Analizando el movimiento de la Nauplio &#39;<em&gt; Artemia salina</em&gt; &#39;Por Optical Tracking de plasmónicas nanopartículas

Resumen

Utilizamos el seguimiento óptico de nanopartículas plasmónica para investigar y caracterizar los movimientos de frecuencia de los organismos acuáticos.

Resumen

Se demuestra cómo pinzas ópticas pueden proporcionar una herramienta sensible para analizar las vibraciones de fluidos generados por el movimiento de pequeños organismos acuáticos. Una sola nanopartícula de oro en poder de un pinzas ópticas se utiliza como un sensor para cuantificar el movimiento rítmico de una larva nauplio (Artemia salina) en una muestra de agua. Esto se consigue mediante el control de desplazamiento dependiente del tiempo de la nanopartícula atrapados como consecuencia de la actividad Nauplio. Un análisis de Fourier de la posición de la nanopartícula a continuación, se obtiene un espectro de frecuencias que es característica para el movimiento de las especies observadas. Este experimento demuestra la capacidad de este método para medir y caracterizar la actividad de pequeña larvas acuáticas sin el requisito para observar directamente y para obtener información acerca de la posición de las larvas con respecto a la partícula atrapada. En general, este enfoque podría dar una idea de la vitalidad de ciertas especies que se encuentran en un acuático ecosystem y podría ampliar la gama de métodos convencionales para el análisis de muestras de agua.

Introducción

Evaluación de la calidad del agua sobre la base de indicadores químicos y biológicos es fundamental para obtener una perspectiva de las condiciones estatales y ambientales de un ecosistema acuático ^1-3. Los métodos clásicos para el análisis químico de agua se basan en las propiedades organolépticas o la determinación de los parámetros fisicoquímicos. Los indicadores biológicos, por otro lado, son las especies animales cuya presencia y viabilidad dar una idea de las condiciones ambientales y el efecto de los contaminantes de un ecosistema que se producen pulg ejemplos típicos de bioindicadores son copépodos, un grupo de pequeños crustáceos de agua, que puede pueden encontrar en casi cualquier hábitat de agua ^4,5. La observación de la actividad y la viabilidad de estas especies a partir de una muestra de agua de este modo se puede utilizar para obtener información sobre las condiciones generales de un ecosistema ^5. Las larvas de copépodos, que son llamadas nauplios, utilice golpes rítmicos de sus antenas (cada larva tiene tres pares de appendabios en su región de la cabeza) para nadar en el agua ^6. La frecuencia y la intensidad de estos golpes es por lo tanto un indicador directo de la edad, condición física y las condiciones ambientales del animal ^7-10. Cualquier investigación sobre estos especímenes se hacen generalmente con un microscopio observando y contando los golpes de antena del Nauplii directamente. Debido a su tamaño (~ 100-500 m) ^11, esto a menudo requiere hacer mediciones, ya sea uno a uno o de fijar una sola Nauplio a un sustrato.

Aquí, nos demuestran un nuevo enfoque para observar la actividad de las larvas de copépodos en muestras de agua mediante el uso de una nanopartícula de oro atrapada ópticamente como detector ultrasensible. Las pinzas ópticas suelen ser utilizados por muchos grupos como una herramienta experimental bien aplicar o medir fuerzas entre las moléculas hasta el rango picoNewton ^12-14. Más recientemente, la gama de aplicaciones para las pinzas ópticas se ha ampliado para observar las vibraciones acústicas y resolverfluctuaciones nt en medios líquidos mediante el control del movimiento de las nano-y micropartículas que están confinados en una trampa óptica ^15. Las partículas que están inmersas en un líquido se someten a movimiento browniano. Dentro de una trampa óptica, sin embargo, este movimiento está parcialmente amortiguado por una, inducida por láser, fuerza del gradiente fuerte. Por lo tanto, la rigidez de la trampa óptica y la localización de la partícula dentro del foco del haz de láser pueden ajustarse por la potencia del láser. Al mismo tiempo, es posible revelar características sobre el potencial de atrapamiento y para analizar las interacciones de moléculas con la partícula mediante el control de la movimiento de las partículas en función del tiempo en la trampa. Este enfoque hace posible recoger la frecuencia, la intensidad y la dirección del movimiento de fluido que es generada por un objeto en movimiento en su entorno líquido. Se demuestra cómo esta idea general se puede aplicar para obtener un espectro de frecuencia de movimiento de un nauplio individuo sin el requisitopara interferir directamente con la muestra. Este enfoque experimental introduce un nuevo concepto general para la observación del comportamiento de la movilidad de los especímenes acuáticos de una manera muy sensible. Para las observaciones sobre las especies bioindicadores, esto podría ampliar la actual metodología para el análisis de agua y podría ser aplicado para obtener información sobre la salud y la integridad de los ecosistemas acuáticos.

