Artículo de método

Evaluar Aportes específicos de la especie para el desarrollo craneofacial Utilizando quimeras Quail-pato

DOI:

10.3791/51534

⸱

31 de mayo de 2014

 , 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California at San Francisco

En este artículo

Resumen

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En este artículo se describe un método para generar embriones quiméricos que están diseñados para poner a prueba las contribuciones específicas de las especies de la cresta neural y / u otros tejidos para el desarrollo craneofacial.

Resumen

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La generación de embriones quiméricos es un enfoque amplio y de gran alcance para el estudio de células destinos, las interacciones de tejidos y especies específicas contribuciones al histológico y el desarrollo morfológico de los embriones de vertebrados. En particular, el uso de embriones quiméricos ha establecido la importancia de la cresta neural en la dirección de la morfología específica de la especie del complejo craneofacial. El método descrito en este documento utiliza dos especies de aves, pato y codorniz, con notable diferente morfología craneofacial. Este método facilita en gran medida la investigación de la regulación molecular y celular del patrón específico de la especie en el complejo craneofacial. Los experimentos en embriones de codorniz y pato quiméricos ya han puesto de manifiesto las interacciones de tejido de la cresta neural mediada y comportamientos células autónomas que regulan el patrón específico de la especie en el esqueleto craneofacial, musculatura, y tegumento. La gran diversidad de derivados de la cresta neural sugiere un potencial significativopara futuras aplicaciones de la codorniz-duck sistema quimérico para entender el desarrollo de vertebrados, la enfermedad y la evolución.

Introducción

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El esqueleto facial se desarrolla a partir del crecimiento y fusión de múltiples procesos faciales que se componen de la cresta neural y el mesénquima mesodérmico rodeado por ectodérmico y endodérmico 1-11 capas epiteliales. Eventos morfogenéticos dentro de cada proceso se rigen por las interacciones de señalización claras entre el mesénquima y el epitelio que rodean 12-16. Las alteraciones en estas interacciones de señalización y / o de sus efectores contribuyen a fenotipos de la enfermedad y también pueden ser relevantes para la evolución del esqueleto craneofacial 17, 18. Por lo tanto, dilucidar el momento y la naturaleza de las interacciones de tejidos tiene un gran potencial para aumentar nuestra comprensión de la biología del desarrollo y la evolución del esqueleto facial.

El uso de embriones quiméricos para investigar las interacciones de tejidos tiene una larga historia en la biología del desarrollo. Este enfoque fue iniciado por Hans Spemann y su laboratorioquien descubrió embrionarias "organizadores" mediante el trasplante de tejidos entre los embriones de diferentes especies de anfibios. Spemann fue un maestro de las técnicas micro-quirúrgicas cuya mano-skills se complementa con su desarrollo de herramientas especializadas, en particular la pipeta Spemann. Viktor hamburguesa era un estudiante graduado en el laboratorio de Hans Spemann en Friburgo durante la década de 1920, que es cuando se llevaron a cabo los experimentos de trasplante originales que llevaron al Premio Nobel de Spemann. Cuando la hamburguesa se ​​trasladó a la Universidad de Washington en St. Louis en 1935, detalló el proceso de hacer una micropipeta Spemann en su Manual de Embriología Experimental 19. Dibujó Noden era un estudiante graduado en el laboratorio de la hamburguesa en la Universidad de Washington hasta 1972. Después de trasladarse a la Universidad de Massachusetts, Amherst y luego a la Universidad de Cornell, Noden continuó la fabricación y el uso de micropipetas Spemann por sus trasplantes quirúrgicos que implican quimeras de codorniz-pollo. Y# 160;. Mientras que un estudiante de posgrado, uno de los autores (Rich Schneider) capacitados con dibujó Noden en Cornell 1995-1998 El siguiente protocolo para la toma de una micropipeta Spemann se basa en descripciones escritas por la hamburguesa y Noden, e incluye modificaciones posteriores efectuadas por Schneider.

