Desarrollo de amelogenina-quitosano hidrogel para<em&gt; In Vitro</em&gt; Esmalte Recrecimiento con una interfaz Dense

Resumen

En este artículo, se describe un protocolo para fabricar un hidrogel amelogenina quitosano para la reconstrucción del esmalte superficial. Organizado en el crecimiento in situ de los cristales de apatita en el hidrogel formado una densa interfaz de esmalte-restauración, lo que mejorará la eficacia y durabilidad de las restauraciones.

Resumen

La reconstrucción biomimética del esmalte es un tema importante en la ciencia de los materiales y la odontología como un enfoque novedoso para el tratamiento de la caries dental o la erosión. Se ha demostrado que la amelogenina es una proteína crítica para controlar el crecimiento organizado de los cristales de apatita. En este artículo, presentamos un protocolo detallado para la reconstrucción superficial del esmalte mediante el uso de un nuevo hidrogel de amelogenina-quitosano. En comparación con otros tratamientos convencionales, como el flúor tópico y el enjuague bucal, este método no solo tiene el potencial de prevenir el desarrollo de caries dental, sino que también promueve una restauración significativa y duradera del esmalte. La microestructura organizada similar al esmalte regulada por ensamblajes de amelogenina puede mejorar significativamente las propiedades mecánicas del esmalte grabado, mientras que la densa interfaz esmalte-restauración formada por un rebrote in situ de cristales de apatita puede mejorar la eficacia y durabilidad de las restauraciones. Además, el hidrogel de quitosano es fácil de usar y puede suprimir la infección bacteriana, que es el principal factor de riesgo para la aparición de caries dental. Por lo tanto, este hidrogel de amelogenina-quitosano biocompatible y biodegradable se muestra prometedor como biomaterial para la prevención, restauración y tratamiento del esmalte defectuoso.

Introducción

El esmalte dental es la superficie dura mineralizada de los dientes humanos. Está compuesto por numerosos cristales de apatita en forma de aguja, que se agrupan en prismas organizados y paralelos para garantizar la resistencia mecánica única y la protección biológica que proporciona el esmalte^1-2. A diferencia de otros tejidos mineralizados, como el hueso y la dentina, el esmalte maduro es acelular y no puede regenerarse después de una pérdida sustancial^de minerales, que a menudo ocurre como caries dental o erosión. Los productos disponibles en el mercado, como los barnices que contienen flúor, las pastas dentales y los enjuagues bucales, son eficaces para remineralizar el esmalte, pero ninguno de ellos tiene el potencial de promover la formación de cristales de apatita organizados. Clínicamente, el tratamiento convencional para la reparación del esmalte implica un procedimiento de relleno con materiales artificiales como amalgama, cerámica ^{o resina} compuesta. Sin embargo, estos materiales no suelen interactuar bien con el tejido natural que rodea la lesión, ya que sus estructuras, componentes y propiedades son diferentes a las del esmalte natural. Como resultado, la caries secundaria se desarrolla con frecuencia con el tiempo en la interfaz entre el diente y materiales extraños. Por lo tanto, el recrecimiento in situ del esmalte con una interfaz densa es un objetivo atractivo para los campos de la ciencia de los materiales y la estomatología. Una forma particularmente prometedora de lograr este propósito es la síntesis biomimética de material similar al esmalte en la superficie del esmalte. Recientemente, se han realizado numerosos intentos in vitro para preparar materiales similares al esmalte utilizando sistemas biomiméticos que contienen nano-apatitas o diferentes aditivos orgánicos ^4-12. Sin embargo, el desarrollo de la estrategia biomimética óptima para promover la remineralización de los cristales para lograr una interfaz densa perfecta sigue siendo un desafío.

Durante la mineralización del esmalte, el crecimiento orientado y la elongación de los cristales de apatita están regulados por una matriz rica en amelogenina ^1,13-14. Para imitar la matriz orgánica en el desarrollo del esmalte, aquí describimos un protocolo detallado para la fabricación de un hidrogel de amelogenina-quitosano (CS-AMEL) para el recrecimiento del esmalte in situ en una superficie de esmalte grabada al ácido utilizada como modelo para lesiones erosivas. Como "el medio de crecimiento más versátil" para los cristales ¹⁵, las matrices de hidrogel tienen una ventaja sobre un sistema de solución, ya que clínicamente son más fáciles de manejar. Además, CS-AMEL es biocompatible, biodegradable y tiene propiedades antimicrobianas y de adhesión únicas que se comparan favorablemente con otros sistemas biomiméticos para aplicaciones dentales ¹⁶. Es importante destacar que la mineralización in situ de los cristales de apatita en la superficie del esmalte proporciona una interfaz densa entre la capa reparada y el esmalte natural, lo que puede mejorar potencialmente la durabilidad de las restauraciones y prevenir la formación de nuevas caries en el margen de la restauración.