Protocolo

1. Configuración Experimental

1. Utilice un microscopio-encima de la derecha y un condensador de campo oscuro de aceite con una apertura numérica (NA) = 1,2 para la iluminación de campo oscuro. Utilice un objetivo de inmersión en agua con un aumento de 100X y un NA = 1,0 para las observaciones de partículas y atrapamiento. Utilice un objetivo de aire con un aumento de 10X y una NA = 0,2 para seguir el movimiento de la Nauplio.
2. Utilice una configuración de pinzas ópticas con una nm láser de onda continua 1064 acoplada al microscopio-encima de la derecha. Establecer la potencia del láser de la trampa óptica a 100 mW (medido con un medidor de potencia después de que el objetivo).
3. Utilice una cámara CMOS de alta velocidad o una réflex digital de lente única (DSLR) para detectar e imagen del movimiento de las partículas de oro en la trampa óptica y el movimiento de la Nauplio.
4. Utilice un filtro de muesca para impedir que el láser entra en la cámara.
5. Utilice un medidor de potencia para medir la potencia del láser después de que el objetivo.

2. Preparación de la muestra

1. Pipetear una gota de agua (180 l) en un portaobjetos de vidrio de microscopio y la posición de la muestra en el microscopio de campo oscuro.
2. Pipetear una Nauplio de un pequeño tanque de agua a la gota de agua.
3. Utilice un objetivo de aire 10 veces para observar el movimiento de la Nauplio en la solución y grabar una secuencia de vídeo.
4. Utilice una nanopartícula de oro con un diámetro de 60 nm como un detector para observar el movimiento del fluido generada por el nauplio. Por lo tanto, añadir 5 l de una solución de partículas altamente diluido en la gota de agua, de manera que aproximadamente una partícula se puede ver en el campo de visión con un objetivo de inmersión en agua 100X.

3. Experimento de seguimiento de partículas

1. Trampa una nanopartícula de oro con las pinzas ópticas. Por lo tanto, llevar el 1,064 nm láser atrapando cerca de una nanopartícula de oro que se difunde en solución moviendo la platina del microscopio. Las fuerzas ópticas atractivas tiran de la nanopartícula de oro hacia el punto focal de thhaz de láser de correo. La partícula atrapada no se difunde más y más bien mantiene su posición. Tome una secuencia de vídeo de la nanopartícula atrapado con la cámara réflex digital a una velocidad de 50 Hz durante 30 s.
2. Apague el láser de la pinza óptica y suelte la nanopartícula de oro de la trampa.
3. Utilice un programa de rastreo de partículas a Lectura de la posición de la partícula de oro atrapada ópticamente en cada fotograma de la secuencia de vídeo. Una transformación rápida de Fourier (FFT) de xy-posición de la partícula en el tiempo revela un espectro de frecuencia.
   NOTA: En este caso, se ha utilizado un código de programa informático 'IGOR PRO' auto-escrito para analizar la posición del centro de partícula en el plano xy con el tiempo y para el análisis FFT.
4. Como alternativa a un código IGOR auto-escrita utilizar el programa de libre acceso 'Video SPOT Rastreador' para el seguimiento de la partícula en el video. Utilice el software comercial "Origen" para llevar a cabo la transformación de Fourier de los datos de seguimiento:
   1. Arrastre el archivo de vídeo en el programa abierto 'Video SPOT Rastreador'.
   2. Pulse con el ratón sobre la partícula se ve en la primera imagen de la secuencia de vídeo y una región circular de que aparezca de interés.
   3. Elija "simétrico" y "optimizar" en la ventana de comandos superior para optimizar el seguimiento de la partícula.
   4. Clic del ratón "tala" en la ventana de comandos superior y seleccione una carpeta para guardar los datos. Los datos de seguimiento se guardarán como una hoja de cálculo de datos.
   5. Clic del ratón "juego de video" en la ventana de comandos izquierda del programa de seguimiento y espere hasta que se analizan todos los fotogramas del vídeo.
   6. Cierra el programa y abrir la hoja de cálculo de datos guardado con 'Origen'. Establezca los valores de columna como "y _1" e "y _2".
   7. Establecer intervalos de tiempo para cada fotograma de vídeo como "x" en la hoja de cálculo de datos 'Origen'.
   8. Marque la x-Posición de la columna y realizar una FFT eligiendo "Análisis de datos" y "FFT" en la ventana de comandos de arriba. Repetir el paso de la columna de la posición y.
   9. Trazar las amplitudes de la señal FFT calculada en x-e y-dirección frente a la frecuencia.