El uso de quimeras de codorniz-chick para el estudio del desarrollo craneofacial y, especialmente, para la comprensión de la contribución de las células de la cresta neural fue iniciado por Noden y por Le Douarin a principios de 1970, revisado en Le Douarin et al 20. Este enfoque ha sido ampliamente adoptado en muchos estudios y por numerosos otros investigadores 1, 4, 5, 21-38. Las tasas equivalentes de crecimiento y morfología de codorniz y pollo hacen trasplantes dentro de ellas ideales para el estudio del destino de la célula y el rastreo de linaje. Sin embargo, debido a las similitudes entre la codorniz y de pollo, cambios morfológicos indUCED por las células del donante son difíciles de descifrar. Por el contrario, otros sistemas quiméricos aviar han incluido pato doméstico como una forma de estudiar los mecanismos que hacen que los embriones anatómicamente distinto 39-50. Más específicamente, el sistema quimérico codorniz-duck ofrece múltiples beneficios para discernir los efectos del donante en el host, y viceversa. En primer lugar, codorniz y pato embriones son diferentes en tamaño y forma del cuerpo, lo que proporciona una forma directa para explorar por donantes o mecanismos de acogida específicos de la formación de patrones ensayando dominios diferenciales de la expresión de genes (Figuras 1 A y B). En segundo lugar, codorniz y pato embriones tienen considerablemente diferentes ritmos de maduración, con la codorniz de incubación en 17 días y el pato de la eclosión en 28 días. Cresta neural trasplantado mantiene su tasa de maduración intrínseca dentro del entorno de acogida, y por lo tanto, es posible la identificación de los cambios temporales en la expresión génica, interacciones tisulares, histogénesis, y la morfogénesis51-57. Finalmente, el anticuerpo anti-nucleares de codorniz (Q ¢ PN) permite donantes y beneficiarios contribuciones celulares estar permanentemente distinguen entre sí mediante el reconocimiento de una proteína que se expresa de forma ubicua en las células de codorniz, pero ausente en las células de pato.

Protocolo

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1. Preparar tungsteno Agujas

  1. Cortar una varilla de tungsteno en el medio usando cortadores de alambre para que la varilla no se dobla.
  2. Enrosque la varilla a través del extremo afilado de un pipeta Pasteur de 5 3/4 en vidrio de borosilicato.
  3. Dejar aproximadamente 3/4 en la adherencia vara del vidrio, adherir la varilla a la punta de la pipeta con una pequeña capa de "adhesivo de fusión en caliente" (HMA), que es la barra de pegamento utilizado para una pistola de pegamento. La HMA debe fundirse rápidamente en una llama de alcohol, teniendo cuidado de no quemar el pegamento y generar humo negro.
  4. El uso de un par de fórceps, doblar la punta de la varilla de tungsteno (aproximadamente 1/4 desde el extremo superior) hasta que se alcanza un ángulo de 45 °.
  5. Sujetando la pipeta Pasteur, colocar 1/8 en la punta de la varilla de tungsteno en la llama de un soplete de propano. Mantenga la punta constante y exactamente perpendicular a la llama.
  6. Retire la aguja de la llama en el momento de una pequeña mancha de color naranja de tungsdiez moscas fuera de la aguja.

