Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T

14.2K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/51627

⸱

19 de junio de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

En este artículo

Resumen

La capacidad de controlar las respuestas de células T en detalle en vivo es importante para el desarrollo de nuestra comprensión de la respuesta inmune. Aquí se describe el uso de conjuntos de blancos fluorescentes (TLC) en un ensayo in vivo de células T en el que evalúa> 250 parámetros simultáneamente por citometría de flujo.

Resumen

La capacidad de monitorear las respuestas de células T in vivo es importante para el desarrollo de nuestra comprensión de la respuesta inmune y el diseño de inmunoterapias. Aquí se describe el uso de la tecnología fluorescente matriz de destino (TLC), que utiliza colorantes vitales como succinimidiléster carboxifluoresceína (CFSE), colorantes excitables láser violeta (violeta CellTrace: CTV) y colorantes excitables láser rojo (proliferación de células tinte eFluor 670: CPD ) para combinatoriamente linfocitos de ratón de etiquetas en> 250 grupos de células fluorescentes discernibles. Grupos de células dentro de estos TLC pueden ser pulsados ​​con mayor de histocompatibilidad (MHC) de péptidos de unión de clase I y MHC de clase II y por lo tanto actúan como células diana para CD8 + y células T CD4 +, respectivamente. Estas células TLC siguen siendo viables y completamente funcional, y por lo tanto se pueden administrar en ratones para permitir la evaluación de CD8 + T muerte celular mediada de células diana TLC y CD4 + T de células HEL-meditadop de las células diana de células B TLC en tiempo real in vivo por citometría de flujo. Desde> 250 células diana pueden evaluarse a la vez, la técnica permite el seguimiento de las respuestas de células T contra varios epítopos de antígeno a varias concentraciones y en múltiples repeticiones. Como tal, la técnica puede medir las respuestas de células T a una cuantitativa (por ejemplo, la magnitud de la respuesta acumulativa) ambos y un (por ejemplo. Avidez funcional y-epítopo Reactividad cruzada de la respuesta) cualitativa nivel. Aquí se describe cómo se construyen estos TLC y dan un ejemplo de cómo se pueden aplicar para evaluar las respuestas de células T inducida por una vacuna de virus de la viruela recombinante.

Introducción

Células T juegan un papel central en la respuesta inmune adaptativa y, a menudo son objeto de manipulación en la inmunoterapia. Las células T efectoras CD4 + responden al antígeno extraño secretando citoquinas que regulan muchos aspectos de la inmunidad y también puede ayudar directamente a las células B para la fabricación de anticuerpos. Células T citotóxicas CD8 + (CTL) también pueden responder a antígeno extraño mediante la secreción de citoquinas así como jugando un papel central en matar directamente las células que expresan un antígeno extraño. La interacción fundamental que inicia estas funciones efectoras de células T implica la interacción del receptor de células T (TCR) con péptidos extraños que aparecen en las moléculas MHC sobre la superficie de las células. Células T CD4 + reconocen péptidos presentados en las moléculas de MHC de clase II en las células presentadoras de antígeno y células T CD8 + reconocen péptidos presentados en las moléculas de MHC de clase I que típicamente se muestran en las células infectadas por microbios.

En ordenpara evaluar el papel de las células T juegan en una respuesta inmune, es esencial que sus funciones efectoras se miden por técnicas fiables y sensibles. Los métodos comunes para la evaluación de la respuesta de células T incluyen; MHC class-I/II/peptide reactividad tetrámero; producción de citocinas por ELISPOT y tinción intracelular de citoquinas; y matando a la capacidad por 51 ensayos de Cr-liberación. Estos ensayos, sin embargo, se llevan a cabo típicamente ex vivo con la estimulación in vitro, o proporcionan información limitada en función de células T. Idealmente, cuando la medición de respuestas de células T sería beneficioso para evaluar in situ, in vivo como se producen, sin la manipulación de las células T a fin de evitar cambios en los parámetros funcionales que se pueden producir a través de la estimulación in vitro. Algunas de las más utilizadas en vivo T ensayos funcionales de células se basan en la medición de la matanza CTL mediada por células diana pulsadas con péptidos MHC de clase I-vinculantes, que se enumeran en vivoa través de su detección mediante marcaje fluorescente con colorantes vitales como la CFSE. Si bien estos tipos de ensayos pueden supervisar la matanza CTL mediada de objetivos cuando ocurren in vivo, han tenido previamente una capacidad relativamente limitada para evaluar la matanza de blancos múltiples que presentan diferentes concentraciones y diferentes tipos de epítopos peptídicos, que se requiere para permitir a los parámetros cualitativos, avidez como funcional y variante epítopo reactividad cruzada que deben evaluarse. Estos ensayos también no proporcionan ninguna información sobre las respuestas mediadas por células T CD4 +.

