Caracterización de las escalas de peces de múltiples capas-( Atractosteus espátula) Usando Nanoindentación, X-ray CT, FTIR y SEM

Resumen

Este trabajo presenta los métodos utilizados para el sondeo químico espacialmente correlacionados, estructural, y las propiedades mecánicas de la escala de varias capas de Atractosteus espátula (A. espátula) utilizando nanoindentación, transformada de Fourier (FTIR), microscopía electrónica de barrido (SEM), y X- ray tomografía computarizada (CT de rayos X). Los resultados experimentales se han utilizado para investigar los principios de diseño de materiales biológicos de protección.

Resumen

La arquitectura jerárquica de los materiales biológicos de protección, tales como escalas mineralizadas de pescado, conchas de gasterópodos, cuerno de carnero, cuernos y caparazones de tortuga proporciona principios de diseño únicos con potencial para guiar el diseño de materiales y sistemas de protección en el futuro. La comprensión de las relaciones estructura-propiedades de estos sistemas de materiales en la microescala y nanoescala que el fallo se inicia es esencial. Actualmente, las técnicas experimentales, tales como nanoindentación, CT de rayos X, y SEM proporcionan a los investigadores una manera de correlacionar el comportamiento mecánico con microestructuras jerárquicas de estos sistemas de materiales ^1-6. Sin embargo, un procedimiento estándar bien definido para la preparación de muestras de biomateriales mineralizadas no está disponible actualmente. En este estudio, los métodos para sondeo químico espacialmente correlacionados, estructural, y las propiedades mecánicas de la escala de varias capas de A. espátula mediante nanoindentación, FTIR, SEM, con bañoenergía dispersiva de rayos X (EDX) microanálisis, y CT de rayos X se presentan.

Introducción

Los investigadores están estudiando los biomateriales estructurales y están tratando de dilucidar los principios de diseño, que ofrecen los biomateriales estructurales con propiedades mecánicas mejoradas, como mucho mayor tenacidad y resistencia en comparación con sus componentes individuales. Las investigaciones sobre los principios de diseño de escamas de pescado blindados para Pagrus major ^7, Polypterus senagalus ^2,6, Arapaima gigas ^3, Cyprinus carpio ⁴ y Atractosteus espátula ¹ han demostrado la necesidad de ampliar la aplicación de métodos experimentales existentes para estudiar las respuestas estructurales y las características microestructurales, ya que los procedimientos estándar detallados no están disponibles para estos tipos de materiales y experimentos.

Entre las diferentes escalas de peces acorazados discutidos, A. espátula es un depredador históricamente ápice de la central de EE.UU. ⁸ y es una especie con altoly escalas mineralizadas. Los intercambios de especies de masa muscular para la masa de la piel para obtener un sistema de defensa depredador mejorada en comparación con los peces de tamaño comparable se mencionó anteriormente ^9. De acuerdo a la página y Burr ^10, A. espátula es la tercera más grande de peces de agua dulce en América del Norte con el esturión blanco (Acipenser transmontanus) y el esturión del Atlántico (Acipenser oxyrhynchus) siendo las especies más grandes. Las escalas de peces altamente mineralizados de A. sólo recientemente se están estudiando espátula. Thompson y McCune ¹¹ sugerido que la morfología de las escalas GAR tiene una composición de tres capas que consiste en una capa ganoine exterior, una capa de hueso difusa, y la capa de hueso laminar. La investigación actual sobre el A. escalas espátula no han distinguido la capa de hueso en difusa o regiones hueso laminar, pero sólo ha estudiado la región del hueso como una única capa interna ^{de 1,12.}

En este estudio, los procedimientos para, entigar la microestructura, nanoestructura, composición química, y la distribución espacial de las propiedades mecánicas de las escalas de A. espátula sobre la base de los resultados de la espectroscopia FTIR, SEM, X-ray CT, y las técnicas de nanoindentación se presentan.

