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Perfiles de expresión de microARN de las células iPS humanas, de la retina del epitelio pigmentario Derivado de Ips y Fetal epitelio pigmentario de la retina

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DOI:

10.3791/51589

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24 de junio de 2014

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1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research, JBSA Fort Sam Houston

En este artículo

Resumen

El perfil de madre humanas pluripotentes inducidas (iPS), el epitelio pigmentario de la retina (RPE) derivadas de células (iPS) (iPS-RPE) inducido por el hombre-madre pluripotentes, y RPE fetal microRNA (miRNA), fueron comparados.

Resumen

El objetivo de este informe es describir los protocolos para la comparación de los perfiles de las células (iPS), el epitelio pigmentario de la retina (EPR) inducido por el hombre-pluripotentes madre derivadas de células iPS humanas (iPS-RPE), y RPE fetal microRNA (miRNA). Los protocolos incluyen la entrega de ARN para el análisis de microarrays y el análisis de datos de microarrays para identificar miRNAs que son expresados ​​diferencialmente entre los tres tipos de células. Se explican los métodos de cultivo de células iPS y RPE fetal. El protocolo utilizado para la diferenciación de RPE de iPS humanas también se describe. La técnica de extracción de ARN se describe fue seleccionada para permitir la recuperación máxima de muy pequeño ARN para su uso en un microarray de miARN. Por último, se explica vía celular y el análisis de redes de datos de microarrays. Estas técnicas facilitar la comparación de los perfiles de miARN de tres tipos de células diferentes.

Introducción

Las células madre tienen la capacidad de replicarse sin límite y el potencial de diferenciarse en cualquier tipo de célula somática. El desarrollo de técnicas para reprogramar células somáticas en células madre pluripotentes ha despertado gran expectación en la comunidad científica y entre los médicos, ya que el advenimiento de la regeneración del tejido personalizado está en el horizonte 1. Las células madre pluripotentes inducidas por el (iPS) presentan las mismas características del potencial de replicación ilimitado y pluripotencia como las células madre embrionarias (ES) eludiendo los dilemas éticos asociados con los CES. Además, las células madre derivadas de paciente no estimular una respuesta inmune, incrementando en gran medida la probabilidad de aplicaciones terapéuticas exitosas 2-3. Bajo condiciones de cultivo específicas, las células iPS se ha demostrado que se diferencian en varios tipos de células diferentes in vitro, incluyendo los cardiomiocitos, neuronas, células beta pancreáticas, hepatocitos, y en el epitelio pigmentario de la retina (RPE) 4-12.

El RPE es una capa especializada de células epiteliales pigmentadas situados en la parte posterior de la retina que realiza varias funciones que son esenciales para la salud visual y función tal como la absorción de luz parásita, la fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores, y el procesamiento de los retinoides para la producción de cromóforo visual. La disfunción del EPR debido al daño o la enfermedad afecta profundamente la salud de los fotorreceptores y la función visual como lo demuestran las enfermedades que causan ceguera que son el resultado de la patología EPR subyacente, como la degeneración macular senil (AMD), la enfermedad de Stargardt y la retinitis pigmentosa (RP) 13. Tratamientos verdaderamente eficaces que pueden restaurar la visión no se han alcanzado, y la sustitución de RPE enferma con RPE saludable puede ser la mejor opción para evitar la pérdida de la visión 14-15. RPE derivadas de iPS (IPS-RPE) es una posible fuente de células para reemplazar el EPR dañado. iPS-RPE expresa caracproteínas RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF y RPE65; muestra la alta pigmentación morfología RPE hexagonal clásica; y lleva a cabo las funciones del EPR como la fagocitosis, procesamiento de retinoides, y la secreción de 11 - 5,16 retinal cis. Sin embargo, antes iPS-RPE puede ser utilizado terapéuticamente, el IPS-RPE se debe caracterizar a fondo. La comprensión de los factores que gobiernan la diferenciación de RPE es necesario mejorar el rendimiento y la pureza de las células para ser utilizado para aplicaciones clínicas.