2. Preparar Spemann Pipetas

  1. El uso de un mechero Bunsen, calentar el extremo estrecho de una pipeta Pasteur hasta que el vidrio poco más allá de la forma cónica comienza a derretirse. Retire del fuego y tirar de la punta hasta que se sella la pipeta. Asegúrese de que queda una porción de la parte ahusada que tiene un diámetro exterior de aproximadamente 0,7-1,0 mm. Romper el extremo sellado a cerca de 4 cm de la puesta a punto.
  2. Fije unos 2 pies (60 cm) de tubo de goma al extremo ancho (abierta) de la pipeta. Blow en el otro extremo del tubo de goma para asegurar que el aire no puede pasar a través de la parte cónica de la pipeta Pasteur.
  3. El uso de un cilindro de combustible de propano con una antorcha de llama lápiz adjunta, calentar un área ovalada en un lado de la pipeta justo por debajo del inicio de la conicidad. Soplar aire muy suavemente y constantemente a través del tubo de goma con una ligera cantidad de presión (aproximadamente la cantidad de presión necesaria para decir el comienzo de la Letter "P" a nivel de conversación). Cuando el vidrio se ablanda en un lado y comienza a doblarse hacia afuera, eliminar rápidamente la pipeta de la llama y soplar fuerte y constante a través del tubo de goma. Esto hará que la parte calentada del vidrio para formar una burbuja en forma de salchicha que pueden aparecer, la cual está muy bien. Si la burbuja es demasiado pequeño, trate de fusión y soplando el vidrio de nuevo. La ventana abierta final en el cristal debe estar alrededor de 0,25 in (6,35 mm) de ancho por 0,5 pulgadas (12,7 mm) de largo.
  4. Señalando el extremo cónico hacia arriba, raspar la burbuja en un recipiente de residuos de vidrio, mientras que sopla suavemente a través de la tubería para evitar que fragmentos de vidrio de entrar en la pipeta.
  5. Uso de la llama de propano, quemar los bordes restantes de la burbuja y de fuego-pula los lados de la ventana abierta. Tenga cuidado de no derretir el eje de la pipeta.
  6. Con un lápiz con punta de diamante, anotar el extremo cónico de la pipeta aproximadamente 1.25 in (30 mm) de la ventana y rompa la puntacon pinzas de manera que la abertura de la pipeta se corta limpiamente (pipetas de descarte con puntas rotas o irregulares).
  7. El uso de pinzas y el borde de una llama de un mechero de alcohol, doblar la parte estrecha de la pipeta en 0.375 (9,5 mm) de la punta a un ángulo de aproximadamente 60 ° de modo que la parte doblada es en un plano vertical cuando la abertura de la ventana está en la posición 1:00 para el uso diestro y 11:00 para el uso de la mano izquierda. Este paso se lleva a cabo mejor en un recinto sin corrientes de aire.
  8. Fuego-pule la punta utilizando la llama de alcohol con un microscopio de disección. Asegúrese de no cerrar la punta sino más bien mantener la abertura redonda y lisa sin ninguna constricción.
  9. Corte un 1 en (25 mm) tubo de goma, rociar el trozo de tubo con etanol al 70%, y deslice el tubo sobre el eje de la pipeta hasta que la abertura de la ventana esté completamente cubierto. Esto funciona como el "diafragma" de la pipeta de Spemann.
  10. Coloque una bombilla ml látex de caucho 2sobre la parte inferior abierta de la pipeta. El bulbo mantiene la presión negativa en la pipeta de Spemann.
  11. Para practicar el uso de una pipeta de Spemann, transferir perlas de cromatografía de alrededor de 100-200 m de diámetro a partir de una mancha marcada en una placa de Petri a una mancha marcada en otro bajo un microscopio.
  12. Para limpiar la pipeta Spemann, retire la tapa de goma y el lugar de la pipeta, la punta hacia abajo, en un vaso alto forrada con algodón o gasa en el fondo y llena de agua destilada y detergente cristalería.

3. Esterilizar e incubar los huevos

  1. Limpie los huevos con etanol al 70% y colocar los huevos en bandejas de huevos de plástico.
  2. Establecer los huevos en una incubadora calentada a 37,5 º C y 85-87%.
  3. Incubar los huevos hasta que alcancen HH9.5, aproximadamente 26 horas para la codorniz y 48 horas para el pato.

4. Ventana Huevos

  1. Retirar una pequeña pieza de la carcasa exterior de la parte superior del huevo con unas pinzas, teniendo cuidado de no perforar la cáscara interior membrane.
  2. Utilizando una jeringa con una aguja de 18 G de 1 pulgada, hacer un agujero en la punta más estrecha del huevo y retirar aproximadamente 1-2 ml de albúmina.
  3. Coloque cinta adhesiva transparente sobre el agujero y la marca de punción en la cáscara.
  4. Corte una "ventana" a lo largo de la superficie superior del huevo (a través de la cinta transparente) con unas tijeras curvas.

5. Visualice embriones y prepararse para la cirugía

  1. Utilizando una varilla de vidrio, cepillar suavemente una pequeña cantidad de rojo neutro (0,02 g / ml en BSS de Hank) sobre el embrión.
  2. Cortar la membrana vitelina y tire de ella sobre el embrión utilizando una aguja de tungsteno llama afilada.
  3. Vuelva a sellar el huevo mediante la colocación de cinta adhesiva transparente sobre la ventana.