Protocolo

1. Escala Pescado Preparación de la muestra

Para este estudio, las escalas se obtuvieron del ingeniero del Ejército de EE.UU. de Investigación y Desarrollo del Centro (ERDC) Laboratorio Ambiental de la mitad de la longitud (29 ^ª columna de caudal) de una gar aproximadamente 600 mm de largo (A. espátula). Las escamas de los peces se obtuvieron de acuerdo con el Instituto de la Salud (NIH) pautas de cuidado de animales ERDC y Nacional.

1. Materiales
   Anote la ubicación espacial de los peces de las escalas obtenidas para el estudio. Asegúrese de que se adhieran a la organización adecuada o pautas gubernamentales para la obtención de muestras biológicas tales como las pautas para el cuidado de los animales de los NIH. Almacenar las escalas en un medio adecuado tal como solución salina tamponada con fosfato para preservar la hidratación y mantener el contenido mineral una vez que se retiran de los peces. Evite el almacenamiento prolongado que puede resultar en la pérdida de minerales, lo que puede influir en los datos de nanoindentación. Use un cepillo de cerdas medianas y tweezers para eliminar cualquier tejido blando de las escamas duras.
2. Espécimen de montaje y de seccionado
   El examen de una sección transversal del eje corto de la escala de pescado (Figura 1) usando FTIR y nanoindentación requiere primero el montaje de la escala en un medio rígido, tal como un epoxi de dos partes que consiste en una resina y el endurecedor. Uso general RT epoxis de curado con bajas temperaturas de pico como el epoxi de propósito general comercial utilizado en este estudio que tenía un pico de temperatura de menos de 55 ° C.

Imágenes Figura 1. Computarizada de rayos X de A. escala espátula que representa la sección transversal de eje corto examinado en este estudio de A. espátula usando nanoindentación y FTIR [A (anterior), P (posterior), D (dorsal), V (ventral)].

2. 1. Mantenga la escala de peces en un molde de la muestra 32 mm de diámetro usando un soporte de muestras de plástico disponibles en el mercado. Esto mantiene la muestra orientada correctamente durante el montaje en el epoxi.
   2. Una vez que la muestra se mantiene en el molde, verter la resina sin curar en la muestra y luego permitir que el epoxi se cure de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
   3. Después se cura la resina, la sección de la muestra montada utilizando una cuchilla de diamante de alta precisión de corte vio en la línea media de la muestra.
   4. Someter a ultrasonidos en agua destilada durante 15 minutos para eliminar los residuos de la muestra.
3. Pulido de nanoindentación y FTIR
   Para obtener una superficie lisa y plana para nanoindentación como se muestra en la Figura 2, el siguiente procedimiento de pulido y los parámetros se sugieren basado en discusiones con la fabricación y pulidor de muestras de ensayo. Sin embargo pueden necesitar ser ajustados para diferentes biomateriales basados ​​en las respuestas de los parámetrostales como las tasas de eliminación de material. Ultrasonidos de muestras en un baño de agua destilada entre pasos de pulido es de vital importancia para garantizar las partículas de un grueso pulido paso no se introducen en un paso más fino pulido posterior.

Figura 2. Imagen de un pulido de eje corto sección transversal A. escala espátula montada en epoxi.

