La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Resumen

La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.

Resumen

Los estudios realizados en Drosophila melanogaster embriones y larvas proporcionan información fundamental en los procesos de desarrollo, tales como la especificación del destino celular y la organogénesis. La inmunotinción permite la visualización de desarrollo de tejidos y órganos. Sin embargo, una cutícula protectora que se forma en el extremo de la embriogénesis impide la penetración de los anticuerpos en embriones de fase tardía y las larvas. Mientras que la disección antes de la inmunotinción se utiliza regularmente para analizar los tejidos larvarios Drosophila, resulta ineficaz para algunos análisis porque los tejidos pequeños pueden ser difíciles de localizar y aislar. La sonicación proporciona una alternativa a la disección en los protocolos de inmunotinción Drosophila larval. Permite la rápida tramitación y simultánea de un gran número de embriones en etapa tardía y larvas y mantiene en la morfología situ. Después de la fijación en formaldehído, se sometió a ultrasonidos una muestra. Muestra a continuación, se somete a inmunotinción con la hormiga primaria específica de antígenoibodies y secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia para visualizar los tipos de células diana y proteínas específicas mediante microscopía de fluorescencia. Durante el proceso de sonicación, la colocación apropiada de una sonda de sonicación encima de la muestra, así como la duración y la intensidad de la sonicación, es crítico. Modificaciones menores Adicionales a los protocolos de inmunotinción estándar pueden ser necesarios para las manchas de alta calidad. Para los anticuerpos con baja relación señal a ruido, los tiempos de incubación más largos son típicamente necesario. Como una prueba de concepto para este protocolo de tratamiento con ultrasonidos-facilitado, mostramos inmunotinciones de tres tipos de tejidos (testículos, los ovarios y los tejidos neuronales) en una serie de etapas de desarrollo.

Introducción

Embriones y larvas de Drosophila proporcionan un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo en muchos órganos y tejidos. Obtención de imágenes de células individuales es a menudo necesario en estos estudios a fin de determinar los entornos complejos en los que se desarrollan las células. Visualización de las células en los tejidos se puede lograr mediante inmunotinción. Bueno-describen inmunotinción existen protocolos para tejidos embrionarios de Drosophila <17 h después de la puesta de huevos (AEL) ^1-3. Sin embargo, una protección formas cutícula hacia el final de la embriogénesis, la prevención de la permeación de anticue....

Protocolo

1 Preparación de una jaula de Colección

1. Anestesiar jóvenes, moscas fértiles con CO _2. Transferencia moscas anestesiados a una jaula. Para obtener un rendimiento óptimo, utilice 100-120 moscas adultas que van de 2-7 días de edad en una proporción de 4: 1 de mujeres a hombres. Permitir moscas un período de aclimatación apropiada, ~ 24 horas antes de la obtención de la muestra para la fijación. Si la jaula se creó con hembras vírgenes se aparearon con machos, un uso un 36 - periodo de aclimatación de 48 horas.
2. En el extremo libre de la jaula, coloque una placa de agar de zumo de manzana preparado previamente con una gota tamaño de una mon....

Resultados

Para demostrar la eficacia de la inmunotinción a base de ultrasonidos en el análisis de embriones en etapa tardía y tejidos larvarios in situ, de tipo salvaje embriones y larvas fueron procesadas para la inmunotinción de los testículos, los ovarios, y el tejido neural. Las muestras se obtuvieron imágenes a través de microscopía confocal y los resultados representativos se muestran (Figura 1 y Figura 2). Los resultados revelan que el protocolo descrito es eficaz para la visualiz.......

