° C para las proteínas sensibles a la temperatura) O / N con agitación suave.
3. Al final de la escisión dispensar 30 l en una placa de PCR que contiene 10 l de 4x tampón de muestra SDS-PAGE o seguir las instrucciones del fabricante para electroforesis muestras HTP.
4. Se filtra la mezcla de escisión restante (del paso 9.2) a través de un 96-así 0,22 micras placa de filtro y se recoge el flujo a través soluble en un DW96 por aplicar el vacío. Esto se puede hacer en uno de los sitios de vacío (por ejemplo, posición 10) en el robot de manejo de líquidos, como para las etapas de elución en las Secciones 8.1 y 8.2. Esto elimina cualquier proteína que precipitó durante la segmentación.
5. Después de la filtración, dispense 30 l en una placa de PCR que contiene 10 l de 4x tampón de muestra SDS-PAGE o preparar como electroforesis muestras HTP. Esto permite la comparación de la proteína antes de la separación, la mezcla después de la escisión y el Solproteína uble restante después de la escisión y da buenos indicadores de los resultados esperados en los experimentos posteriores de escalado. Para más detalles sobre el análisis de las muestras véase la Sección 10.

10. Análisis de los resultados

1. Identificar las construcciones que expresan la proteína soluble mediante el análisis de las muestras de purificación en SDS-PAGE, transferencia de puntos o sistema de electroforesis HTP tales como la pinza de LabChip.
   1. Analizar las muestras de elución primero en identificar las construcciones que producen la proteína soluble. En la mayoría de los casos sólo se analizan las muestras de elución si se identifican construcciones solubles, para minimizar el tiempo empleado en el análisis.
   2. Si la proteína no se encuentra en la elución, ejecute las muestras de lavado y de flujo continuo para ver si se expresó y no se unió adecuadamente a la resina.
   3. Para construcciones donde no hay proteína soluble se puede detectar de ejecución todo el lisado celular para ver si se expresó la proteína.
      NOTA: Una limitación aquí es que si el protein de interés no se presentan los niveles de expresión de antecedentes anteriores, puede que no sea posible ver la proteína y podría conducir a un resultado falso negativo. Debe tenerse en cuenta que siempre es posible para las proteínas que se pegan y se precipitan sobre la resina de afinidad y esto podría dar lugar a un falso negativo o subestimación de la producción mediante el protocolo recomendado (un evento raro en este trabajo). En el caso de que la proteína precipita sobre elución (un gránulo blanco es visible un minuto pocos / hora después de la elución) se recomienda para cambiar la composición del tampón (por ejemplo, concentración de sal) y / o llevar a cabo un ensayo de fluorometría de barrido diferencial para optimizar la tampones. Una pequeña muestra de la resina también se puede resuspender en tampón de muestra de SDS-PAGE y se hirvió para detectar si una proteína está siendo retenido en la resina.
   4. Si la proteína no se expresa pero las células no crecen, seguir una nueva estrategia de expresión, o si el OD ₆₀₀ no era lo suficientemente alta vuelvan a crecer y reanalizar la cultura. >
   5. Si las muestras de escisión se van a analizar, que deben ser analizados de una manera lado a lado, de manera que cada construcción puede ser mostrado antes de la escisión de una después de la escisión en los carriles adyacentes, para simplificar el análisis.
2. A menos que el uso de un método que da la cuantificación directa de la concentración de elución, la cuantificación se debe realizar para las muestras positivas mediante la medición de la absorbancia a 280 nm (A280).
   1. Medir la A280, teniendo el coeficiente de extinción de la proteína en cuenta y utilizando el tampón de elución como blanco, para proporcionar una estimación de la producción de proteína con el fin de identificar los más altos que expresan constructos solubles.
   2. Para la comparación más fiable de los rendimientos solubles, se recomienda para normalizar los rendimientos por la densidad de la cultura (usando la OD ₆₀₀ de medición), que fue tomada en la Sección 5. Si todos los cultivos crecieron a aproximadamente la misma densidad, la normalización no es requerida.

e "> 11. Control de Calidad

1. Las muestras pueden ser analizadas directamente de la elución de la muestra o la escisión por espectrometría de cromatografía-masa líquida (LC / MS).
2. Alternativamente, desalar primera (para eliminar el imidazol y cualesquiera sales tampón que pueden estar presentes) usando puntas de pipeta ZipTip o métodos de cromatografía de líquidos, a continuación, analizar mediante desorción por láser asistida por matriz / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o ionización por electrospray ( ESI) espectrometría de masas.
3. Estudios funcionales en pequeña escala pueden llevar a cabo para verificar si la función de la proteína es como se esperaba. Si se requieren mayores cantidades para la función, una cultura ampliación se puede hacer y la función de la prueba de la cultura más grande una vez que el tamaño y el estado de oxidación se han confirmado en la pequeña escala.