4. 1. Esmalte de grueso con una almohadilla de 15 micras de SiC y el agua como un lubricante hasta que la muestra es plano utilizando la fuerza de la cabeza de pulido automático de 7 lbf y la velocidad de 200 revoluciones por minuto (rpm).
   2. Sonicar la muestra en un baño de agua destilada durante 15 min.
   3. Pulimento intermedio con una almohadilla de 6 micras de SiC usando lubricante agua a una velocidad de rodillo de 130 rpm y una fuerza de 7 lbf para5 min.
   4. Someter a ultrasonidos la muestra en un baño de agua destilada durante 15 min.
   5. Pula con un 1 m pad SiC usando lubricante de agua a una velocidad de rodillo de 130 rpm y una fuerza de 7 lbf durante 5 min.
   6. Sonicar la muestra en un baño de agua destilada durante 15 min.
   7. Pulido final con un 50 nm suspensión de sílice coloidal utilizando una almohadilla de pulido adecuado, como una alta densidad no tejidas, bajo la siesta poliuretano poroso que el fabricante sugiere para 50 suspensiones nm. Polaco a una velocidad de 130 rpm con una fuerza de 7 lbf durante 5 min.
   8. Sonicar la muestra en un baño de agua destilada durante 15 min.

2. Pruebas Nanoindentación

1. Calibrar el sistema de nanoindentación antes de cada tanda de pruebas por la fabrica directrices. La calibración debe incluir la determinación de la función de área del sistema para la punta Berkovich y la rigidez del cuadro. Además, realizar una calibración de microscopio de penetrador en este pasopara asegurar los guiones se correlacionan con los lugares de microscopio elegidos.
2. Cargue la muestra en el nanoindentador y utilice los controles del microscopio óptico en el nanoindentador para traer la muestra en el foco.
3. Utilice los controles de software para mover la muestra a la ubicación para el primer guión. Idealmente, esto es aproximadamente 10 micras en el epoxi desde el borde de la capa de ganoine a lo largo de la línea central de la sección transversal de la escala.
4. Realizar 4 filas paralelas de guiones espaciados 15 micras, aparte de obtener un conjunto de datos estadísticamente significativos establecen a partir de esta ubicación. Ajuste el nanoindentador para una carga máxima de 5 mN tarifas, carga y descarga de 0,1 mN / seg, un tiempo de espera de 30 segundos, y un espaciado de sangría mínima de 5 m para cada fila. La fila de guiones debe ser configurado para funcionar ortogonal a la superficie ganoine, y un número suficiente de guiones de modo que pueda viajar a través de la sección transversal de la escala al recorrer aproximadamente 10 micras en el epoxY más allá de la capa ósea.
5. Cuando se completa el lote, tener la nanoindentador crear guiones fiduciales con una carga máxima de 100 mN en el primero y último guión, que debe estar en la epoxi antes de la capa de ganoine y después de la capa de hueso, respectivamente. Estos se correlacionan con los puntos inicial y final de cada fila de guiones.
6. Después de nanoindentación, coloque la muestra de nuevo en la solución de PBS para evitar una mayor deshidratación.
7. Utilice el software de nanoindentación para determinar el módulo y dureza basado en el método de Oliver-Pharr ¹³ si se observa una respuesta de material independiente del tiempo. De lo contrario es posible que el tiempo de espera que se extienda a superar la deformación observada desde la descarga demasiado rápido.

3. Espacialmente Resuelto ATR-FTIR Espectroscopia

El uso de una diapositiva-en accesorio ATR unido a un microscopio FTIR es un método sugerido para recoger resuelto espacialmente transformada de Fourier infrarroja (FTIR) de la Layers en una muestra de escamas de pescado. El accesorio ATR permite la colección de espectros de alta calidad con muy pequeño (~ 10 m ²⁾ resolución espacial, que no es alcanzable con cualquier otra técnica de FTIR. La misma muestra pulida (Figura 2) preparado para los experimentos de nanoindentación se utilizó en estos experimentos.