6. Separe el tejido donante del embrión del Donante

  1. Retire la cinta de la ventana en el huevo del embrión donante.
  2. Para cortar el pliegue neural del ectodermo adyacente del embrión donante, hacer ranuras en ambos sidES del tubo neural, utilizando una aguja de tungsteno de llama-afilado (fabricado como se describe anteriormente).
  3. Luego, cortar a través del tubo neural en los planos anterior y posterior deseadas del injerto y separar el injerto del resto del tubo neural.
  4. Retire el pliegue neural del embrión donante utilizando una pipeta de Spemann u otro tipo de micropipeta.
  5. A continuación, retire el adhesivo de la ventana en el huevo de acogida y utilizar la pipeta Spemann colocar el pliegue neural donante junto con el embrión de acogida junto a la zona del tubo neural que recibirá el trasplante.

7. Separe el tejido del huésped y el trasplante de tejido del donante

  1. Separar el pliegue neural del tubo neural del embrión de acogida, como se hizo con el donante. Tenga cuidado de eliminar un injerto de igual tamaño que el tejido del donante.
  2. Empuje suavemente este tejido huésped lejos del embrión.
  3. Luego, con una aguja de tungsteno romo o la punta redondeada de un micropipette, mueva suavemente el neural donante doblez en el tubo neural de acogida, el mantenimiento de las orientaciones antero-posterior y dorso-ventral adecuadas. Asegúrese de que el injerto está escondido en lo largo de los lados, pero asegúrese de no meter o daño a los tejidos subyacentes. Para ayudar a mantener un seguimiento de la nota de la orientación del original cualquier asimetría en el tejido de un donante o de tinción diferencial de la Red Neutral. También foto-documento el embrión donante con el tejido extirpado acompaña, así como la quimera inmediatamente después de la cirugía.
  4. La solución salina estéril se debe añadir al huevo si el embrión de acogida muestra signos de desecación.
  5. Ahora, con cuidado volver a sellar y etiquetar el huevo, y suavemente volver a una incubadora de una alta humedad (70-80%), donde el embrión quimérico puede desarrollar a la etapa deseada para su análisis.

8. Colección de quimeras

  1. Asegúrese de recoger los embriones quiméricos en recién hecha fijador frío de Serra y colocar inmediatamente en un rocker a 4 ° C para una fijación O / N. Esto permitirá una detección más sensible de células de codorniz con el anticuerpo anti-codorniz.
  2. Para los análisis de la expresión génica a través de RT-qPCR, congelar embriones directamente en nitrógeno líquido antes de la extracción de ARN.

Resultados

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Antes de su posterior análisis, la eficacia del trasplante necesita ser ensayada. Para histológico, la expresión morfológica, o el gen de análisis de muestras de tejido, células de codorniz deben ser detectados por inmunohistoquímica usando anticuerpo Q ¢ PN como se describe 36. Para los análisis de ARN, especies específicas de las contribuciones a los tejidos de interés se pueden calcular utilizando una estrategia basada en PCR 58. Después de la eficacia del trasplante ha sido validado, otras medidas de resultado morfológicas o moleculares pueden ser evaluados en quimeras. Las interacciones entre las células de la cresta neural donantes y tejidos derivados del huésped circundantes que subyacen histogénesis y la morfogénesis del complejo craneofacial adecuado previamente se han estudiado ampliamente. En particular, mesénquima de la cresta neural dirige la morfología específica de las especies de la cara 7, 13, 51, 59, modelo de la pluma 52, patrón de músculo 56 arriba> y cartílago 53, 57 a través de la regulación de la expresión génica de acogida. Por ejemplo, el mesénquima de la cresta neural dicta cuando se forma el hueso en la mandíbula por la regulación temporal Bmp4 expresión 55.