Protocolo

Los molares humanos se extrajeron siguiendo los procedimientos estándar para la extracción de la Escuela Ostrow de Odontología de la Universidad del Sur de California y manipulados con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional.

1. Preparación del Diente grabado con ácido, Slice

1. Seleccionar un tercer molar humano sin ningún tipo de caries restaurados.
2. Retire la parte de la raíz del molar, y cortar la corona del molar longitudinalmente en rodajas de 2 mm de grosor utilizando una sierra de diamante de baja velocidad refrigerado por agua. Ultrasonidos limpiar estas rodajas durante 2 minutos, y luego enjuague con agua desionizada 3 veces.
3. Para simular lesiones erosivas, grabar las rodajas de dientes con un 30% de ácido fosfórico durante 30 segundos luego enjuagar inmediatamente con agua desionizada.
4. Ultrasonidos limpiar las rodajas grabadas durante 2 minutos, y luego enjuague con agua desionizada 3 veces.

2. Preparación de amelogenina-quitosano hidrogel

1. PREPARACIÓNn de la solución madre quitosano
   1. Disolver 1% (w / v) de quitosano (peso molecular medio, 75-85% desacetilado) en una solución al 1% (v / v) de ácido acético seguido de agitación a 80 ° CO / N.
   2. Después de enfriar la solución a TA, se filtra la solución de quitosano utilizando un filtro de 0,45 micras. Ajustar el valor de pH a 5,0 mediante la adición de solución 1 M de NaOH.
2. Preparación de calcio y la solución de stock de fosfato (0,1 M)
   1. Pesar de cloruro de calcio _(CaCl2) y preparar una solución de 0,1 M, a continuación, mezclar usando un vórtice hasta que la solución es clara. Ajustar el valor de pH a 11 mediante la adición de solución 1 M de NaOH.
   2. Pesar de fosfato de sodio dibásico (Na ₂ HPO ₄₎ y preparar una solución de 0,1 M, a continuación, mezclar usando un vórtice hasta que la solución es clara.
3. Expresión y purificación de amelogenina recombinante ^17-18
   La amelogenina recombinante de longitud completa de porcino (rP172) utilizado aquí tiene 172 aminoácidos y es un análogo de la plenaDe longitud P173 porcina natural, pero que carece de la metionina N-terminal, así como un grupo fosfato en Ser16 ^18.
   1. Añadir 20 g de caldo de Lisogenia (LB) polvo de agar en 500 ml de agua desionizada, la solución en autoclave a 121 ° C (ajuste de líquido) durante 20 min. Deje enfriar el agar a ~ 55 ° C, añadir ampicilina (100 mg / ml) en solución de agar.
   2. Transferir la solución de agar a placas de Petri, que cada plato fresco hasta que esté sólido, y luego la vuelta para evitar la condensación en el agar. Placas, almacenarlas en bolsas de plástico a 4 ° C.
   3. Racha de la placa de agar LB con células recombinantes (E. coli-FC21) de la solución madre en glicerol (-80 ° C). Las placas se incuban O / N a 37 ° C.
   4. Preparar 50 ml de medio NZCYM y esterilizar en autoclave los medios de comunicación a 121 ° C durante 30 min. Permita que el medio se enfríe, añadir 50 l de 100 mg / ml de ampicilina a 50 ml de medio.
   5. Inocular una sola colonia de la placa de agar LB en los medios de comunicación NZCYM 50ml suplementado con ampicillpulg incuban las células O / N en una incubadora de agitación a 37 º C.
   6. Preparar 1 l de medio NZCYM y los medios de comunicación en autoclave a 121 ° C durante 30 min. Añadir 1 ml de 100 mg / ml de ampicilina a 1000 ml de medio. Tome una densidad óptica (DO) como blanco utilizando un espectrofotómetro UV-Vis. NOTA: No se deshaga de esto después de la primera lectura.
   7. Inocular 10 ml de cultivo celular de la etapa 2.3.5 en 1000 ml de medios de comunicación desde el paso 2.3.6. Lea la densidad óptica a 595 nm inmediatamente después de la inoculación. Tome la lectura de la densidad óptica periódicamente para hacer un seguimiento del crecimiento. NOTA: Lea el blanco cada vez que se toma la OD.
   8. Inducir con 700 l de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 1 M) cuando el crecimiento bacteriano llega a alrededor de 0,75 ~ 0,8 OD a 595 nm.
   9. Recoger las células cuando el OD alcanza 1,1. Verter el contenido del matraz a 6 botellas de plástico. Balanzas y pesar las botellas antes de utilizar la centrífuga. Centrifugar durante 20 minutos a 8554 xga 4 º C.Mantenga el sedimento celular en el -20 ° CO / N.
   10. Saque los sedimentos celulares y combinarlos en un tubo de 50 ml. Añadir 3,5 ml de HCl de guanidina 4M por l de fermentación. Veces Sonicar 2-3 sobre hielo, 30 segundos cada vez, con intervalos de 1 min.
   11. Hacer diluciones 6x de volumen de células con ácido fórmico al 0,5% y dejar que se revuelva en la cámara fría durante 2 horas. Centrifugar durante 30 min, 8554 xga 4 º C. Mantenga el sobrenadante. Añadir sulfato de amonio saturado al 20% utilizando la solución madre saturadas y revuelo en la sala fría, O / N.
   12. Centrifugar durante 30 min, 8.554 xg a 4 ° C y mantener el sedimento. Reconstituir los pellets en 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), la carga en una columna C4 (10 x 250 mm, 5 micras), y fraccionar utilizando un gradiente lineal de A = 0,1% de TFA y B = 60% de acetonitrilo en TFA, en un tasa de 1,5 ml · min ^-1 fluir.
   13. Congelar la solución de proteína en hielo seco y liofilizar la congelada muestra O / N.
4. Preparación de amelogenina-quitosano (CS-AMEL) hydrogEL (Figura 1A)
   1. Añadir 200 g de rp172 en un tubo que contiene 960 l de solución de quitosano al 1%, a continuación, mezclar usando un vórtice hasta que la solución es clara.
   2. Añadir 25 l de solución de CaCl M 0,1 ₂ seguido por 15 l de 0,1 M de Na ₂ HPO ₄ solución a la solución de quitosano que contiene amelogenina-, a continuación, mezclar usando un vórtice durante 5 min.
   3. Ajustar el pH de la solución de CS-AMEL a 6,5 ​​por adición cuidadosa de solución 1 M de NaOH. CS-AMEL hidrogel formará cuando el valor de pH alcanza 6,5.