1. Elija una muestra con una superficie y dimensiones apropiadas para el microscopio FTIR se utiliza para el análisis para asegurar espectros de alta calidad se obtiene a partir de ATR-FTIR spectromicroscopy.
2. Preparar el microscopio FTIR para recopilar datos. FTIR microespectroscopía requiere calibración de la señal de FTIR en las mismas condiciones de muestreo que se utilizará para la medición de la muestra. Típicamente, esto incluye enfriar el detector y dejando tiempo para que se estabilice, así como la recogida de todos los espectros de fondo y los espectros de la muestra en las mismas condiciones ambientales. Esto puede ser especialmente importante, porque el CO ₂ y vapor de agua en el aire puede dafectar ramatically espectros FTIR. También es importante asegurarse de que la óptica del instrumento están alineados.
3. Recoger un espectro de fondo apropiado para restar la muestra en contra. Para estos experimentos, un pulido, portaobjetos de microscopio recubierto de oro fue utilizado como un fondo para FTIR spectromicroscopy.
4. El uso de un objetivo adecuado, se centran en la muestra y seleccionar un área de interés para el análisis.
5. Una vez que se encuentra un área de interés, coloque el accesorio ATR para el objetivo del microscopio FTIR, aumentar la muestra hasta que haga contacto íntimo con el elemento de reflexión interna ATR, y recoger un espectro de la muestra.
6. Después de recoger los espectros FTIR, realice el tratamiento de la información estándar necesaria requerida.

4. Rayos X Tomografía computarizada (TC)

1. Obtener y preparar la escala como se discute en la Sección 1.1
2. Configuración del escáner
   1. De calentamiento hasta la fuente de rayos X de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
   2. De rayos X Set voltaje y la corriente a 50 kV y 160 μA, respectivamente.
   3. Establecer el tiempo de exposición a 1.450 ms.
   4. Seleccionar un filtro de 1,0 mm de aluminio.
   5. Antes de la carga de la muestra, hacer una corrección de campo plano cuando la fuente de rayos X está apagado (campo oscuro) y el (campo claro).
3. Montaje y carga de muestras
   Escalas deben montarse de manera para que no se muevan o se mueven a lo largo de la longitud de la exploración. Estas muestras también deben ser montados usando materiales que son casi transparentes a los rayos X. Una combinación de espuma de poliestireno y Parafilm puede ser usado para asegurar la escala a la etapa de CT.
   1. Rígidamente montar la muestra de manera que la dimensión más larga es paralelo al detector.
   2. Asegure la muestra montada en el escenario del escáner.
   3. Coloque la muestra de modo que estará en el centro de rotación a lo largo de la exploración.
   4. Seleccione la resolución más alta que permite que toda la escala para estar en el campo de visión (FOV), en este caso7.5 micras.
4. Configuración de adquisición
   Realizar exploraciones en este estudio con un paso de rotación de 0,25 ° y un valor de un promedio de marco de 15. Si las resoluciones más bajas son aceptables, aumente el tamaño de paso y / o disminuir el bastidor con un promedio de reducir el tiempo de ciclo total.
5. Parámetros de reconstrucción
   Una vez que se obtiene un conjunto de datos, reconstruir las imágenes de proyección de rayos X para crear un conjunto de datos que contiene imágenes de cortes transversales. Seleccione la configuración predeterminada de software NRecon de SkyScan excepto por lo siguiente.
   1. Cambie el anillo de corrección de artefactos a 20.
   2. Cambie la Corrección del haz de endurecimiento a 25%.
   3. Ajuste el CS estática de giro para que el nivel de imagen de corte transversal.
6. Procesamiento de imágenes
   Utilice el software de CTAN SkyScan para obtener la imagen en escala de grises 3D final. Ajuste el rango de escala de grises a un nivel adecuado para eliminar los artefactos de la espuma de poliestireno y Parafilm.