Recientemente, las investigaciones se han centrado en las interacciones de tejidos que ocurren muy temprano en el desarrollo craneofacial. A este respecto, los experimentos que utilizan quimeras de codorniz-pato han demostrado embriones de acogida influyen en la migración de la cresta neural mediante la determinación de los límites morfológicos. Es decir, en los embriones quiméricos Quck, codorniz donante las células de la cresta neural migran hacia el host mandibular pato arco en un patrón de pato (Figura 1D). A pesar de esta contribución de acogida para el tamaño de la población de la cresta neural, de la cresta neural de donantes continúa generando un esqueleto mandibular que es-codorniz como en tamaño y forma (Figura 1E).

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Figura 1. Quail-Duck Sistema quimérico. (A) codorniz y (B) cráneos de pato muestran diferencias considerables en tamaño y forma, y por lo tanto, son ideales para el uso de un sistema quimérico para estudiar el desarrollo craneofacial (modificado a partir de Tokia et al. 56). (C) Diseño experimental para generar unilaterales embriones quiméricos Quck de codorniz HH9.5 etapa de concordancia y embriones de pato. El pliegue neural se elimina de un lado de embriones de codorniz y trasplantado en embriones de pato después de una pieza equivalente del pliegue neural se ha eliminado. (D) células donantes de codorniz (verde) puede ser seguido en quimeras utilizando un anticuerpo anti-codorniz (Q ¢ PN) como se muestra en vista ventral de HH12 embrión quimérico. (F) En mandíbulas Quck en HH38, la codorniz donante deriva-Meckel7; s cartílago es más corto y más recto que la observada para el pato cartílago contralateral derivada del huésped de Meckel, que es más grande y curvada. Reproducido Tokita et al., Dev.. . Bio 306, 377 (2007) con permiso de Elsevier.

Discusión

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La cresta neural es una población transitoria de células embrionarias que migra ampliamente en todo el embrión y se diferencia en diversos tipos de células, incluyendo condrocitos y osteoblastos, que contribuyen al esqueleto craneofacial. El trasplante de la cresta neural en el sistema quimérico codorniz-duck ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de las interacciones de tejidos y vías de señalización que regulan el desarrollo del esqueleto craneofacial. Sin embargo, dado el vasto potencial de la cresta neural para generar también las células del músculo liso, adipocitos, melanocitos, células de Schwann, y las neuronas, el sistema quimera codorniz pato tiene un tremendo potencial para futuras aplicaciones, en particular en combinación con el rápido avance de la biología de células madre y la medicina regenerativa. Desde la codorniz y pato son ambas especies criados comercialmente, un suministro de huevos fertilizados relativamente baratos está disponible de una variedad de granjas. Por lo tanto, esta técnica debe ser accesible a researcde ella opera dentro de una amplia gama de presupuestos y el espacio del establecimiento.

Aunque esta técnica es muy poderosa, aún quedan varias limitaciones. Al igual que otras técnicas quirúrgicas, la calidad y la viabilidad de las quimeras de codorniz-pato se basan en las habilidades quirúrgicas del investigador, y por lo tanto, habrá mayor variación inter e intra-individual entre los experimentos en comparación con otros modelos, como los que utilizan el ratón genética. Por otra parte, también hay variación en las tasas de desarrollo y etapas de embriones individuales que contribuye a la reproducibilidad y el éxito de cada trasplante. Embriones de aves son también muy susceptibles a la deshidratación y por lo tanto los pasos críticos durante la cirugía incluyen mantener los niveles de luz baja, el tiempo bajo el microscopio a un mínimo, los huevos sellados con cinta tanto como sea posible, y alta humedad en la incubadora después de la operación a evitar la desecación.

En cuanto a la viabilidad de las quimeras, usually entre 50-75% sobreviven, aunque estos porcentajes pueden disminuir cuanto mayor la etapa de recolección. En una típica sesión de 4-6 horas de la cirugía, un cirujano experimentado puede generar 10-15 quimeras. El éxito de los trasplantes también depende en gran medida de la calidad de las herramientas. Las buenas herramientas conducen a resultados más consistentes y reproducibles. El uso de un soplete de propano para que las agujas de tungsteno permite agujas muy afiladas para hacerse. El tipo de la antorcha utilizada hace una gran diferencia, ya que controla el tamaño de la llama. Afilar electrolítico también se puede utilizar, pero este enfoque no llega siquiera a acercarse a la producción de agujas como agudo. Utilice barras de tungsteno en vez de alambre de la cola de impresión de manera que las agujas pueden ser enderezados.