4. Simulación

1. Calcular los α polarizabilidad de la partícula de oro de 60 nm mediante el uso del programa de ordenador 'Mathematica'.
   1. Utilizar la ecuación (1) para calcular la polarizabilidad de acuerdo con Kuwata et al ^16.:
      (1)
   2. Definir los tres parámetros siguientes en el código de programa: el complejo de función dieléctrica dependiente de la longitud de onda de la partícula de oro, el radio de nanopartículas, y el índice de refracción del medio circundante.
2. Utilizar la descripción de los elecdistribución del campo tric de un haz gaussiano centrado según Agayan et al ¹⁷ para el cálculo de las fuerzas ópticas que actúan sobre una partícula de oro de 60 nm.:
   (2)
   1. . Usar ecuaciones (3) - (6) de Agayan et al ¹⁷ para calcular tanto, el gradiente y la dispersión de las fuerzas que actúan sobre la partícula:
      (3)
      (4)
      (5)
      (6)
   2. En el código del programa, definir los parámetros para la potencia del láser, la apertura numérica de la OBJETIVO, y el complejo polarizabilidad de la nanopartícula.
   3. Sumar la fuerza del gradiente y la fuerza de dispersión para calcular la fuerza óptica total que actúa sobre la partícula de oro en una trampa óptica.
3. Ejecutar la simulación pulsando simultáneamente "Control" y "Enter".

Resultados

Una ilustración esquemática de la configuración experimental se muestra en la Figura 1A. Una configuración de campo oscuro es necesario detectar ópticamente el desplazamiento de una partícula de oro de 60 nm en una trampa óptica ^15. La longitud de onda de 1064 nm para el láser de captura se elige para garantizar un confinamiento estable del detector de ^12,14 partícula de oro. Un divisor de haz en el microscopio se utiliza para enfocar el haz de captura a través de la objetivo y un ...

Discusión

Microscopía de campo oscuro es una poderosa herramienta para la visualización de las nanopartículas de oro con dimensiones por debajo del límite de difracción óptica, puesto que la sección transversal de dispersión de las nanopartículas de metal excede su sección transversal geométrica (cp. Figura 2A) ^18. En una configuración de pinza, este enfoque permite incluso distinguir si sólo un único o múltiples nanopartículas de oro son atrapados por el haz de láser porque acoplamiento plasmónica ent...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio Zeiss Axio Scope.A1	Carl Zeiss	490035-0012-000 iluminación de	campo oscuro Objetivo
agua Achroplan	Carl Zeiss	440087	aumento de 100X, NA = 1,0
Objetivo de aire Epiplan	Carl Zeiss	442934	aumento de 10X, NA = 0,2
Condensador de petróleo de campo oscuro	Carl Zeiss	445323	NA = 1,2
Cobolt Rumba CW 1.064 nm DPSSL	Cobolt	1064-05-01-2000-500	1.064 nm, CW, λ = 1.064 nm, 2 vatios, TEM00
Expansor de haz	Edmund Optics		Nº de pieza 1064 2-8X 64414
Cámara de alta velocidad Dimax HD	PCO. Alemania
Cámara a color Canon EOS 500 D	Canon		FAQ-ID: 8201395700
Filtro de muesca StopLine 532/1064	Semrock	A11149-711265	Nº de pieza NF01-532U
Agua
Nauplio Artemia salina
Coloide de oro	BBInternational	Batch 13741	Diámetro 60 nm
MQMie versión 3.2	Dr. Michael Quinten
Mathematica 8.0	Wolfram
Comsol Multiphysics 4.0	COMSOL, Inc.

de