Aquí se describe una metodología para llevar a cabo un siRNA dirigidos pantalla "ubiquitome" para identificar nuevos ubiquitina y reguladores-ubiquitina de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia. Esto puede ser adaptado a cualquier vía biológica, donde una lectura robusta de la actividad del indicador está disponible.
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Artículo de método
Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo
En este artículo
Resumen
Resumen
Modificación posterior a la traducción de las proteínas con ubiquitina y ubiquitina-como las moléculas (Ubls) se está convirtiendo en una red de señalización celular dinámica que regula diversos procesos biológicos, incluyendo la respuesta a la hipoxia, proteostasis, la respuesta al daño del ADN y la transcripción. Para entender mejor cómo UBLs regulan las vías pertinentes a la enfermedad humana, hemos recopilado un siRNA humana "ubiquitome" biblioteca que consta de 1.186 piscinas siRNA dúplex dirigidos todos conocidos y predijo componentes de las vías del sistema de UBL. Esta biblioteca se puede criba frente a una gama de líneas celulares que expresan los reporteros de diversas vías biológicas para determinar qué componentes UBL actúan como reguladores positivos o negativos de la vía en cuestión. Aquí se describe un protocolo que utiliza esta biblioteca para identificar ubiquitome-reguladores de la respuesta celular mediada HIF1A a la hipoxia mediante un indicador de luciferasa basado en la transcripción. Una etapa inicial de desarrollo de ensayosse lleva a cabo para establecer los parámetros de detección adecuados de la línea celular antes de realizar la pantalla en tres etapas: detección / deconvolución primaria, secundaria y terciaria. El uso de objeto a través de siRNA bibliotecas de todo el genoma se está convirtiendo cada vez más popular, ya que ofrece la ventaja de la cobertura del sólo miembros de la vía con la que los investigadores están más interesados. A pesar de las limitaciones inherentes de la detección siRNA, en particular, los falsos positivos causados por siRNA fuera de objetivo efectos, la identificación de auténticos nuevos reguladores de las vías en cuestión superan estas deficiencias, que pueden ser superadas mediante la realización de una serie de experimentos de control llevadas a cabo cuidadosamente.
Introducción
La modificación de proteínas con ubiquitina y ubiquitina-como las moléculas (Ubls) representa un sistema bioquímico expansiva que regula diversos procesos biológicos y las respuestas al estrés. La unión covalente de UBLs a sus proteínas diana puede tener diversos resultados que regulan la estabilidad, la localización, función o interactoma del sustrato 1. Los pasos enzimáticos subyacentes UBL modificación se establecieron por primera vez para la ubiquitina, y ahora sirven como paradigma para la modificación con la mayoría de UBLs, incluyendo SUMO, NEDD8, ISG15 y FAT10. Para que se produzca la modificación, el grupo carboxilato del motivo diglicina UBL se a....
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Protocolo
1. Fase de Desarrollo de Ensayos
Nota: antes de iniciar la pantalla de siRNA, una etapa de desarrollo de ensayos es fundamental establecer parámetros importantes para el cribado con el reportero línea celular. Es esencial invertir esfuerzo importante en esta etapa, ya que será la base del futuro éxito de la pantalla.
- Para caracterizar la hipoxia-capacidad de respuesta de U20S-HRE reportero línea celular, creciendo 2 x 75 cm 2 frascos de células U20S-HRE a 80-90% de confluencia en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS.
- Aspirar los medios de comunicación de un matraz de célu....
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Resultados
Antes de la detección, se establece la hipoxia-respuesta de las células U20S-HRE. Células U20S-HRE expresan un constructo indicador que consiste en la luciferasa de luciérnaga fundida aguas abajo de tres copias en tándem del elemento de respuesta a la hipoxia, que está obligado por el heterodímero HIF1A/HIF1B tras la exposición a la hipoxia (Figura 1A). Las células se colocan en una estación de trabajo hipoxia para una serie de veces para establecer que la exposición hipoxia produce la respuesta más efi.......
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Discusión
El uso de pantallas de siRNA en todo el genoma de células de mamíferos se ha demostrado ser de gran valor en la identificación de nuevos reguladores de las vías biológicas distintas. Aquí, hemos descrito el uso de una pantalla de ARNsi ubiquitome dirigido a identificar reguladores de la respuesta celular mediada por HIF1A a la hipoxia. Pantallas dirigidas están volviendo cada vez más atractivo, ya que son generalmente más baratos, más rápidos, más fáciles de manejar y un informe sólo sobre los componentes de la vía en l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust, GlaxoSmithKline (GSK) y el Instituto Escocés de Señalización Celular (ahora parte de la fosforilación de la proteína MRC y la unidad Ubiquitylation).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dosificador de líquido automatizado | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| blanco Placa de ensayo de pared | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Película de placa transparente | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| biblioteca de siRNA | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Reactivo de transfección | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Suero Reducido Medio | Invitrogen | Optimem http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
Referencias
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10....
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Reimpresiones y permisos