Results

Los resultados representativos se muestran en la Figura 6 para la detección de expresión de 96 proteínas disulfuro-rica de la tubería VENOMICS. Las proteínas se disponen mediante el aumento de número de enlaces disulfuro a continuación, el aumento de número de residuos. Los péptidos se expresan en el citoplasma con una cola de His y compañero de fusión DsbC. Al utilizar las condiciones de cultivo recomendadas, una DO ₆₀₀ de 12 se logra normalmente. Los péptidos se purificaron usando el protocolo 8.2-B con un volumen final de 50 l de resina de afinidad de níquel, por lo que un máximo de proteína de ~ 25 mg / L de fusión podría ser detectada en este experimento.

La Figura 6A muestra el resultado de electroforesis desde el sistema de pinza de LabChip (mostrando la fusión antes de la escisión) y el sistema de puntuación basado en la extrapolación para producir en mg / l de cultivo de la proteína de fusión (en niveles de 0,1 a 2 cultura mg / L, 2 a 10 mg / l de cultivo, 10 a 25 mg / L de la cultura y sin t detecte.) Tenga en cuenta que la etiqueta DsbC escinde normalmente se ejecuta en torno a 32 kDa, en lugar de 27 kDa como se esperaba. Del mismo modo, las fusiones DsbC también corren alrededor de 5 kDa más altos de lo esperado. Para muchos de los objetivos que no sólo vemos la fusión intacta (banda superior), pero también la pareja de fusión solo (banda inferior). Para algunos de estos objetivos la optimización de las condiciones de cultivo puede mejorar la relación de la fusión intacta (banda superior) en comparación con solo DsbC lo que permite un aumento de la producción final. La puntuación se basa sólo en el nivel de fusión intacta. Sólo 16 de las 96 proteínas no podrían ser detectados en el nivel de fusión. Esto corresponde a un nivel general de éxito del 83%. De los 80 proteínas que podrían ser detectados, 45 de ellos se detectaron niveles mayores que 2 mg / l de cultivo (56%). Dependiendo de objetivo y de la fusión, los rendimientos de proteínas son por lo general en el intervalo de 2-100 mg / l de cultivo (aunque en este ejemplo utilizando el protocolo 8.2 B un máximo de ~ proteína de 25 mg / L de fusión puede ser detectado).

t "> Un análisis del éxito por número de enlaces disulfuro presentes (que se muestra en la Figura 6B) muestra el éxito razonable para todos los números de enlaces disulfuro ensayadas (entre 1 y 7), con el nivel de éxito más bajo con un 66% para los objetivos que contienen 6 disulfuro bonos. Un análisis de la distribución de la expresión de éxito basada en el punto isoeléctrico y número de residuos (que se muestra en la Figura 6C) no muestra sesgo particular para la técnica, con los dos objetivos y metas que no se detectaron dispersos por toda la parcela expresadas con éxito.

La figura 6D muestra un ejemplo de los resultados de la espectrometría de masas obtenidos a partir de la espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) para un único objetivo, antes y después de la reducción de la muestra con DTT. Normalmente, no sería necesario un análisis de espectrometría de masas tales exhaustiva a realizar (no necesitaría una muestra reducida a ser analizada), sin embargo, para los propósitos de demonstratio completan hemos demostrado ambos resultados. El objetivo que se muestra es una proteína de veneno de disulfuro-rica 5,7 kDa con 4 enlaces disulfuro. El espectro de la izquierda muestra los resultados para la proteína antes de la reducción con DTT, ya que era después de la escisión y desalación sin más intervención. El espectro en el lado de la derecha muestra la proteína después de la reducción con DTT seguido de desalación para eliminar cualquier exceso de DTT. Los iones que corresponden a las masas experimentales están marcados con flechas en el espectro y la designación para cada ion se muestra en verde. Las masas de padres experimentales calculados para estos iones (para la proteína antes de la reducción (TDT) y después de la reducción (+ DTT)) se muestran en la tabla. Las masas (5709,6 Da para la muestra antes de la reducción y 5717,6 Da para la muestra reducida) presentan una diferencia de masa de 8 Da. Una diferencia de masa de 2 Da corresponde a la presencia de 1 enlace disulfuro oxidado, por lo tanto, una diferencia de masa de 8 Da indica la presencia de 4 enlaces de disulfuro (como se esperaba) enla muestra no reducida.