Las muestras preparadas por el pulido para nanoindentación y micro-/nano-structure caracterización se examinaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Modo de bajo vacío se utilizó para minimizar la deshidratación de los especímenes y la necesidad de aplicación de recubrimientos conductores. Análisis químico Local se realizó sobre muestras pulidas en conjunto con SEM de imagen usando espectroscopia de rayos X de energía dispersiva (EDX). Análisis EDX se llevaron a cabo en la misma línea / rejilla que se analizó por nanoindentación con el fin de proporcionar correlaciones entre las propiedades químicas y mecánicas. Superficies recién fracturadas fueron también examinadas por SEM para proporcionar una mejor información sobre la morfología y la orientación de las estructuras biomineralizada presentes en las escamas de los peces. Para mejorar la resolución para la observación de la estructura a escala nanométrica en las superficies fracturadas, las muestras fueron recubiertas por pulverización catódica con oro (Au) y la imagen en el modo de alto vacío. La siguienteproporciona detalles adicionales sobre los procedimientos utilizados.

1. SEM Imaging de superficies pulidas
   1. Coloque la muestra en la cámara de pulido SEM y de la bomba de cámara en modo de bajo vacío con presión de la cámara de 0,1 a 0,5 mbar.
   2. Ajuste la distancia de trabajo de aproximadamente 5,0 mm.
   3. Activar alto voltaje (HV) y vaya a la región de interés en la muestra que incluye la zona de transición entre ganoine y huesudos subcapas u otras áreas de interés.
   4. Obtener imágenes a 15 HV kV y corriente de haz de aproximadamente 3.9 nA.
   5. Enfoque la imagen y realizar todas las alineaciones y ajustes necesarios stigmation.
   6. Captura imágenes de al menos tres regiones de interés en aumentos relevantes (normalmente 250X a 10.000 X) con el bajo de vacío de electrones retrodispersados ​​detector (EEB) para ayudar en la identificación de los cambios en el contenido biomineral y densidad (es decir, hueso denso vs hueso poroso ).
2. SEM Imaging de superficies fracturadas
   1. Fije espécimen recién fracturado a un talón de 90 ° SEM utilizando cinta de doble cara de carbono con la superficie de la fractura hacia arriba.
   2. Pulverización catódica abrigo con Au proporcionar un sub-nm de espesor de capa conductora sobre la superficie de fractura.
   3. Coloque la muestra en la cámara de SEM y de la bomba en el modo de cámara de alto vacío.
   4. Ajuste la distancia de trabajo de entre 3.0 y 5.0 mm.
   5. Activar HV y vaya a las regiones de interés en la muestra. Principales áreas de interés en este caso eran la estructura presente en las capas ganoine y óseas.
   6. Obtener imágenes de entre 5 kV y 15 kV de alta tensión y una corriente del haz inferior de 0,24 nA para mejorar la resolución.
   7. Inicialmente centrarse muestra y realizar alineamientos preliminares.
   8. Aumentar la ampliación a más de 5.000 X y el interruptor de la lente de emisión de campo normales en (UHR) lente de inmersión / ultra-alta resolución.
   9. Realice UHR alineaciones y ajustes stigmation.
   10. Captura de imágenes a partir de al menos tres regiones of interés a ampliaciones pertinentes (típicamente 5.000 a 250.000 X X) usando el detector de la lente a través de (TLD) operado en modo de electrones secundarios (SE).
3. Análisis EDX de las superficies pulidas (realizado en conjunto con las imágenes SEM). Estos parámetros son dependientes de material y tendrá que ser ajustada de modo que el volumen de interacción EDX es similar en tamaño al volumen interacción nanoindentación como se comenta por Moser ^14.
   1. Vaya a la región de interés en la probeta pulida que incluye rejilla nanoindentación indicada por las marcas de referencia al final de cada línea de guiones.
   2. Asegúrese de HV es de al menos 15 kV, corriente del haz es de al menos 3,9 nA, y la distancia de trabajo es mayor que 5,0 mm.
   3. Captura de imagen de la EEB en la región para ser analizados mediante EDX.
   4. El uso de software de análisis de EDX, capturar la misma imagen para ayudar en la localización de las áreas para realizar análisis químicos a lo largo de la línea de guiones.
   5. Usando el "Análisis de la Línea" técnica, poción de una línea para realizar análisis químicos a lo largo de la línea de interés de guiones comenzando en el primer guión y terminando en el último guión.
   6. Especifique el número de puntos de análisis para ser colocado a lo largo de la línea. Lo mejor es usar el mismo número de puntos de análisis y guiones que están presentes para proporcionar una correlación espacial directa entre la composición química y las propiedades mecánicas.
   7. Cuando la línea se coloca y puntos especificado correctamente, iniciar el análisis de la línea utilizando el software EDX.
   8. Cuando se completa el análisis de la línea, identificar los elementos de interés para ser cuantificados a partir de los espectros punto obtenido a lo largo de la línea especificada en la superficie pulida de la muestra.
   9. Una vez que se identifican los elementos de interés, realizar una calibración de fondo para tener en cuenta la radiación de Bremsstrahlung y otros efectos.
   10. Elija la opción de análisis de deconvolución del software para obtener el análisis cuantitativo en cada punto a lo largo de la línea especificada en Quanficar la composición química en cada punto.
   11. Guardar los resultados cuantitativos de análisis químico junto con la imagen de la línea especificada que se ha analizado para ayudar en la correlación espacial con las propiedades mecánicas medidas mediante nanoindentación.