La micropipeta Spemann, mientras que consume mucho tiempo y es difícil de hacer, es un instrumento ideal para la transferencia de tejido. La pipeta se puede personalizar con diferentes tamaños de aberturas, y se puede utilizar en varias ocasiones. Un factor crítico para usinGA Spemann micropipeta es tener algo de líquido en la pipeta antes de tocar la punta a la superficie del embrión. Parte del líquido siempre fluirá a cabo cuando se hace contacto con el menisco sobre el embrión. Al pulsar sobre el diafragma permite que el tejido fluido y el injerto sea expulsada con gran precisión, mientras que un poco dejando que el diafragma hacia arriba chupa suavemente el donante de tejido de injerto en la pipeta. El mantenimiento de un poco de presión positiva en el diafragma mantiene el tejido del injerto del donante en la punta de la pipeta durante la transferencia, y un poco de presión adicional sobre la membrana permite que el tejido del injerto donante para ser colocado deliberadamente en el huésped.

Para la protección de la pipeta Spemann durante el almacenamiento y la esterilización, retire la bombilla del extremo ancho e inserte con cuidado la punta cónica en el bulbo. Coloque la pipeta Spemann en un tubo de ensayo de vidrio, cubrir la parte superior con papel de aluminio, y el autoclave antes de la cirugía. Después de varias pipetas son ready a esterilizar de nuevo para la cirugía, invertir las pipetas, calentar ellos casi a ebullición en la misma solución de agua destilada y detergente artículos de vidrio, y luego enjuagar varias veces con agua destilada. Pipetas Autoclave en sus tubos individuales. El tubo de goma que forma el diafragma y la pera de goma debe ser reemplazado después de varias esterilizaciones o cuando se convierten oscurecida y rígido.

Muchos de los componentes de este protocolo involucran equipo peligroso. Por ejemplo, el procedimiento para hacer una Spemann Micropipeta implica tres tipos de llamas, así como calefacción, tirando, soplado, de flexión, corte y pulido de vidrio. Por lo tanto, el uso de equipo de protección personal (PPE), que aumenta la seguridad, tales como gafas y una bata de laboratorio es crítica. Además, debido a que muchas personas sufren de, o tienen el potencial de desarrollarse, alergia al huevo, siempre use guantes al manipular los huevos. Con estas precauciones en mente, el sistema quimérico codorniz pato iSA método seguro, eficaz, y relativamente accesible que tiene muchas aplicaciones futuras.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) subvención F32 (DE021929) a JLF y una subvención DE016402 NIDCR R01 para RAS

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x PBSTEK TEKZR114
Hank' s BSS sin rojo fenolInvitrogen14025-092
Rojo neutroSigma AldrichN4638-5G0.22 µ m esterilizado con filtro
Agujas de 18 gBD305195
jeringa de 5 mlBD309646
n.º 5 Pinzas DumontFine Science Tools11252-20
Tijeras rectasFine Science Tools14028-10
Tijeras curvasFine Science Tools14029-10
PipetaSpemannHecho a mano en laboratorio
PortahuevosCenicero de vidrio y arcilla para modelar
Quemador de alcoholFisher04-245-1
Cinta transparente3M Scotch600
Varilla agitadora de vidrioFisher11-380CLa punta se estrecha y redondea con una llama
Alambre de tungston (0.004 x 3 pulgadas)A-M Systems7190La punta se afila con llama en un soplete de propano
Bunsun BurnerFisher ScientificS49117
PasteurPipeta Fisherbrand22-183-6329 pulgadas (229 mm)
Tubo de cauchoFisher Scientific14-178Cámbar, caucho natural de pared delgada; espesor de la pared: 0,0625 pulgadas/1,6 mm; Diámetro exterior: 0,375 pulgadas/9,5 mm; Diámetro interior: 0,25 pulgadas/6,4 mm
Cilindro de combustible de propanoBernzOmaticUL2317TX-9 con antorcha estilo "A" con un soplete de latón "llama de lápiz" atornillable
Lápiz de punta de diamante BombillasFisher Scientific22-268912
FisherbrandS32325
de goma

Referencias

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