Figura 1. Representación esquemática del protocolo de detección de expresión de alto rendimiento. Usando este protocolo, 96-384 condiciones pueden ser probados por una sola persona en una semana utilizando métodos manuales, o hasta 1152 condiciones con el equipo semi-automatizado descrito. Los plásmidos de expresión se construyen utilizando una tecnología de clonación de recombinación de manera que numerosos objetivos pueden ser sub-clonaron en un momento. Una vez que las condiciones de expresión solubles han sido identificados y la escisión realizada, si se desea, la proteína puede proceder al control de calidad para comprobar la oxidación y la pureza, microassays y / o la producción a gran escala.

Figura 2. Esquema para la clonación de recombinación universal y la construcción de diseño. De los clones entrada de destino, múltiples vectores de expresión pueden ser sub-clonaron en un único experimento de una manera el rendimiento de alta (hasta 6 x 96 clones de entrada en una semana). La proteína expresada codifica una etiqueta HIS para la purificación de afinidad de níquel. El DsbC (que carece de su secuencia de señal periplásmica para la expresión citoplásmica) pareja de fusión se utiliza para aumentar la solubilidad y / o la ayuda de plegado y correcta oxidación de la proteína diana. Tenga en cuenta que la secuencia de codificación de destino debe contener un sitio de proteasa TEV N-terminal (ENLYFQ) si se desea la señal de corte. El recuadro en la parte superior izquierda muestra la producción de los clones de entrada utilizando un vector donante y las secuencias diana, que puede ser obtenido por PCR o la síntesis de genes. Entrada clones también se pueden obtener de colecciones de clones de entrada comerciales. Múltiples sistemas de clonación de recombinación están disponibles, sin embargo, utilizamos el syste de Gatewaym, como se muestra en el esquema.

Figura 3. Tubería cribado de alto rendimiento para múltiples objetivos disulfuro-rica. Los objetivos se expresan inicialmente como fusiones SU-DsbC en el citoplasma de las células BL21 (DE3) pLysS de E. coli a 37/17 ° C utilizando un medio de auto-inducción (ZYP-5052). La purificación se lleva a cabo en resina de níquel seguido por la detección de construcciones solubles por electroforesis HTP (o con el punto de transferencia / SDS-PAGE). Si la primera ronda de selección de expresión no tiene éxito, se prueban las condiciones de cultivo alternativos. Si constructos producen proteínas solubles en los rendimientos suficientemente altos, microassays y control de calidad puede llevar a cabo y, en caso necesario, la producción a gran escala puede ser perseguido. Para los destinos donde los rendimientos solubles no son lo suficientemente altos, la detección de expresión puede continuar con estra alternativains y las temperaturas luego otra socios de fusión y expresión periplásmico. Los pasos opcionales se indican mediante cajas de trazos.

Figura 4. Configuración Robot Mesa de trabajo para la plataforma de HTP. Se muestra el diseño de nuestro manejo robot mesa de trabajo líquido, a pesar de las mesas de trabajo alternativos también pueden ser utilizados siempre hay sitios equivalentes disponibles. La instalación consta de una estación de lavado (WS) para el (la cabeza de 8 canales de manejo de líquidos (LiHa)), dos soportes para microplacas con 4 posiciones cada uno (MP4, las posiciones 1-4 y 5-8), una estación de vacío con 2 posiciones (Te-VACS, las posiciones 9 y 10), un portador de microplacas con 3 posiciones (MP3, posiciones 11-13), dos agitadores de la placa con 2 posiciones cada uno (Te-Shaker, posiciones 14-15 y 16-17) y un vehículo para puntas desechables con 3 posiciones (DITI, las posiciones 18 a 20). Además, lare son dos portadores de hoteles para placas de pocillos profundos y uno para microplacas (no mostrado). El hardware instalado en el robot de manejo de líquidos es un brazo de 96 multicanal (MCA96) para puntas desechables, un niño de 8-canal de la cabeza de tratamiento de líquidos (LiHa) con puntas fijas y un manipulador robótico (Roma) que mueve las placas / equipos en torno a la mesa de trabajo. La numeración de las posiciones se hace referencia a todo el protocolo.