La diferenciación celular es el resultado de la expresión génica altamente regulado. Remodelación epigenética del genoma y la coordinación de factores de transcripción se requiere para las decisiones del destino celular que se producen durante la diferenciación y el desarrollo 17. Reglamento de ARN mensajero (ARNm) Traducción por microRNA (miRNA) presenta otro nivel de regulación que afecta el destino celular 1. MiRNAs son cortos, ~ 22 nt, longitudes de nucleótidos que, o bien la traducción de supresión porla unión a la 3 'UTR del ARNm diana o el ARNm de la degradación. MiRNAs se han detectado en prácticamente todos los tejidos y hasta la fecha más de 2.000 microARNs humanos únicos se han registrado en la base de datos miRBase. Desde miRNAs requieren complementariedad parcial para unirse al ARNm diana, un solo miARN potencialmente puede obligar a decenas o cientos de objetivos, y viceversa, es decir, un único mRNA puede ser objetivo de varios miRNAs diferentes. Esta característica de unión promiscua aumenta dramáticamente el nivel de complejidad de la regulación, así como el nivel de dificultad de determinar las funciones de miRNAs individuales y el papel que desempeña cada uno en las funciones celulares 18-21. Sin embargo, los estudios han demostrado que los miRNA refina la expresión génica durante la diferenciación, al afectar el estado de metilación del ADN 17. En un estudio más específico de la RPE, miR-204/211 ha demostrado promover el fenotipo epitelial de la RPE 22. Otro grupo analizó el perfil de miARNde RPE durante la diferenciación de células madre embrionarias y reveló distintos conjuntos de miRNA se expresan durante el proceso de diferenciación 23. De hecho, los perfiles de miARN sin ambigüedades pueden distinguir tipos de células, incluyendo células madre embrionarias, células precursoras, y células diferenciadas terminalmente 24,25. Más de 250 miRNAs se expresan en la retina. Sobre la base de estos estudios, la hipótesis de que los miRNAs juegan un papel importante durante la diferenciación de RPE de iPS.

El objetivo de este informe es describir los protocolos para la diferenciación de RPE de IMR90-4 células iPS, colección de ARN para el análisis de microarrays y el análisis de datos de microarrays para identificar miRNAs que son expresados ​​diferencialmente entre los tres tipos de células, las células iPS , iPS-EPR y EPR fetal. El ARN total se extrajo a partir de cultivos de cada tipo de célula y se hibridó a un microarray miARN, que contiene sondas específicas para 1205 miRNAs humanos y 144 miRNAs virales. Los resultados de microarrays se comparand para determinar qué miRNAs fueron expresados ​​diferencialmente entre los diferentes tipos de células. miRNAs con 2 veces o más veces el cambio en la expresión fueron seleccionados para su posterior análisis. Un programa de software de análisis de miRNA se utilizó para identificar los posibles objetivos de los miRNAs expresados ​​diferencialmente y generar redes celulares reguladas por los miRNAs seleccionados.

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Protocolo

1. Preparación de Cultura Reactivos y Placas de cultivo

  1. medios mTeSR1: Preparar medios mTeSR1 acuerdo a las instrucciones del fabricante. Descongelar 100 ml de suplemento mTeSR1 5x noche a 4 ° C. Añadir los 100 ml de suplemento mTeSR1 5x 400 ml de mTeSR1 medios basales y mezclar bien. Este medio es estable a 4 ° C durante hasta 2 semanas y a -20 ° C durante 6 meses.
  2. Medio de diferenciación: Preparar medio de diferenciación en DMEM/F12 para producir 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 2,0 mM de L-glutamina, 10% de suero de nocaut, y 10 mg / ml de gentamicina.
  3. medios IPS-RPE: Preparar medios IPS-RPE en MEM para producir suplemento N1 1x, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 250 mg / ml de taurina, sal de sodio triyodo-L-tironina 13 ng / ml, 20 ng / ml de hidrocortisona, 5 g / ml de gentamicina, y 15% de FBS 26.
  4. Triyodo-L-tironina sal sódica solución madre. Para preparar la solución madre se disuelven 1,0 mg de triyodo-L-tironinasal de sodio de 1 N de hidróxido de sodio girando suavemente. A continuación añadimos 49,0 ml de medio de base para hacer 50,0 ml de 20 mg / ml de sal de sodio triyodo-L-tironina. Preparar alícuotas y congelar a -20 ° C hasta que se necesite. Utilice volumen apropiado para alcanzar la concentración deseada en medios de cultivo final.
  5. La hidrocortisona solución madre: Para preparar una solución de hidrocortisona, solubilizar 1 mg de hidrocortisona en 1 ml de etanol absoluto por agitación suave. A continuación añadimos 19,0 ml de medio de base de 20 ml de hidrocortisona solución madre de 50 mg / ml. alícuota y congelar a -20 ° C hasta que se necesite. Utilice volumen adecuado para conseguir la concentración deseada en los medios de cultivo final.
  6. Medio de crecimiento EPR fetal. Preparar el medio de crecimiento mediante la mezcla de todos los reactivos en el kit RTEGM en el medio basal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto para el FBS.
  7. Medio de siembra RPE Fetal. Preparar los medios de recubrimiento mediante la transferencia de una pequeña cantidad de medio de crecimiento a un recipiente estéril y unFBS dd para una concentración final de 2%.
  8. Dispasa: Preparar la solución de trabajo de dispasa de 1 mg / ml en DMEM/F12.
  9. Matrigel recubierto de placas: Preparar Matrigel en DMEM/F12 a 0,08 mg / ml.
  10. Cubra cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1,0 ml de la solución de matrigel.
  11. Incubar las placas recubiertas a temperatura ambiente durante 1,0 h.
  12. Después de la incubación de 1,0 horas, aspirar el exceso de DMEM/F12.
  13. Añadir 0,5 ml de medio mTeSR1 para evitar la desecación. Las placas Matrigel recubiertos ya están listos para su uso.