3. Esmalte Recrecimiento en Amelogenin-quitosano hidrogel

1. Preparación de la solución de saliva artificial
   1. Disolver una cierta cantidad de cloruro de magnesio _(MgCl2, 0,2 mM), cloruro de calcio _(CaCl2, 1 mM), fosfato dihidrógeno de potasio (KH ₂ PO _4, 4 mM), cloruro de potasio (KCl, 16 mM) y cloruro de amonio ( _NH4Cl, 4,5 mM) en 20 mM de HEPES(4 - (2-hidroxietil) piperazina-1-etano-sulfónico) tampón ^12.
   2. Ajustar el pH a 7.0 con 1 M de NaOH y almacenar la solución de saliva artificial a 4 ° C.
   3. Antes de utilizar la solución, agregar fluoruro de sodio (NaF, 300 ppm).
2. Aplicación de la CS-AMEL hidrogel
   1. Aplicar sobre 20 l de hidrogel CS-AMEL a la rebanada diente se graban mediante una jeringa (Figura 1B).
   2. Secar la rebanada diente de hidrogel cubierto en un desecador a temperatura ambiente durante 2 h.
   3. Transferir la rebanada diente a un vaso de precipitados que contiene 30 ml de solución de saliva artificial. Cubrir el vaso con papel de aluminio, y luego mantener el vaso de precipitados en un horno a 37 ° C durante 7 días.
   4. Retire el trozo de diente y secarlo en un desecador a temperatura ambiente.

4. Caracterización de la interfaz entre la capa recién cultivado y esmalte

La microestructura de la interfaz entre la capa recién crecido y esmalte fue observaciónved por microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión de alta revolución (HR-TEM). La muestra de TEM se preparó usando un haz de iones enfocado técnica (FIB), los pasos para los que son de la siguiente manera.

1. Cargue la muestra en un instrumento FIB-SEM y terminar todas las alineaciones de acuerdo a las instrucciones de funcionamiento. NOTA: El ajuste de Z Fine se debe realizar por lo menos 2 veces.
2. Depositar una capa de carbono (15 × 3 micras) sobre la muestra para proteger la estructura subyacente (Figura 2A).
3. Moler la muestra cuidadosamente en los lados superior, inferior y derecho de la capa de carbón para preparar una pieza delgada de la muestra y, a continuación, cortar la parte inferior de esta pieza delgada. NOTA: Compruebe la alineación del haz de iones antes de cada etapa de molienda (Figura 2B).
4. Weld una punta de Pt sobre la pieza fina y cortar la parte izquierda para separar la pieza de muestra (Figura 3C). NOTA: Compruebe la alineación del haz de iones antes de la etapa de soldadura.
5. Levante tque PT punta con la muestra lentamente, y montar la muestra laminar sobre una rejilla TEM lift-out.
6. Separe la punta de la muestra, y diluir la muestra hasta que su grosor es inferior a 100 nm (Figura 3D). Retire la muestra del instrumento para llevar a cabo la observación TEM. NOTA: Compruebe la alineación del haz de iones antes de cada proceso de adelgazamiento.

