En la transfección in vivo de ADN desnudo por la entrega de genes hidrodinámico introduce genes en el tejido de un animal con una respuesta inflamatoria mínima. Cantidades suficientes de producto génico se generan de tal manera que la función y regulación, así como la estructura y la función de la proteína del gen pueden ser analizados.
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Artículo de método
Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La expresión eficiente de los transgenes in vivo es de importancia crítica en el estudio de la función génica y el desarrollo de tratamientos para las enfermedades. En los últimos años, la entrega de genes hidrodinámico (DAG) ha emergido como un método sencillo, rápido, seguro y eficaz para la entrega de transgenes en roedores. Esta técnica se basa en la fuerza generada por la inyección rápida de un gran volumen de solución fisiológica para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares de órganos perfundidos y por lo tanto introducir ADN en las células. Una de las principales ventajas de DAG es la capacidad de introducir transgenes en células de mamífero utilizando el ADN plásmido desnudo (pADN). La introducción de un gen exógeno utilizando un plásmido que es mínimamente laborioso, altamente eficiente y, en contra de los transportistas virales, muy segura. DAG se utilizó inicialmente para suministrar genes en ratones, que se utiliza ahora para ofrecer una amplia gama de sustancias, incluyendo oligonucleótidos, cromosomas artificiales, ARN, proteínas y pequeñas moléculas en ratones, ratasy, en un grado limitado, otros animales. Este protocolo describe HGD en ratones y se centra en tres aspectos claves del método que son fundamentales para realizar el procedimiento con éxito: la correcta inserción de la aguja en la vena, el volumen de inyección y la velocidad de entrega. Se dan ejemplos para mostrar la aplicación de este método para la expresión transitoria de dos genes que codifican proteínas secretadas, primates específica, la apolipoproteína LI (apoL-I) y la proteína relacionada con haptoglobina-(HPR).
Introducción
Desde su primera descripción por Liu et al. Y Zhang et al., La entrega de genes hidrodinámico (DAG) se ha convertido en una herramienta muy valiosa para el estudio de la función génica en sistemas de modelos de roedores 1, 2. La técnica consiste en la inyección rápida (5-7 segundos) de un volumen grande (8-12% de peso corporal) de solución en la vena de la cola de los ratones para facilitar la captación de ADN plásmido por las células de órganos diana 1, 2. Estas condiciones conducen a robusto expresión génica en el hígado y menos la expresión de genes en el riñón, bazo, pulmón y corazón.
La inyecci....
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Protocolo
Todos los experimentos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Hunter College Institutional Animal Care y Uso de la City University de Nueva York.
1. Preparación de ADN de plásmido libre de endotoxinas
- Elige una sola colonia de bacterias que contienen el gen de interés en un vector de expresión de mamífero a partir de una placa selectiva recién rayada.
- Siga las recomendaciones que se encuentran en el manual de un kit disponible en el mercado de purificación de plásmido libre de endotoxina para el cultivo y la cosecha de las bacterias.
- Se purifica el plásmido de ADN libre de endotoxina a partir de cé....
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Resultados
La colocación correcta de la aguja en la vena de la cola del ratón (como se ilustra en la Figura 1) es un requisito previo para el éxito la entrega de un transgén por transfección basado hidrodinámica-. A menudo la parte más difícil de la técnica, sin embargo, es la retención de la aguja dentro de la vena de la cola y sin movimiento para que todo el volumen de la inyección puede ser entregado en un plazo de 6-8 s. Los errores menores durante el proceso de inyección pueden resultar en muy reducido la efi.......
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Discusión
Cuando se realiza correctamente, DAG es un medio muy seguro y eficaz de la prestación de los transgenes. Los pasos críticos para el éxito de DAG son: 1) la entrega de la cantidad correcta de ADN en un gran volumen de vehículo de solución salina 2) en la vena de la cola del ratón 3) en menos de 8 segundos.
Aunque el proceso de inyección en sí requiere sin duda alguna destreza manual, el éxito de este seis segundos procedimiento a menudo se encuentra en una cuidadosa preparación del experiment.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Damos las gracias a Liu Xia (Regeneron Pharmaceuticals) para inicialmente nos enseña la técnica de DAG y el Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) por su orientación continua en diversos aspectos de la tecnología. Este trabajo fue financiado por el Hunter College, CUNY puesta en marcha de fondos y adjudicación NSF Pan IOS-1249166. Damos las gracias a la subvención de apoyo NYULMC Histopatología Core NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 para la histología en el hígado del ratón.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Toallita de preparación con alcohol | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimétrico | AAT Bioquest | 13801 | |
| Tubo cónico, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Iluminador de cola de ratón | Braintree Scientific | MTI RST | o equivalente |
| Aguja, 20 Gx 1 (0,9 mm x 25 mm) | BD | 305175 | |
| Aguja, 27 Gx 1/2 (0,9 mm x 25 mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (vector de expresión de mamíferos) | requiere el acuerdo de transferencia de material | de Regeneron Pharmaceuticals | |
| sodio, 0,9% INJ USP 10 ml, Hospira | Jeringa Fisher | NC9054335 | |
| , 3 ml, punta Luer-Lok BD | 309657 | Luer Lock necesaria para soportar la presión de HGD |
Referencias
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocyt....
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Reimpresiones y permisos