Discusión

Este protocolo proporciona un método para dirigir con éxito inmunotinción Drosophila embrionario y en los tejidos de las larvas in situ, eliminando así la necesidad de disección. Según los protocolos anteriores para la tinción de embriones tempranos ^1,2,3, la membrana coriónica se elimina usando 50% de lejía (NaOCl). Las muestras se fijaron en formaldehído y metanol. Debido a la cutícula de las larvas causa de muestra mayores a flotar, toda la muestra se hace pasar luego a través de un colad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tabla 1: Reactivos y tampones
Tampón de fosfato Triton X-100 (PBTx)			Para 5 L: 500 ml PBS 10X, 4,45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Tienda en RT.
Tampón de fosfato salino 10X (PBS 10X)			Para 1 L en dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Agregue componentes y rellene hasta el volumen adecuado. Almacenar a 4 °C.
Triton 10%			Para 50 ml: 5 ml de Triton, 5 ml de PBS 10X, 45 ml de ddH2O. Roca para mezclar. Tienda en RT.
Tubos PEMS			0,1 m (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Tienda en RT.
Tubos			Para una solución de 400 ml de 0,25 M (pH 6,9): 30,24 g Tubos dH20 NaOH. Disuelva las tuberías en 300 ml de dH2O y luego ajuste a pH 6.9 con NaOH. Lleve el volumen total a 400 ml con dH2O y autoclave. Tienda en RT.
Formaldehído			37% de formaldehído en peso en metanol. Almacene la mezcla de residuos de formaldehído, heptano y metanol en un recipiente herméticamente cerrado en la campana extractora antes de desecharla según las pautas institucionales.
Heptano		CAS 142-82-5	n-Heptano. Almacene la mezcla de residuos de formaldehído, heptano y metanol en un recipiente herméticamente cerrado en la campana extractora antes de desecharla según las pautas institucionales.
Metanol		CAS 67-56-1	Almacene en RT. Almacene la mezcla de residuos de formaldehído, heptano y metanol en un recipiente herméticamente cerrado en la campana extractora antes de desecharla según las pautas institucionales.
Tampón de fosfato Tween (PBTw)			Para hacer 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filtre la esterilización después de agregar todos los componentes. Almacenar a 4 °C.
Tween 10%			Para 50 ml: 5 ml de Tween, 5 ml de PBS 10X, 40 ml de ddH2O. Rock para mezclar. Tienda en RT.
Tampón de albúmina/fosfato en suero bovino Tween (BBTw)			Para hacer 1 L: 100 ml de PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g de albúmina sérica bovina (BSA). Agregue BSA y luego esterilice usando un 0.2 μ m Unidad de filtro de vacío. Almacenar a 4 °C.
Suero normal de cabra (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	Para hacer 10 ml: Suero normal de cabra 10 ml ddH2O. Añadir ddH2O al vial de NGS y esterilizar con un 0,2 μ M Syrninge Filter. Almacene las alícuotas a -20 °C.
1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO)		CAS: 281-57-9	Para hacer 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g de DABCO sólido, 3,5 ml 6N HCl, 250 μ l 10N NaOH, 70 ml de glicerol. En un vaso de precipitados de 250 ml con barra agitadora, añada ddH2O, Tris HCl y DABCO. Revuelva y luego agregue 6N HCl, 10 N NaOH y glicerol. A continuación, añada 10N NaOH gota a gota hasta que la solución alcance un pH de 7,5. Alícuota. Almacene las alícuotas a -20 °C.
DABCO + solución de p-fenilendiamina (PPD)			1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). Disuelva PPD en una solución de NaHCO3 y NaCO3. Agregue 60 μ l de solución de PPD a 500 μ l de DABCO. Almacene las alícuotas a -20 °C.
Platos de jugo de manzana			jugo de manzana (comprado en la tienda), 15 ml de Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2< / sub>O. Agregue agar a ddH2O en un matraz de 4 L y luego autoclave durante 30 min. Mezcle el jugo de manzana y el azúcar en una placa para remover caliente. Agregue gradualmente la mezcla de jugo de manzana al agar esterilizado en autoclave. Mezcle en una placa de agitación calentada, luego alícuota volúmenes de 10 ml en placas de Petri de 35 mm y deje reposar a RT para que se solidifique. Almacenar a 4 °C.
Tegosept 10%			Para hacer 100 ml: 10 g de Tegosept, 100 ml de etanol. Almacene las alícuotas a -20 °C.
Pasta			~ 50 g de levadura activa seca. Agregue gradualmente ddH2O al vaso de precipitados que contenga levadura mientras revuelve hasta obtener una consistencia pastosa. Almacenar a 4 °C.
Tabla 2: Materiales de tinción
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock a 5 mg/ml.
Conejo anti-Vasa			1:250, regalo de Ruth Lehmann.
del Desarrollo de Ratones anti-Factina III	(DSHB)	7G10	1:10
Ratones anti-1B1	(DSHB)	1B1	1:4
Cerdo Guniea anti-Traffic Jam			1:2500, un regalo de Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Ratón anti-Prospero	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB)	7EBA10	1:30
anti-Repo	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas (DSHB)	8D12	1:10
Cabra anti-conejo Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Cabra anti-ratón Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Cerdo anti-guniea de cabra Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Cabra anti-rata Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Tabla 3: Materiales y equipos
Jaulas de moscas	hechas a mano; Genesee Scientific Corporation	No aplicable; botellas: 32-130; Jaula prefabricada: 59-101	Hecha cortando tubos acrílicos fundidos transparentes (1 3/4 pulgadas de diámetro) en segmentos de 4 pulgadas de alto con una sierra ingletadora compuesta a 400 rpm. Pantalla ultrafina de acero inoxidable (se fijó a un extremo de la bañera con pegamento acrílico compuesto. Un método alternativo que utiliza una botella vacía de comida para moscas se puede encontrar en Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Las jaulas también se pueden comprar en Genesee Scientific Corporation.
Sonificador: Sonificador digital Branson 250	Branson	: Sonificador digital Branson 250
Sonda Sonicada	Branson	Modelo #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Filtro de jeringa	Nalgene	190-25-20	0.2 μ m celulosa, filtro de membrana de acetato
Sistema de imagen: Microscopio confocal de disco giratorio con fuente de luz multicromática, cámara CCD digital y software de imagen	Microscopio: Olympus, Fuente de luz: Lumen Dynamics, Cámara: Q-Imaging, Software de imagen: Intelligent Imaging Inc.		Microscopio: BX51 equipado con disco giratorio DSU, Fuente de luz: X-Cite 120Q, Cámara: RETIGA-SRV, Software de imagen: Slidebook 5.0
Unidad de filtro de vacío	Nalgene	450-0020	0.2 μ M Filtro de membrana de nitrato de celulosa

Para hacer ~ 200 platos: 45 g de agar (CAS # 9002-18-0), 45 g de azúcar granulada (comprado en la tienda), 500 ml de de levadura Banco de Hibridomas de Estudios Banco de Estudios de Desarrollo de ratón Modelo