Transferencia de Protones y Proteína Conformación Dinámica de proteínas fotosensibles por Time resuelto-Step-scan transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojo

Resumen

Los pasos clave de la función de las proteínas, en particular los cambios conformacionales de la columna vertebral y las reacciones de transferencia de protones, a menudo tienen lugar en la escala de tiempo de microsegundos a milisegundos. Estos procesos dinámicos pueden estudiarse mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier de barrido escalonado resuelto en el tiempo, en particular para proteínas cuya función es desencadenada por la luz.

Resumen

Monitoreo de la dinámica de protonación y proteínas backbone cambios de conformación durante la función de una proteína es un paso esencial hacia la comprensión de su mecanismo. De protonación y conformacionales cambios afectan el patrón de vibración de las cadenas laterales de aminoácidos y del enlace peptídico, respectivamente, ambos de los cuales se puede probar por infrarrojos (IR) espectroscopia de diferencia. Para las proteínas cuya función puede ser repetitiva y reproducible provocada por la luz, es posible obtener espectros de diferencia de infrarrojo, con (sub) Resolución de microsegundos en un amplio rango espectral usando la técnica infrarroja paso a escanear la transformada de Fourier. Con ~ 10 ² -10 ³ repeticiones de la fotorreacción, el número mínimo para completar una exploración a una resolución espectral razonable y ancho de banda, el nivel de ruido en los espectros de diferencia de absorción puede ser tan bajo como ~ 10 ^{- 4,} suficiente para seguir la cinética de cambios de protonación de un único aminoácido. Inferiorlos niveles de ruido se puede lograr por más de promediado de datos y / o procesamiento matemático. La cantidad de proteína requerida para obtener resultados óptimos es entre 5-100 mg, dependiendo de la técnica de muestreo utilizada. En cuanto a requisitos adicionales, la proteína necesita ser concentrado primero en un tampón de fuerza iónica baja y después se seca para formar una película. La película de proteína se hidrata antes del experimento, o bien con pequeñas gotas de agua o bajo la humedad atmosférica controlada. El nivel de hidratación alcanzado (g de agua / g de proteína) se mide a partir de un espectro de absorción IR. Para mostrar la técnica, se estudió la fotociclo del bacteriorhodopsin la bomba de protones impulsada por la luz en su entorno membrana púrpura nativa, y del canal de iones canalrodopsina-2 la luz cerrada solubilizada en detergente.

Introducción

Para dilucidar plenamente cómo las proteínas realizan su función, se requiere para medir mientras trabajan, es decir, a lo largo de un camino de reacción que implica a menudo una serie de productos intermedios y se extiende varios órdenes de tiempo. Los pasos clave de la función de proteínas a menudo tienen lugar en el microsegundo de milisegundos rango de tiempo ^1, en ​​particular la columna vertebral cambios conformacionales y reacciones transferencias de protones en las proteínas de membrana. La cristalografía de rayos X, sin duda el pilar de la biología estructural, proporciona (promediada en el tiempo) densidades electrónicas estáticas de bienestar de difracción de cristales de proteína, muy difícil de crecer con proteínas de la membrana ^2. Un modelo atómico 3D puede ser construido en base a la densidad de electrones, aunque rara vez incluida la ubicación de los átomos de hidrógeno. El notable avance en la cristalografía de rayos X con resolución temporal, basándose ya sea en Laue difracción ³ o en pulsos de rayos X de femtosegundos ^4, añade la dimensión temporal a la gran información estructural eninherente a la cristalografía de rayos X ^5. Pero dejando a un lado desafíos técnicos y analíticos, la red cristalina puede afectar la columna vertebral cambios conformacionales y alterar la dinámica de proteínas, un inconveniente inevitable de métodos basados ​​en cristales de proteínas ^5. En consecuencia, los aspectos dinámicos de proteínas están aún mejor cubiertas por métodos ópticos, ya que por primera vez por el flash fotólisis ^6,7, aunque con el inconveniente general de visión estructural limitado.

Espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FT-IR) combina la resolución temporal de espectroscopias ópticas con una sensibilidad valiosa a la estructura de la proteína, la última característica explotada en innumerables investigaciones estructurales y funcionales estáticas en proteínas de la membrana ^8-11. En particular, la espectroscopia de diferencia FT-IR ha demostrado ser una herramienta ideal para estudiar pequeños cambios espectrales como tránsitos de proteínas de un estado metaestable a otro ^12-19.

Studies sobre la dinámica de proteínas, excepto en el único nivel de molécula ^20,21, requieren un proceso de activación para la sincronización. Una reacción está convenientemente inició rápida y no invasiva utilizando la luz como disparador, como se hizo en el estudio de las proteínas con fotorreacciones cíclicos. Un reto importante asociado con estudios de tiempo-resuelto es la consecución de suficiente resolución de tiempo manteniendo una buena resolución espectral y la relación adecuada de señal a ruido. También es esencial para cubrir una gama suficientemente amplia espectral y temporal. Paso de barrido Tiempo de resolver la espectroscopia FT-IR sobresale en todos estos aspectos ^22, con ejemplos publicados que cubren los rangos espectrales tan amplia como 3,900-850 cm ^-1 y la dinámica que se extiende ~ 9 órdenes de tiempo, con un máximo de 3,5 cm ^-1 espectral y 30 de la resolución temporal ns ^23-28.