Resultados

La Figura 3 representa los resultados promedio de espacialmente correlacionados-nanoinidentation / análisis SEM / EDX llevado a cabo a través del eje largo de aproximadamente 800 micras a corto sección transversal. En la capa ganoine aproximadamente 60 micras de espesor, el nanoindentador calcula un módulo promedio de 69,0 GPa y dureza de 3,3 GPa. El nanoindentador determinó un módulo promedio de 14,3 GPa y dureza de 0,5 GPa para la capa de hueso de aproximadamente 740 m de espesor.

EDX determina de carbono, oxígeno, calcio, y fósforo, que se encuentran típicamente en escalas mineralizadas. Sin embargo, las capas ganoine y huesos contenían diferencias cuantificables en composiciones químicas. El pico de carbono observada en la capa de hueso se puede atribuir a que la región no ser tan altamente mineralizada, lo que resulta en un ligero incremento en el carbono que también causó la disminución observada en el brillo total de la imagen de la EEB. Específicamente, la capa ganoine '; S Proporción de media concentración atómica de Ca: P de 1,71 pareció similar a la hidroxiapatita con una relación teórica de 1,67. Ca promedio del estrato hueso: P disminuyó a 1,51 lo que representa una disminución en la cantidad de mineralización de la capa ganoine.

Los espectros de FTIR en la Figura 4 para la capa de hueso y la capa ganoine identificado los principales grupos funcionales como amida, carboxílico, fosfato, y carbonilo. Específicamente, FTIR confirmó la observación visual de las firmas de hidroxiapatita en las firmas (ganoine) capa exterior y de colágeno en la capa (hueso) interior. Picos de 3,500-3,000 cm ^-1 debido a NH estiramiento y flexión NH entre 1550 y 1500 cm ^-1 representan grupos amida en la capa de hueso. Los picos en la región de número de onda 1,470-1,365 cm ^-1 representan grupos alquilo amida sustituido. Además, un distintivo C = O se extiende en 1641 ^cm-1 se observó en la capa de hueso. Guisanteks de 3,000-2,500 cm ^-1 representan grupos carboxílicos. Espectros Tanto el hueso y ganoine capas 'producen un pico distintivo cerca 1,079.33 cm ^-1 indicativos de estiramiento fosfato.

De rayos X las imágenes de CT en la Figura 5 que capta la capa de ganoine no cubre la capa de hueso donde las escamas se superponen entre sí. Las capas ganoine grises brillantes indican las fases más densas, más duras y más duras, mientras que las capas óseas grises más oscuros indican las fases menos densas y menos rígidas. Además, las imágenes CT de rayos X ayudó en la identificación de la falta de uniformidad en grosor de la capa ganoine. De hecho, los hoyos claros se observan cerca del centro de la capa de ganoine, que no cubren la capa de hueso en absoluto.

La imagen SEM de la Figura 6A de la superficie de fractura grabado con H ₃ PO ₄ reveló nanoestructuras organizadas en un patrón de capas para la capa ganoine. Esta nanorod organizadoestructura corresponde a las firmas de hidroxiapatita obtenidos a partir de la FTIR para el área ganoine.

La figura 6A representa un típico aumento menor SEM de una superficie de fractura identificando claramente la transición entre las capas ganoine y hueso con la línea discontinua. Figura 6B representa los más altos de aumento Imágenes SEM de la superficie de fractura después del grabado con H ₃ PO _4. Después de grabado, nanovarillas orientadas en la capa exterior ganoine son claramente identificables, mientras que una nanoestructura de fibra como se observa en la capa de hueso.

Figura 3. Módulo y los datos de dureza de nanoindentación espacialmente correlacionados a la composición química de SEM / EDX.

Figura 4. Espectros FTIR obtenida de las capas exteriores (ganoine) e interior (ósea).

Figura 5. De rayos X que muestran imágenes de la TC picaduras en el exterior (ganoine) capa que cubre el (ósea) capa interna.

Figura 6. (A) de baja magnificación de la imagen SEM de la superficie típica de fractura, (B) las imágenes de mayor aumento de nanovarillas en el exterior (ganoine) y fibras en el interior (Bony) capas .. Por favor clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Desde un punto de vista experimental, los investigadores tienen que recordar que cuando se trabaja con materiales naturales biológicos, tales como escamas de pescado mineralizadas, informar de la ubicación espacial de la escala en el pescado es crítica, ya que investigaciones anteriores han demostrado las propiedades mecánicas de las escamas de pescado mineralizadas son dependientes a donde las escalas se encuentran en los peces ^4.

Las propiedades mecánicas de los materiales biológicos mineralizadas también ha demostrado ser dependiente del estado de hidratación de las muestras ^4. Esto limita la utilidad de esta técnica cuando se trata de comparar las muestras frescas que han sido hidratados adecuadamente con los resultados publicados en la literatura abierta, que utilizan muestras fosilizadas secos. Por lo tanto, tiempos de prueba prolongados deben evitarse para minimizar los efectos de la deshidratación sobre las propiedades mecánicas de una muestra durante nanoindentación. Se recomienda realizar estudios piloto específicas del material para asegurar la experienciatiempo de ejecución ción es lo suficientemente mínima para no cambiar el comportamiento mecánico del material. Nanoindentación celular mojado sería un método preferido para mantener un estado de hidratación constante del material si el equipo de prueba lo permite.

El método de nanoindentación utilizado en este estudio, que calcula el módulo de elasticidad de la curva de descarga asume el material se comporta como un material isotrópico elástico lineal. La técnica se puede utilizar con una variedad de puntas penetrador. Sin embargo, se usó la punta Berkovich de tres lados con un medio ángulo de 65,35 ° en este estudio. Consejos alternativos tales como la esquina de cubo (media = 35,36 ° ángulo) son adecuados para el procedimiento presentado en este manuscrito, pero desde la punta de esquina de cubo es más agudo que las grietas de punta Berkovich se pueden generar en la muestra a gran parte de las cargas más bajas que con la punta Berkovich.

El pulido es un paso esencial para obtener una superficie lisa y plana, con una superfi minimizadoe rugosidad para no afectar a los resultados de nanoindentación. Los pasos de pulido que se presentan en este manuscrito son un procedimiento sugerido que podría ser necesario modificar en función del tipo de pulidor que se utiliza. Sin embargo, el paso crítico para asegurar que los datos de nanoindentación precisa es que rugosidad de la superficie se reduce al mínimo, y para este material en particular se requiere un pulido final nm 50 para obtener una superficie lisa y plana en las profundidades de indentación se realiza la palpación.

