La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Resumen

Después de la transección de la médula, el pez cebra adulto tenga la recuperación funcional a las seis semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas de la transparencia de las larvas y una recuperación más rápida, se presenta un método para seccionar la médula espinal de las larvas. Después de transección, se observa la recuperación sensorial a partir de los 2 días después de la lesión, y el movimiento C-doble por 3 días después de la lesión.

Resumen

Mamíferos fallan en la recuperación sensorial y motora después de una lesión de la médula espinal debido a la falta de regeneración axonal por debajo del nivel de la lesión, así como una incapacidad para reiniciar la neurogénesis médula. Sin embargo, algunos anamniotes incluyendo el pez cebra exposición Danio rerio tanto sensorial y la recuperación funcional, incluso después de la transección completa de la médula espinal. El pez cebra adulto es un organismo modelo establecido para el estudio de la regeneración después de una lesión de la médula espinal, con la recuperación motora y sensitiva a las 6 semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas del análisis in vivo del proceso regenerativo disponible en la larvas de pez cebra transparente, así como herramientas genéticas no son accesibles en el adulto, usamos la larvas de pez cebra para estudiar la regeneración después del corte transversal de la médula espinal. Aquí se demuestra un método para reproducible y verificable transección de la médula espinal de las larvas. Después de transección, nuestros datos muestran principio de recuperación sensorial a los 2 días después de la lesión (ppp), ingenioh del movimiento C-bend detectable por 3 dpi y la reanudación de la natación libre por 5 dpi. Por lo tanto se propone la larvas de pez cebra como una herramienta complementaria para el pez cebra adulto para el estudio de la recuperación después de una lesión de la médula espinal.

Introducción

Mayor trauma en la médula espinal humana a menudo resulta en la parálisis permanente y pérdida de la sensación por debajo del nivel de la lesión, debido a la incapacidad para volver a crecer los axones o reiniciar la neurogénesis ^1,2. A diferencia de los mamíferos, sin embargo, anamniotes incluyendo salamandras y el pez cebra (Danio rerio) muestran recuperación robusta, incluso después de la sección completa de la médula espinal ^3,4.

El pez cebra adultos es un modelo bien establecido para estudiar el proceso de recuperación tras la lesión de la médula espinal ^5-7. Después de la transección completa de la médula espinal, restablecimiento de la función sensorial y la locomotora se observa en el pez cebra adultos por 6 semanas después de la lesión ^8. Con el fin de examinar el proceso de regeneración in vivo, recurrimos a la larvas de pez cebra transparente ^9.

Aquí presentamos un método para seccionar la médula espinal de un 5 días después de la fertilización (dpf) larval usi pez cebrang de una pipeta de microinyección biselado como un bisturí, modificado a partir de Bhatt, et al. ¹⁰ Este método es compatible con alto rendimiento, baja mortalidad, y la reproducibilidad. Con la práctica, 300 larvas / hr puede secciona, y más de 6 meses de cortes transversales, incluyendo más de 3.600 animales, 98,75% ± 0,72% sobrevivió hasta 7 días después de la lesión (dpi). Nuestros datos muestran una rápida recuperación de la locomoción y sensorial, así: al 1 dpi, todos los movimientos de los peces heridos es impulsado por pectoral sólo locomoción aleta. Sin embargo, las larvas comienzan a responder al tungsteno aguja toque caudal a la transección por 2 dpi, restablecer el movimiento C-doble por 3 dpi, y mostrar la natación predatorias de 5 ¹¹ dpi. El uso de la tinción de anticuerpos contra la tubulina acetilada, hemos confirmado que los axones están ausentes en el sitio de la lesión en 1 dpi, pero hemos cruzado el sitio de la lesión por 5 dpi. Creemos que este protocolo proporcionará una técnica valiosa para el estudio de la regeneración axonal y la neurogénesis en la médula espinal después de una lesión.

Protocolo

El pez cebra fueron criados y criados según procedimientos estándar; experimentos fueron aprobados por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Utah.

1. Preparación de las placas Cirugía

1. Hacer platos de cirugía usando 60 mm placas de Petri y Sylgard 184 Kit de caucho silicona, siguiendo las instrucciones del fabricante. Llenar los platos no más que medio lleno y deje que se polimeriza. Tienda cubierto a temperatura ambiente.

2. Preparación de Micropipetas

1. Fabrique micropipetas calentando y tirando de pared delgada tubos capilares de borosilicato en un extractor de micropipeta con la misma configuración para la toma de las agujas de microinyección.
2. Bajo un microscopio de disección, romper la punta de la micropipeta a aproximadamente 200 m de diámetro con pinzas.
3. Bisel borde roto con un microgrinder inicialmente a 35 °, seguido de un segundo biselado a 25 °. Asegúrese de punta está afilada y smooth. Tienda finalizó micropipeta biselada en una placa de Petri en una pequeña cantidad de arcilla.