Figura 5. Esquema para la transferencia de una sola placa de 96 pozos en cuatro placas de 24 pocillos.

Figura 6. Los resultados representativos se muestran para la pantalla de expresión de 96 disulfuro-rica veneno Proproteínas. Las proteínas se expresan como fusiones HIS-DsbC en el citoplasma y se purificó utilizando 50 l de resina de níquel (Protocolo 8.2-B). A) Expresión de cribado resultados, que muestran gel virtual y de puntuación para el rendimiento de expresión. El contraste en el gel virtual se ha ajustado-lane-al carril para compensar bandas muy tenues o intensos. Tenga en cuenta que para algunos objetivos dos bandas se pueden ver, la banda superior correspondiente a la proteína de fusión intacta y la banda inferior correspondiente a la etiqueta de fusión solo. B) La proporción de proteínas expresadas en cada nivel de expresión en comparación con el número de enlaces disulfuro en la proteína. El número real de proteínas en cada grupo se superpone en el gráfico. C) La distribución de los niveles de expresión basado en el punto isoeléctrico (pI) y el número de residuos. D) Un ejemplo de los resultados de la espectrometría de masas para un disulfuro-rica veneno de 5,7 kDa proteína con 4 enlaces disulfuro. El espectro enel lado izquierdo muestra la proteína antes de la reducción con DTT y el espectro en el lado de la derecha muestra la proteína reducida con DTT y luego se desaló. Los iones correspondientes a las masas experimentales están marcados con flechas y sus asignaciones se muestran en verde. Las masas experimentales para la proteína antes de la reducción y después de la reducción se muestran en la tabla y muestran una diferencia de masa de 8 Da, que corresponde a la presencia de proteína oxidada antes de la adición del agente reductor. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra .

Componente	Receta	Comentario
ZY	~ 928 ml 10 g de triptona 5 g de extracto de levadura 925 ml de agua	Mezclar y esterilizar en autoclave para esterilizar.
2 M MgSO4	100 ml 49,3 g MgSO4 · 7 H2O ~ 60 ml de agua	Revuelva hasta que se disuelva y luego en autoclave para esterilizar.
50x 5052	1 L 250 g de glicerol 730 ml de agua 25 g de glucosa 100 g de α-lactosa	Añadir en secuencia, revuelva a fuego lento hasta que todo se disuelve entonces en autoclave para esterilizar.
20x NPS	1 L 900 ml de agua 66 g (NH 4) 2 SO 4 136 g de KH 2 PO 4 142 g de Na 2 HPO 4	Añadir en secuencia y revuelva hasta que todo se disuelve entonces autoclave para esterilizar.

Tabla 1. Receta para componentes del medio ZYP-5052.

Discussion

No existe un protocolo único y universal para la expresión de doblado, proteínas solubles, funcionales. Para ser costo y eficiente en el tiempo, la mayoría de los laboratorios o instalaciones centrales de proteínas que trabajan con múltiples objetivos, por tanto, utilizan la expresión de proteínas de alto rendimiento de detección para encontrar la mejor combinación "genérico" de las variables para obtener una proteína activa soluble en la mayoría de los objetivos. Hemos identificado DsbC como una pareja de fusión de aplicación general para la expresión soluble de péptidos y proteínas ¹¹ disulfuro-rica. El uso de fusiones de DsbC y métodos de alto rendimiento, dentro de una semana la expresión soluble de múltiples objetivos se puede observar ¹¹ y luego variables adicionales, tales como los discutidos en la introducción, se puede cribar en rondas posteriores en aquellos objetivos que requieren una mayor optimización. Los protocolos que se describen en este documento tienen como objetivo la expresión de las proteínas y péptidos disulfuro ricos. Sin embargo, para los usuarios que deseen expproteínas no reticuladas ress en un alto rendimiento, los protocolos correspondientes han sido publicados anteriormente y se pueden encontrar en otras partes ^22,24.