Para superar muchas de las limitaciones con los métodos actuales utilizados para evaluar las respuestas de células T, hemos desarrollado recientemente un ensayo múltiple basado en matrices fluorescentes objetivo (TLC), lo que permite el seguimiento de las respuestas de células T contra> 250 células diana simultáneamente en un animal por la citometría de flujo 1, 2. TLC se componen de linfocitos marcados con sevrales concentraciones y combinaciones de colorantes vitales como la CFSE, CTV y CPD permitiendo> 250 grupos de células de fluorescencia único que se generen. Puesto que estas células permanecen viables y completamente funcional, que pueden ser inyectados en los animales para permitir la monitorización de su interacción con células T efectoras in vivo 3. Por ejemplo, los grupos de células del TLC pueden ser pulsadas con péptidos I-vinculante-MHC de clase para permitir la evaluación de matar CTL mediada por antígeno específico de células diana 1. Además, los grupos de células TLC también pueden ser pulsadas con péptidos del MHC de clase II-de unión, lo que permite la evaluación de antígeno específico de células T auxiliares (T H) mediante la evaluación de la actividad de activación (por evaluación de marcadores de activación tales como CD69, CD44 y / o CD62L) de las células B en el TLC que llevan péptido afín 2. Desde hace más de 250 objetivos se pueden detectar de forma simultánea, es posible medir las respuestas de CTL y T H contra muchos grupos de células diana pulsadas con npéptidos umerosos a diferentes concentraciones y la inclusión de muchas repeticiones. Por tanto, el ensayo de TLC proporciona un nivel sin precedentes de la evaluación de la respuesta T efectoras de células in vivo.

A continuación se describe en detalle la construcción de un acuerdo de libre comercio y mostrar la forma en que se pueden aplicar a la evaluación de las respuestas de células T in vivo. El procedimiento describe la construcción de un TLC compuesta de 252 grupos de células discernibles a través de la utilización de tres colorantes vitales, compuestos de 6 repeticiones de 42 grupos de células pulsadas con MHC de clase I y II de unión a péptidos. El etiquetado de los 42 grupos de células se produce en 10 ml de fondo cónico de tubos y que es útil para poner éstos hacia fuera en un bastidor de tubo como se muestra en la Tabla 1. Este método se puede ajustar para un número menor de grupos discernibles como es requerido por la reducción de la cantidad de etiquetado de cada colorante a cabo 1.

Se destaca la utilidad del ensayo, mostrando cómo se puede medir la responsES generados por la vacunación de la viruela de virus recombinante contra múltiples epítopos en una pequeña cohorte de ratones. Esto muestra cómo el ensayo de TLC se puede utilizar para medir las respuestas acumuladas y avidez funcional a través de, respectivamente, el uso de área bajo la curva (AUC) y las evaluaciones de medición de la concentración de péptido eficaz requerida para generar respuestas máximas media (CE 50).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Nota: Los ratones utilizados en este protocolo fueron manejados de acuerdo con las directrices del Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad Nacional de Australia y los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical.