Espectrómetros de transformación de Fourier de infrarrojos muestran ruido reducido y mayor precisión fotométrica sobre los dispersivos ^29. Sin emer, en el modo de grabación rápida exploración normal espectrómetros FT-IR sufren de un tiempo de resolución limitado a ≥ 5-10 mseg como consecuencia de el tiempo mínimo el espejo móvil del interferómetro requiere para completar una exploración. Con la técnica de paso de escaneado, en contraste, la dependencia del tiempo del evento dinámico está desacoplada de la duración de la exploración del interferómetro. En pocas palabras, el espejo se mueve móviles en pasos discretos en lugar de escanear continuamente para realizar la exploración. En cada uno de estos pasos el espejo (móvil) se mantiene fijo y un transitorio se registra. Por lo tanto, el tiempo de resolución está limitada por el tiempo de subida del mercurio de teluro de cadmio (MCT) detector, que está típicamente en el intervalo de 10-100 nseg. En la práctica, la gran gama dinámica del interferograma (que contiene una señal intensa en las señales centerburst y pequeños en las alas), requiere de digitalización adecuado un convertidor analógico / digital (ADC) con un máximo de 16 a 24 bits que lleva a un muestreo tasas no superiores a 200 kHz ~(5 microsegundos) ^30. Nanosegundo tiempo-resolución puede llevarse a cabo mediante la medición de sólo los cambios en el interferograma, para el que un bit ADC 8-12 es suficiente ^23,31-33. Aspectos técnicos ^30,34,35 y aplicaciones ^36-38 de paso-scan con resolución temporal se han discutido en detalle en otra parte.

El propósito de la contribución actual es proporcionar un protocolo que describe los aspectos prácticos de la etapa de exploración espectroscopía FT-IR resuelta en el tiempo en proteínas de la membrana fotosensibles. Aquí, el rendimiento de la técnica se muestra para dos métodos de muestreo: de transmisión y reflexión total atenuada (ATR). El uso de ATR, permite trabajar en la presencia de exceso de agua, que no sólo garantiza condiciones de hidratación completa para la proteína, pero también permite el control agudo de la muestra de pH y fuerza iónica ^49,50. Experimentos escanear a paso se ilustran en dos sistemas seleccionados: bacteriorrodopsina y canalrodopsina-2.

El bacteriorhodopsin bomba de protones impulsada por la luz (BR) ha sido objeto de numerosos estudios biofísicos para más de cuarenta años ^39,40, por lo que es la proteína de membrana mejor entendido hasta ahora. Entre las numerosas técnicas aplicadas al estudio de la funcionalidad bR espectroscopia FT-IR ha ejercido sin duda uno de los impactos más grandes. A saber, la espectroscopia FT-IR ha sido la clave para resolver los grupos involucrados en la transferencia de protones a través de la membrana como en otros lugares representaron ^13,41,51.

Canalrodopsina (CHR) es el primer canal de iones de luz cerrada que se encuentra en la naturaleza ^42,43. Luz de excitación de ChR conduce a la apertura transitoria de un canal iónico. Su descubrimiento se estableció el camino para el desarrollo de la optogenética, donde los procesos moleculares son controlados por la luz ^44,45. ChR pertenece, como bR, a la familia de rhodopsins microbiana pero en contraste con bR, y mucho menos se sabe acerca de su mecanismo funcional ^52. ChR2 combina su función como ion con la actividad del canal de protones bombeo ^46,47. Recientemente, hemos aplicado paso-scan espectroscopia FT-IR de resolución temporal para resolver las reacciones de transferencia de protones dentro de la proteína y la dinámica de las proteínas de backbone cambios de conformación en ChR2 ^48.

Protocolo

1. Aspectos generales de la muestra y la preparación del instrumento

1. Utilice un comercial espectrómetro FT-IR equipado para mediciones de paso-scan con resolución temporal. Para obtener los mejores resultados sitúan el espectrómetro FT-IR en la parte superior de una mesa de vibración desacoplado.
2. Evacuar el alojamiento óptico a unos pocos mbar. Purgar el compartimento de la muestra con aire seco o nitrógeno.
3. Coloque un material transparente IR opaco a la radiación visible en frente del detector MCT de la espectrómetro de FT-IR. Esta precaución es esencial para evitar los artefactos del pulso láser emocionante durante los experimentos paso del análisis. Nota: Utilizamos una germanio (Ge) ventana de 25 mm de diámetro. Su alto índice de refracción hace que la intensidad indeseable pierde, evitado en gran medida el uso de un filtro con recubrimiento antirreflectante Ge.
4. Enfriar el dewar detector MCT con nitrógeno líquido. Nota: Se prefiere el uso de detectores de MCT fotovoltaica sobre photoconductives debido a su respuesta lineal y, por lo tanto, photometr superioresIC exactitud y fiabilidad de línea de base ^31,53.
5. Pre-concentrar la muestra utilizada para los experimentos a por lo menos 2 mg de proteína / ml en un tampón de baja (<20 mM) fuerza iónica para evitar la formación de cristales de sal, mientras que el secado de la suspensión de proteína para formar una película de proteína homogénea. Cuando las muestras de sedimentos, lavar / concentrarlos aplicando ultracentrifugación (por ejemplo, proteínas de membrana en liposomas o en parches de membrana celular). Utilice centricons de corte adecuado para las proteínas que no lo hacen los sedimentos (por ejemplo, detergentes proteínas de membrana solubilizadas).
6. Para obtener resultados óptimos utilice: a) las preparaciones de proteína pura y activa como sea posible; b) las relaciones de lípido / proteína ≤ 3 en el peso de las proteínas en parches de membrana celular o reconstituidas en liposomas; c) las relaciones de detergente / proteína ≤ 1 en el peso de las proteínas solubilizados con detergente. Evitar el uso de detergentes o lípidos cuyas bandas de vibración se superponen con los de la proteína (por ejemplo, CHAPS).