2. IPS Cultura

  1. Antes de la siembra de células iPS tienen todos los tubos, cálida medios mTESR1 a temperatura ambiente, y las placas Matrigel recubierto listos.
  2. Descongelar rápidamente las células iPS IMR90-4 en un 37 ° C baño de agua. A continuación, retire el vial del baño de agua y esterilizar utilizando etanol al 70%.
  3. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml usando una pipeta de 2 ml para minimizar la rotura de los agregados de células.
  4. Añadir gota a gota 5 ml de warm medios mTeSR1 a las células y mezclar suavemente. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante.
  5. Resuspender cuidadosamente los agregados de células en 2 ml de medio mTeSR1 y sembrar las células en un pocillo de una placa de seis pocillos.
  6. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° y la cultura con 5% de CO 2, 95% de humedad.
  7. Cambie el medio de cultivo de células iPS a diario. Colonias indiferenciadas aparecerán 5-7 días después de la siembra. Compruebe si hay colonias indiferenciadas que están listos para el paso (colonias con un centro denso).

3. Pases de células iPS

  1. Antes de principio a paso las células iPS, han todos los tubos, la solución de dispasa, medio DMEM/F12 y mTERS1 calentó a temperatura ambiente, y el matrigel recubierto de placas listo.
  2. Antes de pases de células iPS, quitar cualquier áreas de diferenciación mediante el raspado de la zona y la aspiración de los medios de comunicación. Diferenciación debe permanecer por debajo de 20% del pozo para altaculturas calidad. Enjuagar cuidadosamente el bien con 2 ml de DMEM/F12 que contiene células iPS y añadir 1 ml de 1 mg / ml de dispasa a cada pocillo.
  3. Incubar a 37 ° C durante 7 min. Aspirar el dispasa y enjuagar suavemente las colonias de células con 2 ml de DMEM/F12 dos veces.
  4. Después de aclarar, añadir 2 ml de mTSER1 a cada pocillo.
  5. Con una pipeta 5 ml raspar suavemente las colonias de la placa para formar agregados.
  6. Transferencia de las colonias separadas a un tubo cónico de 15 ml. Añadir suficientes medios mTeSR1 para sembrar el siguiente paso de las células.

4. La diferenciación de las células iPS para iPS-RPE

  1. Placa de las células iPS en un plato recién revestido en medios mTESR1.
  2. Permitir a las colonias de células iPS para expandir durante 4-5 días en cultivo.
  3. Soportes de sustitución mTeSR1 con medios 4 ml diferenciación. Cambiar la mitad de los medios cada 3 días.
  4. Permitir focos pigmentadas crezcan lo suficientemente grandes como para ser disecados manualmente fuera de la cultura (40-50 días).
  5. Utilice un200 l punta de la pipeta para cortar alrededor y levantar las colonias pigmentadas.
  6. Recopilar y poner en común las colonias disecados en un tubo cónico de 15 ml.
  7. Añadir a continuación 5 ml de DMEM/F12 a las células del EPR agrupados y centrifugar a 300 xg durante 5 minutos dos veces.
  8. Prepare una solución de una sola célula incubando el combinado iPS-RPE con 0,25% de tripsina EDTA.
  9. Enjuague las células iPS-RPE con medios iPS-RPE y placa las células recogidas en un Matrigel recubierto bien en 4 ml de medio iPS-RPE fresco.
  10. Cultivar las células durante 3 semanas antes de la aprobación. Cambie los medios de comunicación cada 3 días. Para el experimento, placa iPS-RPE a 100.000 células / cm 2. Recoger las células en el día 17. Contar el día de la siembra, como el Día 0.