1. Dye y Preparación de Péptidos

  1. Preparación de tinte
    Nota: Los colorantes se prediluyen a diferentes concentraciones para permitir el etiquetado de las células en la intensidad de fluorescencia discretos. CFSE se utiliza en concentraciones realizadas a través de siete diluciones en serie de 3,5 veces, y CTV y CPD se utilizan en seis concentraciones diferentes realizadas a través de diluciones seriadas 3,7 veces (véanse las Tablas 2-4). Las concentraciones madre de colorantes enumerados en las Tablas 2-4 se utilizan para etiquetar las células diana en las concentraciones de colorante final enumerados en las Tablas 2-4. Colorantes reaccionan a la exposición a la solución acuosa. Por lo tanto, es importante que los viales se equilibraron a temperatura ambiente antes de abrir para minimizar la exposición de los tintes a la condensación.
    1. CFSE
      Nota: CFSE se compra como diacetato de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFDA, SE; MW 557,47), típicamente a 25 mg / vial.
      1. Resuspender 25 mg de CFSE en 4,48 ml de DMSO para obtener una solución madre 10 mM.
      2. En serie diluir CFSE: Añadir 35 l de 10 mM CFSE caldo en 87,5 l de DMSO y repetir esto con solución madre diluida para dar a cada concentración de colorante en la Tabla 3.
    2. CTV
      Nota: CTV se comprados usualmente en paquetes de 9 viales, cada uno de los cuales se pueden reconstituir con 10 l de DMSO para generar una solución 10 mM del colorante.
      1. Reconstituir y poner en común todas las 9 copas de CTV con 90 l de DMSO para dar una solución de 10 mM.
      2. En serie diluir CTV: Añadir 11 l de 10 mM CTV caldo en 29,7 l de DMSO y repetir esto con solución madre diluida para dar a cada concentración de colorante en la Tabla 2.
    3. CPD
      Nota: CPD (MW 792.6) es típicaly comprar como 0,5 mg / vial.
      1. Resuspender 0,5 mg de CPD en 63 ml de DMSO para obtener una solución 10 mM.
      2. En serie diluir CPD: Añadir 11 l de 10 mM CPD caldo en 29,7 l de DMSO y repetir esto con solución madre diluida para dar a cada concentración de colorante en la Tabla 4.
        Nota: las poblaciones de colorantes se pueden almacenar a -20 ° C durante varios meses y se pueden congelarse y descongelarse varias veces sin pérdida significativa de la función.
  2. Una preparación de péptidos
    Nota: los péptidos de MHC de clase I de unión se utilizan generalmente para pulsar las células diana en 6 concentraciones diferentes hechos usando diluciones de 10 veces a partir de una concentración de partida de 1 M (Tabla 5). II-péptidos de unión a MHC de clase se utilizan generalmente para pulsar las células diana en 6 concentraciones diferentes hecha usando 3 diluciones a partir de una concentración de partida de 400 mM (Tabla 5). Cada péptido se hace a una concentración final 2x en PBS tales THAt cada concentración de péptido tiene un volumen mínimo de 250 l. Existencias de péptidos se pueden preparar antes de la construcción TLC y se almacenaron a -20 ° C sin pérdida significativa de la función.
    1. Péptidos Preparación de stock MHC de clase I vinculante
    2. Preparar la más alta concentración de cada péptido epítopo de 2 soluciones M de acciones (2x 1 M)
    3. En serie diluir péptidos I-vinculante-MHC de clase: añadir 44,4 l de 2 M péptido solución madre en 400 l de PBS. Repita esto con solución madre diluida para dar a cada concentración de péptido en la Tabla 5.
    4. Péptidos Preparación de stock MHC de clase II vinculante
    5. Preparar la más alta concentración de cada péptido epítopo a 800 mM de soluciones madre (2x 400 M).
    6. En serie diluir péptidos de clase II-MHC vinculante: añadir 150 l de 800 mM solución de péptido en 300 l de PBS. Repita esto con solución madre diluida para dar a cada concentración de péptido en la Tabla 5 .

2. Preparación TLC

Nota: El procedimiento siguiente describe la construcción de un TLC compuesto de células pulsadas con 7 epítopos de péptidos diferentes en 6 concentraciones diferentes (es decir, 42 grupos de células.) Repetidos 6 veces para generar 252 grupos de células discernibles. Dentro de cada repetición, un grupo de células no pulsadas con ningún epítopo (cero), se incluyó como control. Es útil para los acuerdos de libre comercio que tengan una diferencia alotipo CD45 de los animales de acogida para permitir su discriminación por parte de las células receptoras mediante el etiquetado de anticuerpos en el momento del análisis. De lo contrario TLC puede marcarse con otros colorantes tales como PKH-26 para este propósito (descrito en el paso 2.6). Por lo general, el procedimiento de preparación TLC se lleva a cabo de principio a fin durante una sola sesión.