2. Preparación del total atenuada Experimentos reflexión sobre Bacteriorhodopsin

1. Monte el accesorio de ATR en el compartimiento de la muestra del espectrómetro FT-IR. Nota: Usamos un ATR ZnSe / diamante con 5 reflexiones activas. Evitar materiales semiconductores tales como germanio o silicio como elemento de reflexión interna (IRE) del accesorio de ATR, ya que sus propiedades ópticas se ven afectados por la emocionante láser visible.
2. Mida un amplio alcance (aprox. 4,000-800 cm ^-1) espectro de energía a los 4 cm ^-1 de resolución de la superficie IRE limpia por espectroscopia FT-IR convencional rápido-scan. Utilice este espectro como un espectro de referencia para calcular los espectros de absorción en una etapa posterior.
3. Cubra la superficie IRE del ATR con 20 l de buffer usado más tarde para rehidratar la muestra (por ejemplo, NaCl 4 M y 100 mM NaPi a pH 7,4). Medir la absorción de IR de la memoria intermedia.
4. Retire el amortiguador, y enjuague la superficie wi IREth agua. Evite tocar la superficie. Retire el líquido residual de la superficie IRE por una intensa corriente de aire.
5. Corre ~ 3 l de bacteriorhodopsin (BR) en las membranas de color púrpura (~ 6 mg de proteína / ml en agua desionizada) en la parte superior de la superficie de IRE (~ 0.2 cm ² de área). Se seca la suspensión de proteína bajo una corriente suave de aire seco hasta que se alcanza una película.
6. Medir el espectro de absorción de la película seca (véase la Figura 1).
7. Añadir suavemente 20-40 l de un tampón de alta fuerza iónica para rehidratar la película seca (por ejemplo, 4 M NaCl y 100 mM NaPi a pH 7,4). Nota: La alta fuerza iónica previene la hinchazón excesiva de la película de la membrana, lo que permite conservar la mayor cantidad de proteínas de lo posible cerca de la superficie palpada (Figura 2).
8. Cubrir el titular de ATR con una tapa para evitar la evaporación del agua. Opcionalmente, colocar una chaqueta de cubierta conectado a un baño circulatorio ajustado a 25 ° C para el control de la temperatura. Para las proteínas con photocycles largos (y #62; segundo), control de la temperatura podría aumentar la estabilidad de la línea de base.
9. Medir un espectro de absorbancia. Estimar el porcentaje de muestra restante cerca de la superficie después de la rehidratación de la película restando el espectro de absorción del tampón (Figura 3).
10. Confirmar la estabilización de la película de la hinchazón mediante el registro de espectros de absorción a intervalos de 5-20 min después de la rehidratación (Figura 4). Este paso es opcional, pero se recomienda.

3. Realización de experimentos de transmisión de detergente disuelto canalrodopsina-2

1. Añadir 10 l de ChR2 (~ 10 mg de proteína / ml) disueltos en NaCl 5 mM, 5 mM de HEPES (pH 7,4) y decil-maltósido (DM) en el centro de una ventana de BaF ₂ de 20 mm de diámetro. Corre con la ayuda de la punta de la micropipeta a un diámetro de 6-8 mm (densidad de superficie de la proteína de ~ 200 g / cm ^2).
2. Formar una usi películang un flujo suave de aire seco. Para obtener los mejores resultados de asegurar que la película es homogénea y tiene un diámetro más o menos coincide con el tamaño del haz IR en la abertura más grande.
3. Hidratar la película mediante la adición de 3-5 l de una mezcla de glicerol / agua distribuida en 3-5 gotas alrededor de la película seca, y se cierran con una segunda ventana utilizando una silicona O-anillo plano de ≥ 1 mm de espesor. Nota: La relación de la mezcla de glicerol / agua controla la humedad relativa entre las ventanas ^54. Para las muestras higroscópicos utilizan una relación de 3/7 o 2/8 de glicerol / agua (W / W). Las gotas de glicerol / agua nunca debe estar en contacto directo con la película de proteína.
4. Inserte los BaF ₂ ventanas intercaladas en un soporte. Prevenir la luz directamente de llegar al detector, cubriendo la ventana de muestra con un material opaco de IR, tal como papel, con un agujero que coincide con el tamaño de la película hidratada. Coloque el soporte en el compartimiento de la muestra.
5. Controlar la temperatura del soporte a 25 °C por una camisa termostática conectado a un baño de temperatura controlada circulatorio.
6. Medir un espectro de absorción. Asegúrese de que la absorción máxima en la región de amida I (~ 1,700-1,620 ^cm-1) está en el intervalo de 0,6-1,0.
7. Estimar la masa y la relación molar de la proteína / detergente / agua del espectro de absorción de la película hidratada (Figura 5) usando la extinción de referencia coeficiente de espectros para el agua, DM, y proteínas de la membrana representativos (Figura 6).
8. Espere hasta que el nivel de hidratación se estabilice antes de realizar experimentos paso del análisis (≥ 1 hr).

4. Ajuste y sincronización del láser Emocionante

Para los experimentos sobre bR utilizan la segunda emisión de armónicos de un láser pulsado de Nd: YAG (λ = 532 nm) para activar el fotociclo. Para los experimentos con ChR2, utilice una excitación de λ = 450 nm a lo dispuesto por una oposcilador paramétrico vertical (OPO) impulsado por el tercer armónico (λ = 355 nm) de un láser de Nd: YAG. Asegúrese de que el pulso de láser es suficientemente corto (~ 10 ns) para reducir al mínimo la foto-excitación secundaria. Nota: La energía de los pulsos de láser debe ser lo más constante posible. En nuestra configuración, la intensidad del láser fluctúa ≤ 10% en torno al valor medio, según lo confirmado por la medición de un reflejo del láser por un fotodiodo conectado a un registrador de transitorios y la integración de la respuesta (Figura 8).