5. Toma de Muestras

  1. iPS celular Collection
    1. Cultura de las células iPS hasta que se observaron colonias indiferenciadas a ser denso en el centro.
    2. Enjuague las colonias en DMEM/F12.
    3. Disociarse en células individuales utilizando accutas e. Recoger las células en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Volver a suspender en 2 ml de DMEM/F12.
  2. Fetal RPE Collection
    1. Enjuague cultivos de células fetales de RPE con DMEM/F12 y disociarse en células individuales utilizando 0,25% tripsina EDTA.
    2. Recoger las células en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Volver a suspender en 2 ml de DMEM/F12.
  3. iPS-RPE celular Collection
    1. Cuando el IPS-RPE llegar paso 3 y el paso 5, recoger las células en el día 17 después de la aprobación. Enjuague IPS-RPE dos veces en PBS y preparar una suspensión de células individuales por incubación con 1,0 ml de 0,25% de tripsina.
    2. Neutralizar la tripsina con 2 ml de hielo fría los medios iPS-RPE.
    3. Recoger las células en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
    4. Resuspender la suspensión de células en 3 ml de tampón de tinción de kit de microperlas.
ve_title "> 6. Negativo Selección de iPS-RPE para eliminar las células no diferenciadas

  1. Mantenga todos los reactivos a 4 ° C hasta su uso, pero no funcionan en el hielo. Centrifugar la suspensión celular de la etapa 5.3.4 a 300 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
  2. Resuspender las células en 100 l de tampón de tinción de kit microbead por 2 x 10 6 células.
  3. Añadir 10 l de anticuerpo anti-TRA-1-60-PE por 2 x 10 6 células.
  4. Mezclar bien e incubar a 4 ° C durante 10 min.
  5. Lavar las células en 1-2 ml de tampón por 2 x 10 6 células. Centrifugar durante 10 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante.
  6. Resuspender las células en 80 l de tampón de tinción por 2 x 10 6 células. Añadir 20 l de microperlas anti-PE etiquetados (del kit) por 2 x 10 6 células. Mezclar bien. Incubar durante 15 min a 4 ° C.
  7. Añadir 1-2 ml de tampón de tinción por 2 x 10 6 células. Centrifugar durante 10 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante.
  8. Resuspender las células en 500 y #956; l de tampón de tinción.
  9. Separación celular magnética:
    1. Colocar la columna en clasificador de células magnético. Enjuaga la columna con 3 ml de tampón de tinción.
    2. Aplicar la suspensión de células de 6,8 en la columna.
    3. Colocar un tubo en el puerto negativo para recoger las células negativas TRA-1-60.

7. ARN total Extracción

  1. Lyse las células mediante la ejecución de las muestras a través de una columna de mini homogeneizador microcentrífuga giro comercial, diseñado para minipreps ácidos nucleicos.
  2. Extraer el ARN total de las células iPS, iPS-EPR y EPR fetal con el kit de extracción de ARN disponible comercialmente diseñado para preservar las pequeñas moléculas de ARN 27.
  3. Determinar las concentraciones de ARN total utilizando un espectrofotómetro Nanodrop.

8. Bioanalyzer y microarrays de ensayo

  1. Compruebe la integridad del ARN con Bioanalyzer junto con el kit de ARN de calidad disponible en el mercado.
  2. Incubar 100 ng deARN total con fosfatasa intestinal de ternero a 37 º C durante 30 min
  3. Desnaturalizar el ARN usando 100% de DMSO a 100 ° C durante 5 min.
  4. Etiquetar las muestras con PCP-Cy3 usando ligasa T4 de incubación a 16 ° C durante 1 hora.
  5. Hibridar en un formato 8_x_15K array miRNA humano.
  6. Lavar las matrices de acuerdo con las instrucciones del fabricante y escanear a una resolución de 5 micras utilizando un escáner.
  7. Adquiera datos utilizando la función de microarray software de extracción compatible con el microarray miRNA.
  8. Procesar las señales de miARN para determinar el nivel relativo de expresión en cada muestra.
  9. Comparar los niveles de expresión de cada uno de los genes miARN entre los grupos de la muestra. Seleccionar miRNAs con la expresión diferencial de al menos dos veces para su posterior análisis.
  10. El uso de software disponible en el mercado para el análisis de datos, siga las instrucciones para generar mapas de calor para la visualización de miRNAs expresados ​​diferencialmente 28.