La configuración de alto rendimiento es ideal para una serie de aplicaciones, incluyendo la detección de un gran número de diferentes proteínas para la expresión soluble o el cribado de un gran número de construcciones de expresión (incluyendo etiquetas de fusión diferentes) para varios genes diana al mismo tiempo ( o expresión múltiple construye para un solo objetivo) con el fin de mejorar las tasas de éxito. La plataforma también se puede utilizar para la evaluación comparativa y la validación de nuevos protocolos en un gran número de objetivos. Otras aplicaciones incluyen la detección de variantes de un único objetivo difícil, por ejemplo, todos los ortólogos o miembros de la misma familia, o para comprobar el éxito de la producción de un panel de mutantes de un solo objetivo en un experimento. Este protocolo también se ha utilizado en combinación con vectores co-expresión (WITh una proteína marcada solamente) para permitir que el telecine y caracterización preliminar de los complejos de proteína-proteína, seguido de análisis biofísico más a fondo para confirmar la formación de complejos y la estequiometría correcta ^33. La cantidad de proteína purificada a veces es conveniente para los micro-ensayos (pruebas funcionales, las proteínas de ADN ³⁴ o ensayos de interacción proteína-proteína). Hay varias ventajas de la estrategia de cribado de alto rendimiento de expresión: (i) la capacidad de probar un gran número de objetivos o un gran número de variables en un solo experimento, (ii) limitada variación de lote a lote, (iii) la la sencillez y la facilidad de trabajar en una escala más pequeña usando pozos profundos, (iv) la escalabilidad y la reproducibilidad en mayor escala, (v) la posibilidad de automatización, y (vi) la simplicidad de seguimiento y manipulación (no etiquetado de tubos individuales, menos errores introducidos cuando se utiliza el formato de placa que con la manipulación de tubos individuales en la mezcla o intercambio de clones).

Aunque no se discute en la sección de protocolo, hay varias consideraciones importantes para la preparación del experimento que se discutirá brevemente a continuación. Para una discusión más detallada, por favor consulte nuestra publicación anterior ^24. Para una máxima eficiencia, es beneficioso contar con un sistema adecuado para la clonación de alto rendimiento, para simplificar la sub-clonación de un gran número de objetivos. Para la fase inicial del proyecto VENOMICS, utilizamos el sistema de recombinación de puerta de enlace ²⁵ versátil que permite la subclonación en cualquier vector de destino a un ritmo de cientos de clones por semana. Protocolos del Gateway clonación de recombinación se pueden encontrar en el sitio web de Invitrogen. Otras alternativas para la clonación de alto rendimiento incluyen la ligadura independiente clonación (LIC) ^35,36 y la restricción (SR) clonar ^37. Hay varias formas de obtener los genes diana para la expresión, incluso mediante PCR a partir de ADN molde, de colecciones de clones de entrada o comogenes sintéticos, lo cual es la estrategia elegida para el proyecto VENOMICS. Los genes sintéticos se pueden pedir con sitios de recombinación en cada extremo del gen y el gen de la síntesis permite la optimización de codones fácil de la secuencia de gen diana (para excluir codones raros de E. coli). Esto es recomendable pero no esencial. Para objetivos sin optimización de codones que contienen un alto número de codones raros, Rosetta 2 (DE3) pLysS (que lleva ARNt para codones raros que no son altamente expresado en E. coli) puede ser más adecuado que BL21 (DE3) pLysS. Mientras que hay cepas disponibles que limitan la reducción de los enlaces disulfuro en el medio ambiente normalmente de reducir el citoplasma, en nuestras manos no han tenido tanto éxito como E. regulares coli cepas ^11.