  1. Etiqueta 42, 10 ml de fondo cónico tubos de plástico 1-42 (como en la Tabla 1, por ejemplo).
  2. Preparación de células
    1. Aislar el bazo y / o lymphnodes de los ratones. Preparar suspensión de células individuales a partir de tejidos por maceración a través de un tamiz de 70 micras estudiado minuciosamente con un émbolo de la jeringa de 5 ml y contar las células usando un hemocitómetro.
    2. Resuspender los linfocitos de hasta 200 x 10 6 células / ml en 11,5 ml de Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI, o equivalente) que contiene suero de ternera fetal al 5% (FCS). Nota: Es importante utilizar un tampón con alto contenido de amina para minimizar la toxicidad de colorante a las células 3.
  3. Etiquetado CTV
    Nota: Las células se marcan inicialmente con 6 concentraciones de CTV.
    1. A fondo resuspender las células invirtiendo el tubo varias veces. Añadir 1,9 ml de la suspensión celular a 6 de los 10 ml tubos etiquetados 37-42, teniendo cuidado de no mojar la mitad superior de los tubos.
    2. Para marcar las células con CTV, retire la tapa del tubo y colocar el tubo en posición horizontal.
    3. Añadir 83 l de PBS a la parte no mojada en la parte superior del tubo, y para este complemento 17 l de valores CTV (ver Table 2 por la que se asigna la solución madre a la que tubo). Nota: Un tubo sin contacto con el es importante para evitar el movimiento de suspensión de células y la mezcla prematura de la solución de células con la solución de colorante.
    4. Tapar el tubo y mezclar la suspensión de células con el colorante rápida y completamente por agitación.
    5. Repita los pasos 2.3.2-2.3.4 para las soluciones madre de CTV en los tubos designados descritos en la Tabla 2.
    6. Se incuban las células durante un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente (20 ° C).
  4. CFSE etiquetado
    1. Después de etiquetado CTV, añadir 5 ml de RPMI que contenía 5% de FCS a cada tubo y resuspender a fondo las células mediante agitación con vórtex.
      1. Desde el tubo 37 de transferencia de 1 ml de suspensión celular a los tubos 31, 25, 19, 13, 7, y 1.
      2. Desde el tubo 38 de transferencia de 1 ml de suspensión celular a los tubos 32, 26, 20, 14, 8, y 2.
      3. Desde el tubo 39 de transferencia de 1 ml de suspensión celular a los tubos 33, 27, 21, 15, 9, y 3.
      4. De tubo 40 de transferencia de 1 ml de célulassuspensión a tubos de 34, 28, 22, 16, 10, y 4.
      5. Desde el tubo 41 de transferencia de 1 ml de suspensión celular a los tubos 35, 29, 23, 17, 11, y 5.
      6. De tubo 42 de transferencia de 1 ml de suspensión celular a tubos de 36, 30, 24, 18, 12 y 6
        Nota: Tenga cuidado de no mojar la mitad superior de los tubos durante los pasos 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Para marcar las células con CFSE, retire la tapa del tubo y colocar el tubo en posición horizontal.
    3. Añadir 103 ml de PBS a la porción sin contacto en la parte superior del tubo, y para este complemento 7 ml de Stock CFSE (véase la Tabla 3 para los que se asigna solución madre a la que el tubo).
    4. Tapar el tubo y mezclar la suspensión de células con el colorante rápida y completamente por agitación.
    5. Realice los pasos 2.4.2-2.4.4 para las soluciones madre de CFSE en los tubos designados descritos en la Tabla 3.
    6. Se incuban las células durante un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente (20 ° C).
    7. Lavar las células: Diluir la suspensión de células con 9 ml de 20 ° CRPMI que contenía 5% de FCS, sedimento por centrifugación a 300 xg durante 10 min a 20 ° C y retirar los sobrenadantes mediante aspiración con una pipeta de transferencia.
  5. Pulsante péptido y de lavado de células
    Nota: Después de las células se han etiquetado con CTV y CFSE, que se pulsan con MHC de clase I y / o MHC de clase II-péptidos de unión (preparado en 1.2). Una de las poblaciones celulares tampoco debe pulsadas con péptido (p. ej. Cero en la Tabla 1) y se utiliza como control negativo para el cálculo de las respuestas de células T.
    1. Pulsante Péptido
      1. Resuspender las células en un volumen total de 250 l de RPMI que contenía 5% de FCS. Nota: Típicamente 50 l de suspensión de células se mantiene después de la aspiración del sobrenadante al final de la etapa 2.4.7, por lo tanto, añadir 200 l de medio a la celda de pellets.