9. Pathway Analysis

  1. Guarde los datos de los miRNAs seleccionados en 8.9 en formato Excel.
  2. Inicie sesión en el programa de análisis de vías de ARN en línea. Sube el archivo de Excel. Seleccione "Formato flexible" para el formato de archivo y seleccione "Agilent" de la lista desplegable de tipo de identificador.
  3. En la sección de datos en bruto, asigne "ID" para sondear la columna ID y asignar "Observación 1" y "log relación" a la columna de la ración de registro. Seleccione "ignorar" para el resto de las columnas.
  4. Seleccione los parámetros para el análisis de la siguiente manera: Confianza: sólo experimentalmente observada; incluir relaciones directas e indirectas; e incluir productos químicos endógenos; Seleccione la base de conocimiento de Ingenuity como el conjunto de referencia. Elige la base de datos de moléculas de referencia que incluye los datos de todas las especies, todas las líneas de células y tejidos, y todas las mutaciones.
  5. Red Ejecutar y vía de análisis.

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Resultados

Las células iPS (Figura 1A) se cultivaron en condiciones de diferenciación para inducir la diferenciación en células iPS-RPE. El IPS-RPE RPE exhibió fenotipo clásico de la morfología de las células pigmentadas hexagonal (Figura 1B) similar al EPR fetal (Figura 1C).

Para entender mejor el papel que los miRNA puede jugar durante el proceso de diferenciación de iPS a iPS-RPE, se llevó a cabo el análisis de microarrays de expresión de miRNA. El ...

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Discusión

En conclusión, este informe se describen los métodos utilizados para cultivar las células iPS, iPS-EPR y EPR fetal. RPE derivadas de iPS son morfológicamente y funcionalmente similar al EPR fetal. El IPS-RPE también expresa los genes característicos de RPE incluyendo RPE65, CRALBP, PEDF y LRAT 16. Para caracterizar adicionalmente estas células, el ARN se extrae y se utiliza para realizar el análisis de microarrays para identificar diferencialmente expresado genes miARN. El análisis de las intensidades de seña...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son las opiniones privadas de los autores y no deben interpretarse como funcionario o como el reflejo de las opiniones del Departamento del Ejército o el Departamento de Defensa.

Esta investigación se lleva a cabo mientras los autores Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, y Ramesh R. Kaini celebraron una Postdoctoral Research Associateship Consejo Nacional de Investigación en el USAISR.

Ensayos de microarrays se realizaron por la Infancia Greehey Instituto de Investigación del Cáncer Microarray Core Facilidad Departamento de Bioinformática en la UT Health Science Center de San Antonio.

Este trabajo fue apoyado por el Programa del Ejército de EE.UU. de Medicina Clínica de Rehabilitación de Investigación (CRMRP) y el Programa de Investigación de Medicina Militar Operacional (MOMRP).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
mTeSR1 media + suplemento 5XStem Cell Technologies5850
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-β-mercaptoetanolSigmaM-7154
Aminoácidos no esencialesHyclone(Fisher)SH30853.01
Reemplazo de suero knockoutLife Technologies10828-028
Gentamicina Life Technologies15750-060
MEM mediaLife Technologies10370-021
N1 suplementoSigmaN-6530-5ML
TaurinaSigmaT-8691-25G
HidrocortisonaSigmaH0888-1G
Suero fetal bovinoHyclon (Fisher)SH3008803HI
Sal sódica de triyodo-l-tironinaSigmaT6397
Hidróxido de sodioSigmaS5881
Medios de EPR fetales Kit RTEGMLife Technologies195406
DispasaLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Solución salina tamponada con fosfatoHyclon (Fisher)10010-023
TripsinaHyclone(Fisher)25200-072
Miltenyi Biotec tampón de lavadoStemGent130-092-987
Miltenyi Biotec tampón de enjuagueStemGent130-092-222
Anti-TRA-1-60 kit de microperlasStemGent130-095-816
Miltenyi Biotec columna clasificadora de célulasStemGent130-021-101
RNeasy micro kitQiagen74004
QIA trituradoraQiagen79654
RNA 6000 Pico LabChip kitAgilentG2938-90046
Microarray de miARN humano v16AgilentG4471A

Referencias

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