La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Resumen

Después de la transección de la médula, el pez cebra adulto tenga la recuperación funcional a las seis semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas de la transparencia de las larvas y una recuperación más rápida, se presenta un método para seccionar la médula espinal de las larvas. Después de transección, se observa la recuperación sensorial a partir de los 2 días después de la lesión, y el movimiento C-doble por 3 días después de la lesión.

Resumen

Mamíferos fallan en la recuperación sensorial y motora después de una lesión de la médula espinal debido a la falta de regeneración axonal por debajo del nivel de la lesión, así como una incapacidad para reiniciar la neurogénesis médula. Sin embargo, algunos anamniotes incluyendo el pez cebra exposición Danio rerio tanto sensorial y la recuperación funcional, incluso después de la transección completa de la médula espinal. El pez cebra adulto es un organismo modelo establecido para el estudio de la regeneración después de una lesión de la médula espinal, con la recuperación motora y sensitiva a las 6 semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas del análisis in vivo del proceso regenerativo disponible en la larvas de pez cebra transparente, así como herramientas genéticas no son accesibles en el adulto, usamos la larvas de pez cebra para estudiar la regeneración después del corte transversal de la médula espinal. Aquí se demuestra un método para reproducible y verificable transección de la médula espinal de las larvas. Después de transección, nuestros datos muestran principio de recuperación sensorial a los 2 días después de la lesión (ppp), ingenioh del movimiento C-bend detectable por 3 dpi y la reanudación de la natación libre por 5 dpi. Por lo tanto se propone la larvas de pez cebra como una herramienta complementaria para el pez cebra adulto para el estudio de la recuperación después de una lesión de la médula espinal.

Introducción

Mayor trauma en la médula espinal humana a menudo resulta en la parálisis permanente y pérdida de la sensación por debajo del nivel de la lesión, debido a la incapacidad para volver a crecer los axones o reiniciar la neurogénesis ^1,2. A diferencia de los mamíferos, sin embargo, anamniotes incluyendo salamandras y el pez cebra (Danio rerio) muestran recuperación robusta, incluso después de la sección completa de la médula espinal ^3,4.

El pez cebra adultos es un modelo bien establecido para estudiar el proceso de recuperación tras la lesión de la médula espinal ^5-7. Después de la transección complet....

Protocolo

El pez cebra fueron criados y criados según procedimientos estándar; experimentos fueron aprobados por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Utah.

1. Preparación de las placas Cirugía

1. Hacer platos de cirugía usando 60 mm placas de Petri y Sylgard 184 Kit de caucho silicona, siguiendo las instrucciones del fabricante. Llenar los platos no más que medio lleno y deje que se polimeriza. Tienda cubierto a temperatura ambiente.

2. Preparación de Micropipetas

1. Fabrique micropipetas calentando y tirando de pared delgada tubos capilares de borosilicato en u....

Resultados

Para reducir la gravedad de los daños en los tejidos que rodean el sitio de la lesión, biselado adecuado de la micropipeta es crítica. Figura 1A muestra una punta biselada correctamente. Utilizando una punta que es demasiado amplia (Figura 1B) tiende a provocar víctimas más altas debido a la mayor probabilidad de mellar la aorta dorsal, mientras que el dato de que es demasiado estrecha (Figura 1C) tiende a mirar fuera de la piel en lugar de cortar tejido.

Discusión

Cuando se aprende inicialmente esta técnica, se recomienda intentar no más de 50 a 100 transectos en una sola sesión. Después de dominar esta técnica, que son capaces de seccionar hasta 300 embriones por hora; Sin embargo, este nivel de rendimiento requiere de unos meses de práctica semanal. También se recomienda la práctica con un reportero línea y la verificación de la transección completa hasta la incidencia de la transección de la médula espinal incompleta se reduce a menos de 1%.

Transe.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de 60 mm	VWR	82050-544
Placa de Petri de 100 mm	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Fisher Scientific	NC9644388
tubo capilar de borosilicato: diámetro exterior 1,00 mm, diámetro interior 0,78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Pinzas	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Microscopio de disección	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Sulfato de gentamicina	Amresco Inc.	0304-5G	disolver en agua 10 mg/ml, almacenar a -20 & deg; C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Aplicador con punta de algodón, madera, 6 pulgadas	Fisher Scientific	23-400-101
Jeringa de 1 ml	BD	309625
Aguja de 27 G	BD	305109
Alimento para freír	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	tienda a -20 ° C
Extractor de micropipetas	Sutter Instrument Co.	Modelo P-97	Filamento de caja FB330B
20x E2 (1 L); almacenar en RT
17,5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0,75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2,90 g CaCl2· 2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4· 7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); hacer fresco, desechar
0,35 g de NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); almacenar en RT
50 ml 20x E2
2 ml fresco 500x NaCO3