      2. Añadir 250 l de stocks de péptidos pre preparadas (como en la Tabla 5) para apropiadamente designada tubos (como en la Tabla 1) y estar sure para incluir un tubo de control de PBS añadido solo sin péptido como control Nada.
      3. Mezclar las suspensiones de células con un vórtice. Nota: Es crítico que cada epítopo péptido y cada concentración de péptido se le asigna a un único tubo y esta registrada claramente basado en la fluorescencia esperada de las células en este tubo, desde la firma de fluorescencia de este grupo definirá este péptido (como en la Tabla 1 por ejemplo).
      4. Se incuban las células a 37 ° C durante 1 hora.
    2. Lavado de células
      1. Añadir 5 ml de hielo frío (4 ° C) RPMI que contenía 5% de FCS a la suspensión de células y volver a suspender las células por invirtiendo el tubo. Subyacer cuidadosamente la suspensión de células con 3 ml de hielo frío (4 ° C) de FCS.
      2. Se sedimentan las células mediante centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Utilice la aceleración y el frenado lento para asegurar la interfaz de FCS y se mantiene la solución de suspensión de células.
      3. Aspirar con cuidado la RPMI y luegolas FCS con una pipeta de transferencia, dejando los sedimentos celulares se lavaron imperturbable. Nota: El uso de una capa base de FCS para lavar las células ayuda a asegurar solución de péptido tanto se elimina de las células como sea posible y limitando de este modo la exposición de las poblaciones de células a múltiples péptidos libres cuando se agruparon las células.
      4. Lavar las células de nuevo: Resuspender los sedimentos celulares en 10 ml de 4 ° C RPMI que contenía 5% de FCS. Se sedimentan las células mediante centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Vierta sobrenadantes.
      5. Piscina todas las poblaciones de células en un solo tubo con una pipeta utilizando 6 ml de 4 ° C RPMI conteniendo 5% de FCS. Sedimentos células agrupadas por centrifugación a 300 g durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante con una pipeta de transferencia.
  6. Etiquetado celular CPD
    Nota: En este punto seis repeticiones del ensayo intra pueden ser generados por células pulsadas péptido etiquetado con 6 concentraciones diferentes de CPD.
    1. Añadir 11,4 ml de 20 ° CRPMI que contenía 5% de FCS para el sedimento de células se agruparon y resuspender a fondo usando una pipeta.
    2. Añadir 1,9 ml de la suspensión celular a 6, 10 ml tubos etiquetados AF, teniendo cuidado de no mojar la mitad superior de los tubos.
    3. Para marcar las células con CPD, retire la tapa del tubo y colocar el tubo en posición horizontal.
    4. Añadir 92 l de PBS a la porción sin contacto en la parte superior del tubo, y para este complemento de stock CPD (véase la Tabla 4 para la cantidad de solución madre asignado a cada tubo).
    5. Tapar el tubo y mezclar la suspensión de células con el colorante rápida y completamente por agitación.
    6. . ¿Los pasos 2.6.3-2.6.5 para las soluciones madre de CPD en los tubos designados descritos en la Tabla 4 Nota: A diferencia de CFSE y CTV, la concentración etiquetado DPC no es precisamente relacionada linealmente con la intensidad de la fluorescencia resultante de células marcadas, y por lo que la concentración de etiquetado utilizado para obtener picos fluorescentes equidistantes de varias poblaciones marcadas ha sidodeterminado empíricamente (ver Tabla 4).
    7. Se incuban las células durante un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente (20 ° C).
    8. Lavar las células dos veces: Resuspender las células a 10 ml con 20 ° C RPMI que contenía 5% de FCS. Se sedimentan las células mediante centrifugación a 300 xg durante 10 min a 20 ° C. Aspirar el sobrenadante con una pipeta de transferencia. Repita.
    9. Piscina todas las células en un solo tubo utilizando 8 ml de 4 ° C RPMI que contenía FCS al 5% con una pipeta. Sedimento células agrupadas por centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante con una pipeta de transferencia.
  7. (Opcional) etiquetado celular PKH-26
    Nota: Si TLC no se puede construir con células que expresan una diferencia alotípica CD45 para alojar los ratones, pueden ser etiquetados con PKH-26 para permitir su discriminación de las células receptoras.
    1. Añadir 2,9 ml de 20 ° C de PBS al sedimento celular agrupada y resuspender a fondo con una pipeta.
    2. