La cuantificación individual Microvessel Permeabilidad en aislado de rata Blood-perfundido Preparación de pulmón

Summary

La preparación aislada de pulmón perfundido con sangre hace que sea posible visualizar las redes de microvasos en la superficie del pulmón. A continuación se describe un método para cuantificar la permeabilidad de la microvasculatura individuales en pulmones aislados utilizando imágenes de fluorescencia en tiempo real.

Abstract

La preparación aislada de pulmón perfundido con sangre es ampliamente utilizado para visualizar y definir la señalización en los microvasos individuales. Mediante el acoplamiento de esta preparación con imágenes en tiempo real, se hace factible para determinar los cambios de permeabilidad en los microvasos pulmonares individuales. Aquí se describe los pasos para aislar a los pulmones de ratas y perfundir con sangre autóloga. A continuación, se describe los pasos para infundir fluoróforos o agentes a través de un micro-catéter en una región de pulmón pequeño. El uso de estos procedimientos descritos, se determinó la permeabilidad aumenta en microvasos pulmonares de rata en respuesta a inyecciones de lipopolisacárido bacteriano. Los datos revelaron que el lipopolisacárido aumentó fuga de líquido a través de ambos segmentos venulares y microvasos capilares. Por lo tanto, este método hace posible la comparación de las respuestas de permeabilidad entre los segmentos vasculares y por lo tanto, definir cualquier heterogeneidad en la respuesta. Mientras que los métodos comúnmente utilizados para definir la permeabilidad pulmonar requieren postprocesado de muestras de tejido de los pulmones, eluso de imágenes en tiempo real evita este requisito como se desprende de la presente método. Por lo tanto, la preparación de pulmón aislado combinado con imágenes en tiempo real, ofrece varias ventajas sobre los métodos tradicionales para determinar la permeabilidad microvascular pulmonar, sin embargo, es un método sencillo de desarrollar y poner en práctica.

Introduction

Aumento de la permeabilidad microvascular en los pulmones conduce al desarrollo de edema alveolar y el intercambio de gases en peligro y es una característica importante de la lesión pulmonar aguda (ALI) ^1-3. Por lo tanto, las estimaciones de la permeabilidad vascular son importantes para definir el grado de la lesión pulmonar y la eficacia de las intervenciones terapéuticas propuestas. Análisis gravimétrico, tales como la relación húmedo a seco de pulmón libre de sangre y microvascular coeficiente de filtración se utilizan ampliamente métodos para estimar ^4,5 permeabilidad. Otros métodos incluyen la cuantificación de la retención de sondas radi....

Protocol

Todos los experimentos realizados en animales fueron aprobadas por el Comité de la Universidad de Tennessee Health Science Center Institucional Cuidado de Animales y el uso.

1. Tubo para Preparados perfusión del pulmón de la rata

1. Preparar un sistema de tubos con tubos de Tygon (# 18) para la perfusión de la sangre como se muestra en la Figura 1. Conectar transductores de presión (P23XL) y colocar el tubo en la platina del microscopio.
2. Ajuste la temperatura del baño de agua a 37 ° C.
3. Conectar la entrada y la salida de pulmón temporalmente con tubo de Tygon.

Results

Una preparación de pulmón perfundido con sangre aislado conectado al tubo de perfusión y el equipo relacionado se muestra en la Figura 2. Para fines de demostración, se utilizó una rata Sprague Dawley, aunque los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar con cualquier especie de rata. Infusiones través de un microcatéter de la aurícula izquierda sólo llegan a una pequeña región del pulmón. La región infundido puede ser identificado por la decoloración inducida por infusión.......

Discussion

La preparación de pulmón perfundido con sangre aislado junto con imágenes en tiempo real proporciona una herramienta sencilla para la determinación de cambios de permeabilidad en los microvasos pulmonares individuales. Hemos aplicado este método para definir los cambios de permeabilidad en respuesta a la infusión de LPS. Nuestros datos sugieren claramente que la infusión de LPS provocó un aumento de la permeabilidad microvascular. Además, los datos también indican que los cambios de permeabilidad inducidos por LPS fuero.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tygon Tubing	Fisher Scientific		#18
Transductor	de Presión Data Sciences International	P23XL	Necesidad cantidad 3
Aguja de Mariposa	Greiner Bio-One		450081 21 G
Bomba Peristáltica	Cole Parmer	Masterflex L/S
PE-90	Tubo Becton Dickinson	427421	30 cm necesarios
Tubo de PE-10	Becton Dickinson	427401	40 cm necesarios
Bomba de jeringa	Braintree Scientific	BS8000
tórica	Hecho a medida con un orificio de 20 mm de diámetro y un mango para asegurar la junta tórica al soporte
FITC Dextrano 20KD	Sigma Aldrich		0,5 mg/ml (Se puede seleccionar un dextrano de diferente tamaño molecular, si los experimentos de ensayo indican su idoneidad en función de los valores del índice de permeabilidad calculados)
Lipopolisacárido	Sigma Aldrich		Serotipo 0111:B4