1. Pareja el láser para la muestra. Ajustar la densidad de energía del láser en la muestra a 2-3 mJ / cm ² por pulso usando una potencia-metros.
   1. Para la configuración de ATR, utilizar una fibra óptica colocada en lo alto de la tapa de ATR.
   2. Para los experimentos de transmisión, utilizar espejos para llevar el láser a la muestra y, si se requiere, ya sea lentes para colimar o divergir el haz de láser a un diámetro ligeramente por encima del tamaño de la película de muestra.
2. Sincronizar la laseR pulso con el registro de datos por el espectrómetro. Utilice la Q-interruptor de sincronización de salida de impulsos TTL de la electrónica del láser Nd: YAG para activar el espectrómetro. Ajuste la velocidad de excitación del láser Nd: YAG a 10 Hz para bR y 0,25 Hz para ChR2, respectivamente.
3. Utilice un generador de retardo de pulso (PDG) para controlar la velocidad de excitación de láser si la tasa de repetición del láser de Nd: YAG no es fácilmente ajustable.
   1. Conecte la lámpara de sincronización de salida del láser de Nd: YAG a la entrada de disparo externo PDG. El PDG proporciona una salida de ~ 190 microsegundos pulso TTL retraso a la Q-interruptor de sincronización en la entrada del láser Nd: YAG para desencadenar la acción láser. Puerta de la PDG para aceptar un disparador externo sólo después de cierto período de tiempo desde el último disparador aceptada (100 ms para bR o 4 segundos para ChR2).

5. Preparaciones y Configuración Paso-scan resueltos en tiempo

1. Coloque un filtro óptico de paso bajo en el trayecto óptico. Para realizar las mediciones de paso de barrido con resolución temporal en el 1,800-850 cm ^-1 rango espectral, utilizan un filtro opaco por encima de 1950 cm ^-1 y con una buena transmisión (> 50-80%) por debajo de 1800 ^cm-1 (Figura 7).
2. Cambiar el detector de CA a modo de acoplamiento de CC. Nota: Después de este ajuste la señal de interferograma ya no oscilará en torno a cero, pero alrededor de un valor conocido como el nivel de CC.
3. Utilice la abertura más grande posible del haz del espectrómetro para mayor flujo de fotones y, por lo tanto, una mejor relación señal-ruido, pero dentro de los límites de la linealidad del detector.
4. Llevar el nivel de corriente continua del interferograma a cero y vuelva a ajustar la ganancia electrónica para hacer un mejor uso de la gama dinámica del convertidor analógico digital, convertido (ADC). Lograr compensado por la aplicación de una polarización de tensión de la señal proporcionada por el pre-amplificador de nivel de DC. Nota: Esta opción se incluye en los modernos espectrómetros FT-IR. De lo contrario, un dispositivo externo hecho en casa se ​​puede utilizar en lugar, colocado entre el preamplificador y el ADC ^38. El cuidado es entoncesnecesaria para asegurar que la electrónica de dicho dispositivo son rápido y lineal.
5. Inicie el menú de pasos-scan del espectrómetro FT-IR. Ajuste el ancho de banda espectral de destino para la medición de paso-scan para 1,975.3-0 cm ^-1. Ajuste el ancho de banda espectral a una fracción del número de onda láser de He-Ne (1/8 ^º en el presente caso), ligeramente superior a la de corte del filtro óptico.
6. Desactive cualquier filtro electrónico de paso alto para evitar distorsiones de la cinética en épocas posteriores. Un filtro electrónico de paso bajo puede ser beneficioso cuando su frecuencia de corte es del orden o por encima de la frecuencia de muestreo del ADC (aliasing reduce el ruido).
7. Ajuste la resolución espectral y de fase a 8 cm ^-1 y 64 cm ^-1, respectivamente. Ajuste el modo de adquisición interferograma a una sola cara hacia adelante. Con estas opciones se interferograma requiere alrededor de 500 puntos.
8. Establezca la frecuencia de muestreo del ADC a la más alta disponible en el espectrómetro (por ejemplo, 160 kHZ, o 6,25 microsegundos). Ajuste el "detonante de experimento" a "externa", es decir, el láser es el maestro. Establecer el número de puntos de datos linealmente espaciados a grabar: 7000 para bR (hasta 42 ms) y 20.000 para ChR2 (hasta 125 ms). Nota: las escalas de tiempo más largas pueden ser cubiertos sin desbordar la memoria ADC usando un cuasi-logarítmicamente pulsos TTL externos espaciados en el tiempo a partir de un generador de onda para activar la adquisición de datos ^38, o mediante el uso de dos registradores de transitorios paralelas como sustitutos de la ADC interno ^{31, 32.}
9. Ahorra aproximadamente 100 puntos previos al disparo como una referencia para el estado oscuro de la muestra. Nota: En la escala de tiempo de milisegundos la calidad de los datos es a menudo limitada por las fluctuaciones en el espejo móvil. El aumento de los puntos de pre-activación por encima de 100 es, por lo tanto, no se espera para mejorar significativamente la calidad de los datos.
10. Establecer el número de compañeros de adiciones, es decir, el número de promedios del fotorreacción por espejo positde iones. Para bR, utilice 20 compañeros de adiciones (20 min de tiempo de medición a las 10 tasa de excitación Hz). Para ChR2 utilice 2 compañeros de adiciones (70 min de medir el tiempo en 0.25 tasa de excitación Hz)
11. Repita el experimento 10 veces para bR, y 35x en tres diferentes películas de la muestra para ChR2, que finalmente ~ 200 compañeros de sumas por posición del espejo.

6. Proceso de Datos

1. Confirmar el estado de la muestra comparando el espectro de diferencia IR inducida por la luz obtenida a partir de la primera y la última medición. Considere la posibilidad de descartar cualquier mediciones en las que la intensidad del espectro de diferencia cae por debajo de 60% de la primera medición.
2. La media de los interferogramas grabados.
   1. Usando el software OPUS del espectrómetro FTIR seleccionar los interferogramas con resolución temporal para promediar y añadirlos a la "Spectrum Calculator".
   2. Haga clic en "=" para obtener el promedio de los interferogramas.
      Nota: Cuando la fase del interferogramaes constante durante la medición es indiferente a interferogramas medias o espectros de un solo canal. Una fase constante se puede confirmar mediante el cálculo y comparando el espectro de fase para la primera y la última interferograma registrada.
3. Realizar la transformada de Fourier de los interferogramas con resolución temporal promediados para obtener un promedio de solo espectros canal con resolución temporal.
   1. Utilizando el mismo software que en el paso 6.2.1, seleccione el interferograma resuelta en el tiempo promedio y haga clic en el icono de "interferograma de espectros". Utilice el método Mertz de corrección de fase, factor de llenado de cero de 2 (dos puntos digitales por resolución instrumental), y una función de apodización (por ejemplo, un triángulo, Blackmann-Harris 3-términos, etc.)
   2. Haga clic en la "conversión" de abajo para transformar el interferograma resuelta en el tiempo en los espectros de resolución temporal.
4. Exportar los datos de un solo canal con resolución temporal como una "tabla de puntos de datos" o una "; "Archivo con el" matlab guardar como "icono en el software OPUS. Continuar el tratamiento de datos en un programa externo.
   1. Promediar los espectros de un solo canal antes de que el láser, y convertir los datos de un solo canal con resolución temporal de los espectros de absorción de la diferencia de resolución temporal.
   2. Calcular un vector para la desviación estándar del ruido esperado en los espectros de diferencia como una función del número de onda (Figura 12), usando la desviación estándar del ruido, ε, y la media, S ₀ (ν), de la 100 única espectros de canal anterior a la de láser: ε / S ₀ (ν). El valor de ε se calcula restando espectros de un solo canal consecutivo y el cálculo de la desviación estándar corregido por √ 2.
   3. Retire las regiones espectrales demasiado ruidosos para ser de utilidad (por ejemplo, por encima de 1825 cm ^-1 y 850 cm por debajo de ^-1).
   4. Realice una cuasi-logarítmica promedio (por ejemplo, 20 década espectros / hora). El appearance de los datos mejorará y el número de espectros se redujo de ⁴ a 10 ~ ~ 10 ^2, sin ninguna información significativa perdido (Figura 9).
   5. Aumenta cuatro veces la densidad espectral de puntos (1 punto / ^cm-1) usando la interpolación de Fourier (post-llenado cero).
      Nota: Realice los pasos 6.4.1 al 6.4.4 en un programa de fabricación casera que se ejecuta en MATLAB.
5. Procesar los espectros de resolución temporal obtenida (Figura 10A) con la descomposición de valor singular, SVD, (Figura 13). Lograr eliminación de ruido de datos mediante la reconstrucción de los datos con un número limitado de componentes SVD significativas (Figura 10B). Nota: Nosotros realizamos SVD en MATLAB, utilizando la función "svd" incorporado.

Resultados

La Figura 1 muestra un espectro de absorción de una película seca de la BR depositado en la superficie del elemento de reflexión interna de diamante utilizado para la espectroscopia ATR. Bandas características de las vibraciones del enlace peptídico (amida A, amida I y amida II) son claramente distinguibles. El grosor aproximado de la película seca se puede estimar como ~ 1 m, teniendo en cuenta la cantidad de proteína añadida (18 mg) y la superficie de la ATR (~ 0,2 cm ^2), y teniendo la densidad de la proteína como ~ 1,4 g / cm ^{3, 58} y de los lípidos como 1,0 g / cm ^{3, 59} y una relación lípido / proteína de 1/3 (w / w) en la membrana púrpura ^60.

La película seca se rehidrata con un exceso de 4 M de NaCl, 100 mM NaPi a pH 7,4 (Figura 3). La concentración y nivel de hidratación de proteínas eficaz en el volumen sondeado por la onda evanescente puede deducirse de el factor de escala necesario para eliminar digitalmente bandas de absorciónde agua. El factor de escala óptima fue de 0,87, lo que significa que en este caso el tampón ocupa 87% y la muestra de 13% del volumen cerca de la superficie. Teniendo en cuenta la proteína y la densidad de los lípidos y la relación lípido / proteína en las membranas púrpura (véase más arriba), se puede deducir una concentración de proteína eficaz de 125 mg / ml en el volumen sondeado por la onda evanescente. Podemos deducir del nivel de hidratación que, en este caso particular, el espesor de la película de la muestra expandida ~ 6 veces al rehidratarse, de ~ 1 ~ a 6 micras. Para un ángulo de incidencia de 45 °, típico para nuestra y para la mayoría de los arreglos ATR, la profundidad de penetración del campo evanescente (d _p) para una película de proteína hidratado varía entre 0,3 y 0,6 micras en el intervalo de 1,800-850 cm ^{-1 61.} Debido a que el campo evanescente es casi insensible a la muestra ubicada a dos veces por encima de D _p ^61, se infiere que la cantidad de proteína utilizada en el experimento ATR podría ser, en principio, reducida 5x Without cualquier pérdida significativa de la señal.

Cuando se utilizan tampones de fuerza iónica inferior de la película se expande más, y la cantidad de proteína en el volumen sondeado por el campo evanescente se reduce (Figura 2). La dependencia exacta entre la inflamación película y la fuerza iónica del tampón dependerá, entre otros factores, de la naturaleza de los lípidos. Por ejemplo, una película similar de hinchamiento tal como se obtiene aquí para BR en la membrana púrpura usando 4 M de NaCl se obtuvo para una proteína de membrana reconstituida en polar E. lípidos coli utilizando sólo 0,1 M NaCl ^62. Si la muestra ocupa menos del 5% del volumen sondeado considerar volver a hacer la etapa de hidratación usando un tampón de fuerza iónica más alta. Cine hinchazón después de la hidratación requiere un poco de tiempo para llegar a la estabilización (Figura 4). Para bR en la membrana púrpura el proceso es monoexponencial, con una constante de tiempo de 12 min: se tarda no más de 30-60 minutos para tener una película rehidratado estable

Figura 5 muestra un espectro de absorción IR de una película hidratada de ChR2 obtenido por la transmisión. Aquí, la hidratación se consigue mediante la exposición de la película seca a una atmósfera de humedad controlada proporcionada por una mezcla de glicerol / agua. El espectro se puede descomponer en las contribuciones de agua, detergente y proteína. Podríamos estimar la cantidad de cada uno de ellos mediante la extinción coeficiente de espectros, escalada para encajar el espectro experimental. Para el agua que tomamos el espectro del coeficiente de extinción de la literatura ^{de 63 años,} y para DM medimos desde una solución de 100 mg / ml (Figura 6). También utilizamos coeficientes de extinción por dos proteínas de membrana representativos: el portador ADP / ATP mitocondrial ⁶⁴ y BR (Figura 7). El factor de escala indica una densidad de superficie de la masa de agua y la DM de 260 g / cm ² y 200 g / cm ² en la película, respectivamente. La absorción restante (Figure 5, línea roja) proviene principalmente de la proteína, que se estima en una densidad superficial de 250 g / cm ² utilizando el coeficiente de extinción amida II a partir de dos proteínas de membrana diferentes (ver Figura 6). La relación molar de la proteína / detergente / agua se calculó en 1/60/2000 usando una masa molecular de 35 kDa, 480 Da, y 18 Da, respectivamente.

Un gráfico 3D a partir típico paso-scan FT-IR experimento resuelta en el tiempo en bR se presenta en la Figura 10A, obtenidos por ATR y la participación de 200 min de adquisición de datos. Spectra puede ser extraído en determinados momentos, por ejemplo, cuando la L, se espera que M y N intermedios de la fotociclo bR para alcanzar su mayor población (Figura 11). Sus características espectrales han sido ampliamente descritos ^13,41,65 y serán no discute más aquí. La figura 12 muestra los tiempos de trazas en algunos números de onda seleccionados. A saber, el aumento de la cinética en 1762 cm ^-1 (t _1/2 ~ 60 microsegundos) informa sobre la dinámica de Asp85 protonación de la base de Schiff de la retina ^{de 66 años,} y su decadencia a cero indica su desprotonación tras la recuperación de tierra ^67-sate. El aumento negativo de la cinética en 1740 cm ^-1 (t _1/2 ~ 1 mseg) informa sobre la desprotonación de Asp96 de la cadena lateral, el donante de protones a la base de Schiff ^68. La decadencia de la intensidad a cero informes sobre su nueva protonación desde el citoplasma ^67. La dinámica de los cambios conformacionales de la proteína se puede probar por los cambios de absorción en la región de amida I y amida II, que alcanza un cambio máximo en ~ 3 mseg a temperatura ambiente ^67,69.

La aplicación de la SVD a espectroscópicos problemas ha sido revisado antes de ^55,56. Brevemente, la enfermedad vesicular porcina factoriza los datos experimentales, dispuestas en una matriz A, como: A = U S V ^T. Esta factorización puede ser modificado para tener en cuenta la dependencia de ruido en número de onda y para sancionar las fluctuaciones / derivas en la línea de base ^57. Las columnas de U y V contienen espectros ortonormal y de tiempo trazas vectores para cada componente de la enfermedad vesicular porcina, respectivamente. S es una matriz diagonal que contiene los llamados valores singulares. Los componentes (Resumen) espectro-temporal en U y V aparecen en la disminución de relevancia para describir los datos experimentales en el sentido de los mínimos cuadrados, cuantificado por su valor singular asociado. Figura 13A muestra los valores singulares como una función del número de componente, y reproduce los primeros ocho columnas / componentes de U (espectros resumen, la Figura 13, parte B) y V (resumen de tiempo trazas, Figura 13C). La señal se concentra en los primeros cinco componentes (como era de esperar para un photocycle contiene cinco estados intermedios), con componentes anteriores en gran parte dominado por el ruido aleatorio y otras fuentes de errores. Los datos experimentales se reconstruyó utilizando sólo los primeros cinco columnas de U y V, y las primeras cinco columnas y filas de S. Los datos reconstruidos por SVD representa la mejor aproximación de mínimos cuadrados de los datos experimentales a una matriz de rango de cinco. Los datos reconstruidos muestra mejora en la calidad (Figura 10B). Es decir, el ruido se reduce en gran medida, así como algunas fluctuaciones y derivas apenas perceptibles en la línea de base (comunes en-paso del escaneo de la espectroscopia resuelta en el tiempo ^25). Procesamiento SVD es especialmente beneficioso para mejorar la calidad de los tiempos de los rastros experimentales en el rango de milisegundos (líneas rojas en la Figura 12).

Datos de paso de exploración Tiempo de resolver para el fotociclo ChR2 se obtuvieron utilizando el protocolo descrito anteriormente para la transmisión experimentos Sion (Figura 14A), con la participación más o menos 120 horas de mediciones acumuladas. Los datos de tiempo de resolverse recogidos a paso-scan se extiende desde 6,25 microsegundos a 125 mseg. El fotociclo de ChR2 requiere aproximadamente 60 s de recuperación completa. La última parte de la fotociclo se puede cubrir mediante un rápido escaneo FT-IR, y ambos paso-scan y conjuntos de datos de rápido escaneo se fusionó como se presenta en otro lugar ^48. Los cambios espectrales de ChR2 son ~ 10 veces más pequeñas que las obtenga de bR, hacer las mediciones más difícil. Especialmente, las oscilaciones en la línea de base en el rango de milisegundos se vuelven evidentes en estos cambios de baja absorción. Estos se deben a pequeñas oscilaciones en el espejo móvil en la escala de tiempo de milisegundos ^25. Las oscilaciones, junto con parte del ruido, se pueden eliminar en gran medida por la enfermedad vesicular porcina, mejorar notablemente el aspecto de los datos (Figura 14B).

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Figura 1. Espectro de absorción de la BR en la membrana púrpura seca en la parte superior de la superficie de diamantes de un accesorio ATR. Bandas de vibraciones del enlace peptídico (amida I, II y A) se indican.

Figura 2. Espectro de absorción de una película de la BR después de la rehidratación utilizando tampones de diferentes fuerzas iónicas (diluciones de 4 M de NaCl, 100 mM de Na ₂ HPO ₄ / NaH ₂ PO ₄ a pH 7,4). Nótese la disminución de la banda de amida II, es decir, aumento de la hinchazón película, con la disminución de la fuerza iónica del tampón. (Insertar) Cantidad relativa de proteína cerca de la superficie, cuantificada por la intensidad de la absorbancia a 1541 cm ^-1 (amida II máximo) después Subtractien la contribución de la absorción de la memoria intermedia.

Figura 3. Espectro de absorción de una película de la BR rehidratado con tampón mayor (fuerza iónica 4,3 M) y después de la sustracción de la contribución tampón. El factor de resta, 0,87, fue elegido para eliminar la absorción de agua fuerte entre 3,700-3,000 cm ^-1 y para obtener una línea de base plana entre 2,700-1,800 cm ^-1.

Figura 4. Espectro de absorción de la BR después de la rehidratación con un tampón de 4,3 M de fuerza iónica (absorción de tampón se ha restado para mayor claridad como en la Figura 3). El inserto muestra la evolución de la película de la inflamación después de rehydratde iones, seguido de la absorbancia de proteínas amida II en 1541 cm ^-1. Un ajuste a una sola exponencial indica una constante de tiempo para el cine hinchazón estabilización de 12 min.

Figura 5. Espectro de absorción de una película hidratada de ChR2 medido por transmisión (línea azul). El coeficiente de extinción espectro de agua (línea naranja discontinua) y DM (línea discontinua cian) se redujo y se resta (línea roja).

Figura 6. Reproducido extinción masiva coeficiente de espectros a 25 ° C para el agua líquida (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) y para una película hidratada de la ADP / ATP portador (AAC) ⁶⁴ . trong> El espectro coeficiente de extinción de masas se midió en solución para DM (100 mg / ml), y en una película hidratada para BR.

Figura 7. Transmitancia del filtro óptico utilizado en la exploración de barrido mediciones FT-IR con resolución temporal.

. Figura 8 Rendimiento de los pulsos de láser proporcionadas por el segundo armónico (532 nm) de un Nd:. YAG Histograma de la variación de la energía relativa de 1,000 pulsos de láser, y ajustarse a una distribución Gaussiana con una desviación estándar de 0,05.

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Figura 9. Luz inducida por los cambios de absorbancia de bR en tres números de onda representativas a tiempo uniforme espaciamiento de los intervalos (verde, negro, y líneas azules) y después de un promedio de casi logarítmica a ~ 20 puntos / década (líneas rojas). Note la reducción de ruido después de de promedio logarítmico, revelando la oscilación de las veces rastrea en el orden de milisegundos.

Figura 10. Representación 3D de los cambios de absorbancia de luz inducida para BR grabadas por ATR a pH 7,4 (4 M de NaCl, 100 mM NaPi). A) Los datos en bruto. B) Los datos reconstruidos con cinco componentes SVD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11. FT-IR espectros de absorción diferencia de la fotociclo bR a tres veces seleccionados donde la L (12,5 microsegundos), M (300 microsegundos), y N (6 mseg) los compuestos intermedios son los más enriquecidos.

Figura 12. Transferencia de protones y proteínas dinámica de los backbone en la fotociclo bR como resuelto a paso-scan espectroscopia FT-IR diferencia de tiempo resuelto. Los cambios de absorbancia a 1762 cm ^-1 informes sobre la dinámica protonación / desprotonación de Asp85, y en 1741 cm ^-1 en la dinámica de desprotonación / reprotonación de Asp96 (incluyendo cambios H-vinculación antes de 300 microsegundos). Los tiempos de los rastros en 1670 y 1555 cm ^-1informar cambios en amida I y II vibraciones, tanto sensibles a la conformación de la cadena principal del péptido. Las huellas traseras corresponden a los datos en bruto y, los rojos a los datos tratados-SVD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13. Descomposición en valores singulares (SVD) de la etapa de escaneo de los datos experimentales con resolución temporal FT-IR de la fotociclo Br (véase la Figura 10A). SVD se realizó después de pesar los datos experimentales teniendo en cuenta el ruido dependencia de la desviación estándar en número de onda (Figura 15); combinada con la 1 ^ª derivada para reducir el peso estadístico de las fluctuaciones de la línea de base, como se ha descrito antes ^57. Una) y #160, Parcela de los valores singulares relativos de los primeros 50 componentes (círculos negros). Los primeros cinco componentes se asignan para indicar componentes (círculos rojos). El resto de componentes de la decadencia exponencial como se espera de ruido-componentes (véase la línea gris discontinua). B) Primera ocho espectros abstracto (U ₁ a U _8). C) En primer lugar ocho momentos rastros abstractos (V ₁ a V _8). Los espectros abstracto y de tiempo asignado a las trazas de la señal se representan en líneas rojas y, con las líneas negras de otro tipo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representación Figura 14. 3D de los cambios de absorbancia IR inducidos por la luz de ChR2 registrados a paso-scanen el modo de transmisión. Los datos de paso de exploración se extiende hasta 125 ms, sólo cubre una parte de la fotociclo. A) Los datos en bruto. B) Los datos reconstruidos con cinco componentes SVD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 15. Nivel de ruido estimado en un espectro de absorción Diferencia FT-IR. En 6,25 microsegundos temporal y 8 cm ^-1 de resolución espectral para un experimento con 1 posición co-addition/mirror (500 fotorreacciones) o ~ 200 posición co-addition/mirror (10) ⁵ fotorreacciones. Los valores se muestran para la reflexión total atenuada (ATR) y la configuración de la transmisión.

Discusión

Uno de los aspectos primero que necesita consideración a la hora de realizar el paso de escaneo experimentos FT-IR resueltas en el tiempo en una proteína es la preparación de una muestra en una forma adecuada para la espectroscopia de IR. La absorción de IR de sustancias distintas de la proteína de interés debe ser reducido, sobre todo que a partir de agua. El enfoque más común es para evaporar el agua a granel de la muestra para formar una película. La película puede ser rehidratado ya sea mediante la adición de algunas gotas de una solución acuosa o mediante la exposición de la película a una atmósfera de humedad controlada. Hemos mostrado cómo en ambos casos es posible estimar el nivel de hidratación obtenida por medio de la espectroscopia de absorción de IR (véase la Figura 3 y la Figura 5). Aunque los niveles de hidratación obtenidos pueden aparecer bajo en comparación con aquellos en solución, que son en realidad cerca de las que se encuentran en las células vivas ^70, por lo que el estudio de las películas hidratadas de proteínas funcionalmente relevantes. Además de agua,También es importante conocer y controlar la cantidad de lípidos o detergente en la muestra. Tanto debe mantenerse lo suficientemente baja para tener un impacto espectroscópico reducida en la absorción de IR, pero lo suficientemente alta para preservar la integridad y la funcionalidad de la proteína de interés.

Espectroscopia de paso del escaneo de resolución temporal es sólo francamente aplicable a las proteínas que muestran reacciones reversibles que se pueden activar de forma reproducible por la luz (pero ver el progreso en el acoplamiento de la etapa de exploración con el intercambio de tampón rápido) ^71. En la etapa-escanear la reacción tiene que ser reproducible para al menos ~ 500x, el número mínimo para completar un interferograma que cubre el 1,800-850 cm ^-1 región a 8 cm ^-1 resolución. En la práctica, sin embargo, con un promedio adicional de datos generalmente se requiere para impulsar el nivel de ruido. Por 200 posición co-additions/mirror (10 ⁵ repeticiones de la reacción) un espectro 6,25 microsegundos resolución diferencia de absorción puede mostrar una estación de ruidodesviación ndard entre 2 x 10 ^-5 y 2 x 10 ^-4 para un ATR y entre 5 x 10 ^-6 y 3 x 10 ^-5 para un experimento de transmisión (Figura 15). Gracias a su mayor rendimiento de fotones, la transmisión permite ~ 7 niveles de ruido más bajos que los ATR, un aspecto clave para el estudio de muestras en las que con éxito los cambios de absorción débiles como ChR2. Por otro lado, ATR requiere de 5 a 25 veces menos que muestra un experimento de transmisión.

La aplicación de la etapa de exploración espectroscopia FT-IR resuelta en el tiempo es un problema para proteínas que muestra photocycles lentos: la grabación de un interferograma a paso-scan puede llegar a ser poco práctico larga. Algunas soluciones se han presentado para hacer frente a estos casos ^72,73, a menudo basadas en el uso de múltiples muestras intercambiables para acelerar las medidas a costa de un mayor consumo de proteínas y la complejidad experimental ^27,74. En algunos casos es posible eludir este problema por el excitando la muestra antes de la fotociclo está estrictamente completó. Para ChR2, con un fotociclo requiere después de la foto-excitación 60 seg para la recuperación de 99%, la recuperación en 4 seg ya de 80% es ^48. Con una eficiencia de excitación de 10% por pulso láser, 98% de las moléculas de Chr2 están en la oscuridad estado 4 seg después de la foto-excitación, lo que hace posible llevar a cabo experimentos a una tasa de repetición del láser a 0,25 Hz.

Tratamiento de la información es un aspecto técnico final necesario para alcanzar los mejores resultados posibles. Promedio logarítmico reduce el ruido y, también importante, reduce el tamaño de los datos sin distorsiones, una característica esencial para el análisis de datos posteriores utilizando la descomposición de valor singular o ajuste global. Promedio logarítmico es, sin embargo, no es muy exitosa en un promedio de las fluctuaciones en el tiempo-huellas causadas por las oscilaciones en el espejo móvil y otras fuentes de ruido 1 / f durante las mediciones (Figura 9). Estas fluctuaciones en la línea de basepuede superar el ruido en el rango de milisegundos y corrupto de la calidad de los datos. Descomposición de valor singular se aprovecha de la redundancia de los datos para reducir el ruido, y con algunas modificaciones ⁵⁷ que puede reducir así las fluctuaciones en la línea de base.

Finalmente, la mayor parte más difícil y requiere mucho tiempo de un paso de exploración de FT-IR experimento resuelta en el tiempo corresponde a la asignación de bandas y para la interpretación espectral y cinética de los datos. Para bacteriorhodopsin muchas de las bandas que aparecen en los espectros de diferencia IR han sido asignados o interpretado gracias al trabajo acumulado de muchos grupos de investigación en las últimas décadas. Para una proteína mucho menos estudiado, como canalrodopsina-2, los experimentos de IR con resolución temporal anteriormente presentados tienen que ser acompañados por experimentos paralelos en mutantes dirigidos al sitio y se combinan con la información de técnicas complementarias para llegar a una interpretación mecanicista ^48.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Espectrómetro FT-IR	Bruker	Vertex 80v	Equipado con detector fotovoltaico-MCT, un global externo, y una bomba exenta de aceite. Firmware 2.3.
BaF2 ventanas	korth Kristalle
Diamond ATR accesorio	Detección		DuraDisk de nueve reflexiones
	Julabo	F25
Mesa desacoplada por vibración	OPTA
Láser pulsado Nd:YAG con un segundo generador de armónicos	Electro-Óptica de continuo	Minilite
Oscilador paramétrico óptico (OPO)	OPTA	BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Generador digital de retardo/impulsos	Stanford Research Systems	DG535
Láser pulsado de Nd:YAG con un tercer generador de armónicos	Spectra-Physics	Quanta-Ray
Varios espejos ópticos y lentes	ThorLabs
OPUS 7.0	Bruker		Software para controlar el espectrómetro Vertex 80v
Tiempo de ejecución de MATLAB	Mathworks		Se utiliza para ejecutar programas ejecutables caseros para Preprocesar los datos