Purificación por afinidad escala analítica se lleva a cabo a partir de los cultivos de expresión de prueba con el fin de recuperar las proteínas de fusión solubles y cuantificar los rendimientos. Los datos cuantitativos se pueden obtener en el the rendimientos solubles de las proteínas de fusión expresadas dentro de un rango de 0,1 - 100 mg / l de cultivo. Si un objetivo no es soluble, de expresión y de inducción temperaturas, tensiones o medios alternativos pueden ser probados antes se persiguen diferentes parejas de fusión. Para la expresión de las proteínas solubles en disulfuro-rica, que previamente clasificado como el efecto de las parejas de fusión como DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> Su-etiqueta para la expresión citoplasmática ^11. Expresión periplásmica es otra posibilidad que puede ayudar al plegamiento éxito de los objetivos de disulfuro-rica. El periplasma es un ambiente menos reductor que contiene el citoplasma y chaperonas redox útiles para ayudar a la unión disulfuro. DsbC, DsbA, y MBP proteínas están normalmente localizados en el periplasma por sus secuencias señal periplásmicas. Esto proporciona la oportunidad de explotar estas etiquetas para dirigir los objetivos de disulfuro-rica al espacio periplásmico con el fin de ayudar a plegado. Para blancos intratables, el siguiente paso sería purify el objetivo marcado con His insoluble de cuerpos de inclusión, solubilizar y replegar (esto está fuera del alcance de este protocolo y no se discutirá aquí ^{3 9).} Esto puede ser bastante simple para objetivos con sólo uno o dos enlaces disulfuro, pero se vuelve cada vez más difícil, ya que el número de enlaces disulfuro se incrementa. Alternativamente, y particularmente para las proteínas y péptidos con cuatro o más enlaces de disulfuro, puede ser beneficioso para tratar sistemas de producción más complejas, tales como levadura, de insecto o de expresión de mamífero.

Con los avances en la miniaturización y automatización, las tecnologías de la electrofisiología HTP lab-on-a-chip ^28, sin duda, ser el camino del futuro para los análisis funcionales. Prevemos que para la mayoría de propósitos (quizás con la excepción de los estudios estructurales) esto negar la necesidad de cultivos a gran escala. Culturas a pequeña escala no sólo serán útiles para las condiciones de expresión de cribado, sino también ser capaz de proporcionar suficientes cantidades de muestra para estos ensayos funcionales miniaturizados. La capacidad para producir múltiples objetivos en paralelo en cantidades suficientes para la caracterización funcional reducirá los costes de cultivo y el uso de este tipo de plataformas, expresión y caracterización de las proteínas recombinantes se harán más costo y el tiempo-efectiva.