3. Preparación de Pez cebra larvas

1. 7 días antes de la cirugía, crearon tanques de apareamiento de los peces cebra macho y hembra.
2. Recoger los embriones a la mañana siguiente, 3 horas después de que las luces se encienden para garantizar el máximo rendimiento. Si utiliza una línea reportero transgénicos como Tg (elevl3: eGFP) ^knu3, los embriones fertilizados tipo 100/100 mm de placa en 25 ml de E3 a 28,5 ° C. Si se utiliza de tipo salvaje, especie fertilizado embriones placa 25/100 mm en 25 ml de E3 a 28,5 ° C.
3. Si se utiliza una línea de reportero, cribar embriones para la expresión fluorescente a las 48 HPF. Permitir embriones identificados maduren a una densidad de placa 25/100 mm en 25 ml de E3 a 28,5 ° C.
4. Cuando las larvas son 5 dpf, preparar la placa de la cirugía, cubriendo Sylgard con E2 + 10 mg / L de sulfato de gentamicina (GS) + tricaína.
   1. Preparar el plato de recuperación mediante la adición de 25 ml de E2 + GS a unos 100 mm dis Petrih.
   2. Preparar bisturí grabando juntos tres hisopos. Esto formará una herramienta triangular con tres ranuras.
   3. Montar una micropipeta preparado sobre los hisopos con cinta adhesiva en uno de los surcos.
5. Si vuelve a utilizar micropipetas, enjuague hasta que se aclare con E2 + GS con una jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G antes de montar en hisopos.

4. Cirugía

1. Anestesie 1 plato de larvas en un momento (25 peces) con tricaína. Los peces son suficientemente anestesiado cuando ya no muestran respuesta al toque. Es importante que los peces están completamente anestesiados antes de la cirugía, de lo contrario se contracción cuando el bisturí los toca. La cirugía se realiza bajo un microscopio de disección.
2. Transfiera las larvas a la placa de la cirugía.
   1. Bajo un aumento máximo, girar una larva en un momento de forma que quede en su lado con la espalda lo más cerca de la mano que sostiene el bisturí.
   2. Posición fórceps, para que estén sobre el Sylgard,ángulo recto sobre la anchura de la larva.
   3. Refuerzo El escalpelo de vidrio contra una de las ramas de la pinza, cortado en la cara lateral dorsal de la larva a nivel del poro anal, asegurándose de no cortar más allá del borde ventral de la notocorda. Gire el bisturí para cortar la médula espinal.
   4. Repita con larvas restante.
      Nota: si una larva sangra, no va a recuperarse de la cirugía. Quitarse de inmediato la larva de la placa de la cirugía y practicar la eutanasia a través de la sobredosis tricaína.
3. Una vez que la cirugía en el lote de larvas es completa, la transferencia de los animales lesionado a la placa de recuperación. Esto es para apoyar la limpieza de la anestesia.
   1. Precaución: al recoger larvas heridos para la transferencia, asegúrese de que se recojan ni pies ni cabeza primero: no insistir en la zona de la lesión, doblando las larvas.
      Nota: Todos los dispositivos que se utilizan para la cirugía pueden ser reutilizados, incluyendo las micropipetas.

5. Recuperación

1. Transfer lesionado larvas de la placa de recuperación a placas de 100 mm rellenas con 25 ml de E2 + GS a una densidad de 25/plato. Permitir a recuperarse en una incubadora de 28.5 ° C.
2. Compruebe placas diaria, eliminando los animales enfermos y muertos. No cambie los medios hasta Coleps (protozoos de agua dulce) son visibles en los medios de comunicación. Al cambiar los medios de comunicación, no transfiera el pescado a una nueva placa; en su lugar, eliminar la mayor cantidad posible de medios y la inundación de la misma placa con los nuevos medios. Repita según sea necesario para reducir la población Coleps.
3. Diario de alimento con una pequeña cantidad de freír los alimentos en polvo.
   Nota: El alimento vivo (por ejemplo, los paramecios o rotíferos) no se pueden alimentar a las larvas lesionada hasta después de que se haya recuperado la locomoción. De lo contrario, la comida en vivo será colonizar el lugar de la lesión y matar a las larvas.

Resultados

Para reducir la gravedad de los daños en los tejidos que rodean el sitio de la lesión, biselado adecuado de la micropipeta es crítica. Figura 1A muestra una punta biselada correctamente. Utilizando una punta que es demasiado amplia (Figura 1B) tiende a provocar víctimas más altas debido a la mayor probabilidad de mellar la aorta dorsal, mientras que el dato de que es demasiado estrecha (Figura 1C) tiende a mirar fuera de la piel en lugar de cortar tejido.

Discusión

Cuando se aprende inicialmente esta técnica, se recomienda intentar no más de 50 a 100 transectos en una sola sesión. Después de dominar esta técnica, que son capaces de seccionar hasta 300 embriones por hora; Sin embargo, este nivel de rendimiento requiere de unos meses de práctica semanal. También se recomienda la práctica con un reportero línea y la verificación de la transección completa hasta la incidencia de la transección de la médula espinal incompleta se reduce a menos de 1%.

Transe...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de Petri de 60 mm	VWR	82050-544
Placa de Petri de 100 mm	VWR	89038-968
PDMS, Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Fisher Scientific	NC9644388
tubo capilar de borosilicato: diámetro exterior 1,00 mm, diámetro interior 0,78 mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
Pinzas	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
Microscopio de disección	Nikon	SMZ6454
Microgrinder	Narishige	EG-44
Sulfato de gentamicina	Amresco Inc.	0304-5G	disolver en agua 10 mg/ml, almacenar a -20 & deg; C
Tricaine	Acros Organics	118000100
Aplicador con punta de algodón, madera, 6 pulgadas	Fisher Scientific	23-400-101
Jeringa de 1 ml	BD	309625
Aguja de 27 G	BD	305109
Alimento para freír	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	tienda a -20 ° C
Extractor de micropipetas	Sutter Instrument Co.	Modelo P-97	Filamento de caja FB330B
20x E2 (1 L); almacenar en RT
17,5 g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0,75 g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2,90 g CaCl2· 2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 g MgSO4· 7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10 ml); hacer fresco, desechar
0,35 g de NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1 L); almacenar en RT
50 ml 20x E2
2 ml fresco 500x NaCO3