5. Evaluación de propiedades de unión y mecánicas de la capa recién Grown

1. La fuerza de unión se evalúa por tratamiento ultrasónico. Mantener la rebanada diente reparado en un limpiador de ultrasonidos (42 kHz, 100 W) durante 10 min, y a continuación, observar la interfaz entre la capa de esmalte natural y reparado con un análisis SEM de retrodispersión de electrones.
2. Medir la dureza y módulo elástico a 20 puntos de prueba en cada superficie del esmalte reparado (n = 3) por un nano-penetrador con una punta Berkovich.

6. Inmunofluorescencia La tinción

1. Lave el diente con slice Tris buffer solución salina (TBS) durante 15 min.
2. Bloque con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en TBS durante 15 min.
3. Eliminar el líquido y se incuba la muestra O / N con 1 ° Ab (1:500 pollo anti-amelogenina) diluido en TBS (0,1% de BSA, 0,3% de Triton X-100).
4. Lavar la muestra con TBS durante 30 min y se incuba O / N con 2 ° Ab (1:100 FITC anti-pollo) diluido en TBS.
5. Lavar la muestra con TBS durante 30 minutos y dejar secar durante otros 30 min.
6. Observar al microscopio de fluorescencia.

Resultados

La eficacia del protocolo descrito aquí se demuestra por microscopía electrónica de barrido (SEM), difracción de electrones área seleccionada (SAED) y difracción de rayos X (DRX) análisis. Después de la reparación por amelogenina-quitosano (CS-AMEL) hidrogel durante 7 días, se formó una capa similar al esmalte con un espesor de 15 micras en la superficie de esmalte grabado. La capa recién crecido-se hizo de matrices altamente ordenadas de cristales con un diámetro de ~ 50 nm, preferentemente creciente a lo largo del eje...

Discusión

Mientras que el contenido mineral del esmalte es alto por lo que es el tejido mineralizado más duro del cuerpo humano, este biocerámico es susceptible a los procesos de desmineralización, que suelen aparecer como caries dental o erosión. Las mutaciones genéticas también pueden hacer que el esmalte delgadas o blandas que conducen a una serie de enfermedades hereditarias de la malformación del esmalte llamado amelogénesis imperfecta ^20. Productos para el cuidado de la salud oral que contienen fluoruro ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tercer molar humano	Facultad de Odontología Ostrow de la Universidad del Sur de California	N/A	Los molares humanos se extrajeron siguiendo los procedimientos estándar de extracción en la Escuela de Odontología Ostrow de la Universidad del Sur de California y se manejaron con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional.
amelogenina de pocina recombinante	en laboratorio	N/A	rP172, de cuerpo entero
Chitosan	Sigma-Aldrich	448877	Peso molecular medio, 75-85%
de ácido fosfórico desacetilado	VWR	AA033266
Ácido acético glacial	VWR	A036289
Hidróxido de sodio	VWR	BDH9292
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	223506
Fosfato de sodio dibásico anhidro	VWR	BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP	Agilent Technologies Inc.
Sulfato de amonio	VWR	BDH8001
Ácido trifluoroacético	VWR	AAAL06374
Acetonitrilo	VWR	BDH1103
Cloruro de magnesio	VWR	BDH0244
Fosfato de dihidrógeno de potasio	VWR	BDH9268
Cloruro de potasio	VWR	BDH0258 Cloruro
de amonio	VWR	AAAA15000
HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etano-sulfónico)	VWR	AAA14777
fluoruro de sodio	VWR	AA11561
solución salina tamponada con Tris	Bio-Rad	170-6435	10× TBS
Albúmina sérica bovina	EMD Millipore	12659	CalBioChem, Albúmina, Suero Bovino, Fracción V, Bajo en Metales Pesados
Triton X-100	EMD Millipore	TX1568-1
Pollo Anti-Amelogenina	N/A	N/A	Un regalo del Prof. Malcolm Snead, Universidad del Sur de California
Bovino Anti-Pollo IgY-FITC	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2700
Sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento	Agilent Technologies Inc.	Columna Varian Prostar 210
C4	Phenomenx	Júpiter 5 μ 300A
Microscopía electrónica de barrido	JEOL	JSM-7001
FIB-SEM	JEOL	JIB-4500
Microscopía electrónica de transmisión	JEOL	JEM-2100F
Sierra de diamante digital de baja velocidad	MTI Corporation	SYJ-150
Microscopía de fluorescencia	Leica	DMI3000 B
Limpiador ultrasónico	Branson	2510	42 kHz, 100 W
Nano-indentador	Agilent Technologies Inc.	MTS XP