El espaciamiento de guiones también asegura que los datos de nanoindentación precisa que no está influenciado por la deformación del material que ocurre a partir de guiones anteriores. El manual del usuario nanoindentador para el equipo en este estudio sugiere que el espaciamiento de guión debe ser de al menos 20 a 30 veces la profundidad máxima de penetración de Berkovich penetradores ^15. Para materiales alternativos, necesitará el espaciado de sangría requerida para ser determinado en base a la carga aplicada y la máxima profundidad de penetración como se discutió previamente en el abiertoliteratura ^16,17. Además, se eligió el tiempo de espera para este material para superar cualquier fluencia observada para las diferentes fases de material sondadas permitiendo método de análisis de Oliver-Pharr del software de nanoindentador para ser utilizado. Sin embargo, como se comenta por Oyen ¹⁸ métodos de análisis alternativos para materiales biológicos cuando las respuestas materiales dependientes del tiempo no se pueden superar con tiempos de retención adecuados.

Para lograr resultados de alta resolución a partir de X-Ray CT, varias configuraciones deben ser optimizados. Este documento describe un conjunto muy específico de los parámetros para el uso en una escala de peces con un tamaño único y espesor en capas. Con diferentes tamaños de la muestra, tendrá que ser ajustado para obtener un conjunto de datos de la más alta calidad de estos ajustes. El proceso de selección de cada parámetro debe estar claramente definido en el manual del usuario que viene con la máquina que se utiliza. Configuración de escaneado (tensión, corriente, la exposición, selección de filtro) y los ajustes de reconstrucción(artefactos de anillo, endurecimiento del haz) pueden necesitar ser modificado para acomodar una variedad de otros tamaños de la muestra y geometrías.

Rayos X CT proporciona una imagen de la morfología escala toda la identificación de una capa ganoine que cubre una capa ósea de material sólo cuando las escalas no se solapan entre sí. Las imágenes CT de rayos X también identificó que la capa ganoine consistió de un grosor no uniforme a través de la escala, y los hoyos incluso expuestas que carecían de la capa de ganoine por completo.

Curiosamente, los datos de nanoindentación espacialmente correlacionados con el análisis químico de SEM / EDX identificaron una transición discreta agudo entre las 2 capas en vez de una transición más gradual observado para las escamas de los peces mineralizadas de la P. senagalus (en Bruet et al. ^2).

Una combinación de nanoindentación, FTIR, EDX y SEM proporciona propiedades mecánicas, análisis químicos, y la información estructural para confirmarla capa externa como ganoine con la morfología y química similar al esmalte. Además, estas técnicas confirmaron la capa interior como una capa de material óseo.

En conclusión, los métodos descritos en este estudio identificaron el procedimiento y los resultados correspondientes para examinar la escala de peces mineralizada de A. espátula de la estructura mayor a la composición química y la nanoestructura.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Resina epoxi	Buehler	701-501512
Endurecedor epoxi	Buehler	703-501528
Samplkups	Buheler	20-8180
SamplKlips I	Buehler	20-4100-100S
Sierra de corte de alta precisión	Buehler	Isomet
UltraMet 2002 limpiador sónico	Buehler	B2510R-MT
Pulidora	Buehler	49-1750-160
grano 1.200 (15 μ m) Papel SiC	Struers	40400012
grano 4.000 (6 μ m) Papel SiC	Struers	40400014
50 nm de sílice coloidal	Buehler	40-10075
Almohadilla de pulido Chemomet para suspensión de 50 nm	Buehler	40-7918
Nanoindentador	MTS	G200
Microscopio de continuo FTIR	Thermo Nicollet	6700
Tomografía computarizada de rayos X	Skyscan Skyscan	1173
SEM	FEI	NovaNanoSEM 630
EDX	Bruker	AXS Detector Xflash 4010
Recubridor por pulverización catódica	Denton	Desk II