Los protocolos de la presente memoria se han aplicado a la expresión de péptidos y proteínas disulfuro-rica en la fase inicial del proyecto 7PM VENOMICS Europea. Venenos son una excelente fuente de péptidos bioactivos que a menudo tienen un interesante potencial farmacológico. Sin embargo, su producción es un reto debido a sus patrones de disulfuro de unión complejas y tamaño pequeño. El uso de plataformas de alto rendimiento como el descrito en el presente documento, el proyecto VENOMICS tiene como objetivo generar una biblioteca de 10.000 nuevos péptidos de veneno de reproducir la diversidad observada en la naturaleza. Esta biblioteca será explotado para la caracterización de disulfuro-rpéptidos ich con farmacológica potencial o aplicaciones terapéuticas con el objetivo de desarrollar nuevos fármacos. La plataforma se está utilizando actualmente para la evaluación comparativa y la validación de nuevos protocolos para su uso en el proyecto VENOMICS.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Robot de manipulación de líquidos Tecan Freedom EVO 200	Tecan Group Ltd.		Los protocolos se pueden adaptar a cualquier robot de manejo de líquidos con un colector de vacío para placas. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8
placas PCR de 96 pocillos (PCR96)	Greiner Bio-One	652270	http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/
LB medio			Esterilizado en autoclave para esterilidad.
Existencias			Kanamicina (50 mg/ml), ampicilina (100 mg/ml), cloranfenicol (34 mg/ml en etanol), existencias de almacenamiento en &-; 20 °C. Utilice una dilución 1:1.000.
Placa de pocillo profundo 96 (DW96) con capacidad de volumen de 2,42 ml	Greiner Bio-One	780270	Esterilizado en autoclave para la esterilidad. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/
Vectores de			Para la expresión de construcciones objetivo. Almacenar en &menos; 20 °C.
BL21 (DE3) Células			O cepa de expresión alternativa E. coli a elección del usuario. Almacenar en &menos; 80 °C.
Película adhesiva transpirable Breathseal	Greiner Bio-One	676050
Máquina de PCR con bloque			Para la transformación, el choque térmico y la ebullición de muestras SDS-PAGE/Caliper.
Placas de cultivo de tejidos estériles de 24 pocillos	Greiner Bio-One	662165	http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/
LB-agar			esterilizadas en autoclave para la esterilidad.
200 μ l puntas desechables estériles	Tecan Group Ltd.	30 038 617	http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 Incubadora
de agitación Multitron, con tiro de 3 mm	Infors	AJ103	No es esencial, también se puede utilizar una incubadora de agitación normal. http://www.infors-ht.com/index.php/en/
Incubadora de placas Placa
			Para las reservas de glicerol y la elución utilizando el protocolo de purificación B.
Glicerol			Para la preparación de caldos de glicerol.
200 μ l Puntas desechables	Tecan Group Ltd.	30 038 616 http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Almohadillas para cinta adhesiva	Qiagen	19570	http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads
Bactinyl	Orapi Group		O desinfectante microbiano equivalente.
ZYP-5052 medio			Consulte Tabla 1 para ver las recetas de los componentes.
Pocillo profundo 24 placas (DW24), capacidad de 10 ml	Whatman	7701-5102	Esterilizado en autoclave para esterilidad. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102
Placa de microtitulación transparente de fondo plano	Greiner Bio-One	655101	Para lecturas de absorbancia. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/
Espectrofotómetro			de lectura de placasOpcional. Para medir OD600 de cultivos.
Centrífuga con rotor para placas de pozos profundos			Apto para 3.800 x g.
Lisozima			50 mg/ml en agua. Almacenar en &menos; 20 °C.
Imidazol grado ACS	Merck	IX0005-1	Se debe utilizar un grado de imidazol de alta calidad para que no interfiera con las lecturas de A280 para calcular el rendimiento de proteínas.
Tampón			50 mM Tris, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol pH 8 que contiene 0,25 mg/ml de lisozima (o su tampón preferido). Agregue lizozima de las existencias cada vez y no almacene durante períodos prolongados.
de agua
Sonido de placa (Procesador ultrasónico XL, adaptado para placas de pozos profundos)	Misonix Inc.		No es esencial. La lisozima sola es normalmente suficiente para una lisis casi completa.
DNasa			2 mg/ml de caldo en agua, esterilizado con filtro. Almacene las alícuotas en &menos; 20 °C.
Sulfato de magnesio (MgSO4)			2 M en agua, esterilizado en autoclave.
SDS-PAGE o tampón de muestra del calibrador
Tampón			50 mM Tris, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol pH 8 (o su tampón preferido). Almacenar a 4 °C.
Tampón			50 mM Tris, 300 mM de NaCl, 50 mM de imidazol pH 8 (o su tampón preferido). Almacenar a 4 °C.
Tampón			50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol pH 8 (o su tampón preferido). Almacenar a 4 °C.
Receptor/Placa de filtro de 96 pocillos 20 y micro; m, capacidad de 1,8 ml	Macherey-Nagel	740686.4	http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx
200 μ l Puntas desechables de diámetro ancho	Tecan Group Ltd.	30 050 348	http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2
Ni Sepharose 6 Resina Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-02	Para la purificación de proteínas de fusión diana. Almacenar a 4 °C. Lavar y equilibrar antes de usar. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802
Virus del Grabado del Tabaco (TEV) proteasa			Opcional, para el escote. 2 mg/ml, sin agentes reductores en el tampón de almacenamiento. Almacenar en &menos; 80 °C.
96 pocillos 0,22 y micro; m placa filtrante	Millipore	MSGV N22 10	Opcional. Para filtrar la fracción soluble después de la escisión. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210
SDS-PAGE/equipo de transferencia de puntos o equipo			El aparato de electroforesis y la elección del tipo de gel queda a criterio del usuario A su discreción.
Espectrofotómetro y cubetas			Para medir la absorbancia a 280 nm (A280) para calcular el rendimiento de proteínas solubles. No es necesario si el análisis se realiza en la pinza.
Puntas de pipeta ZipTip	Millipore		Opcional. El tipo de ZipTip queda a discreción del usuario. La resina C4 debe usarse para proteínas más grandes, mientras que para los péptidos C18 puede ser mejor. También se pueden utilizar métodos alternativos para la desalinización de muestras para limpiar las muestras antes de un mayor control de calidad. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0
Los materiales se enumeran en el orden en que se requieren en la sección de Protocolo. Los reactivos se pueden almacenar a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Números de referencia del autor» Se proporcionan los materiales preferidos, sin embargo, también pueden ser adecuados productos equivalentes. En el caso de los reactivos en los que la marca no influirá en el resultado del experimento, se han omitido los datos de la empresa.