Artículo de método

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior In Situ La hibridación en larvas lamprea de mar

DOI:

10.3791/51494

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14 de octubre de 2014

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1Centre for Neuroregeneration, School of Biomedical Sciences, University of Edinburgh, 2Shriners Hospitals Pediatric Research Center (Center for Neural Repair and Rehabilitation), Temple University School of Medicine, 3Department of Neurology, Temple University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Las lampreas recuperan locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. Sin embargo, algunas neuronas espinales-proyectar regeneradores son buenos y otros no lo son. Este documento ilustra las técnicas de larvas de lamprea de mar vivienda (y adultos recientemente transformadas), la producción de transección completa de la médula espinal y la preparación de los cerebros y las médulas espinales wholemount para la hibridación in situ.

Resumen

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Después de una lesión completa de la médula espinal, las lampreas de mar en primera están paralizados por debajo del nivel de corte transversal. Sin embargo, se recuperan locomoción después de varias semanas, y esto se acompaña de la regeneración corta distancia (unos pocos mm) de los axones propioespinal y axones-espinales que se proyecta desde el tronco cerebral. Entre los 36 grandes neuronas espinales proyectar identificables, algunos son buenos y otros son regeneradores malas regeneradores. Estas neuronas pueden ser más fáciles de identificar en las preparaciones del SNC wholemount. Con el fin de comprender los mecanismos de las neuronas intrínsecas que favorecen o inhiben la regeneración de axones después de la lesión del SNC en los vertebrados, determinamos diferencias en la expresión génica entre los regeneradores buenas y malas, y cómo la expresión es influenciada por transección de la médula espinal. Este documento ilustra las técnicas de larvas vivienda y recientemente transformado lampreas marinas adultas en depósitos de agua potable, la producción de transección medular completa bajo visión microscópica, y la preparación brain y wholemounts médula espinal para la hibridación in situ. En pocas palabras, los animales se mantienen a 16   ° C y anestesiado en el 1% de benzocaína en Ringer lamprea. La médula espinal se secciona con tijeras de iridectomía a través de un enfoque dorsal y se permite que el animal pueda recuperarse en depósitos de agua potable a 23 ° C. Para la hibridación in situ, los animales se reanesthetized y el cerebro y el cordón removidos a través de un enfoque dorsal.

Introducción

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En los mamíferos lesión de la médula espinal (SCI) es una enfermedad devastadora que conduce a la pérdida permanente de la función por debajo del sitio de la lesión, porque los axones lesionados no se regeneran a través de la zona de trauma y se vuelven a conectar a sus objetivos adecuados. En contraste con los mamíferos, lampreas recuperar la locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. 1 Curiosamente, lampreas tienen un conjunto de 36 neuronas de la médula espinal que se proyecta que son individualmente identificable en todo el montaje preparaciones cerebrales debido a su gran tamaño 2,3 (Figura 1) . Todas e....

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Protocolo

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Ver Tabla 1 para todos los materiales utilizados en este protocolo.

Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Temple.

1. Animales

  1. Obtener wildtype lampreas marinas larvales (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm de largo (4-7 años) de los arroyos que alimentan el lago Michigan, a partir de afluentes del río Delaware (Pennsylvania) o arroyos en Maine.
  2. En el laboratorio, las larvas de mantener en grupos de 50 a 100 animales en tanques de agua dulce de 50 galones a 16 ° C. Línea de los tanques con una....

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Resultados

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Como ejemplo de los resultados que se pueden obtener cuando se utiliza este método, las imágenes representativas de cerebros wholemounted que muestran la expresión de las transcripciones neogenin en neuronas de la médula espinal identificables de proyección del control y 2 semanas después de la lesión de larvas lampreas de mar se muestran en la Figura 2. Los lectores pueden consultar a un estudio previo 6 informar de la relación entre la expresión de neogenin después de una transección comple.......

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Discusión

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Aquí presentamos un protocolo detallado para realizar un corte transversal de la médula espinal completa y la disección del cerebro posterior en las lampreas marinas larvales. Este procedimiento permite analizar las diferencias en la expresión génica entre identificable de la médula espinal que se proyectan neuronas después de la lesión de la médula espinal por medio de un cerebro todo el montaje hibridación in situ. El paso crítico en el procedimiento es el correcto funcionamiento de una transección completa de la médu.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Apoyado por las subvenciones de los NIH NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 al Dr. Michael E. Selzer; Subvención de investigación Shriners SHC-85220 al Dr. Michael E. Selzer; y la Subvención de Investigación Shriners SHC-85310 al Dr. Michael I. Shifman. El Dr. Antón Barreiro-Iglesias contó con el apoyo de la Fundación Barrié (España) y la Xunta de Galicia (Galicia, España).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sulonato de metano tricaínaSpectrumTR108Solución saturada de benzocaína en PBS para sacrificio
Bisturí #3Fine Science Tools (FST)10003-12
Cuchillas para bisturí: #11Fine Science Tools 10011-00
Tijeras Castroviejo #8Herramientas de Ciencia Fina 15002-08
Pinzas #4 & #5Dumont, SuizaRoboz RS4955#4 para la disección de la médula espinal; #5 para la extirpación de meninges
Microscopio de disecciónOlympusSZ51
SylgardDow Corning Co.184
Pasadores para insectos 0,15, 0,20 mmAusterlitzSin catálogo #0,15 mm para sujetar el cerebro y la médula espinal; 0,20 mm para el cuerpo
7 ml Tubos de centelleo de PEAD con tapasFisher Scientific03-337-1
Paraformaldehído 16%Electrónica Microscopy Science (EMS)19210Diluido al 4% en PBS

Referencias

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  1. Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury. Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).
  2. Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. Extent and time course of restoration of descending br....

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Transecci n de la m dula espinallarvas de lamprea marinaestudio de regeneraci n axonalexpresi n del receptor Neogent cnica de tijeras de iridectom amontaje con pines de siliconafijaci n con paraformaldeh doabordaje de la l nea media dorsal

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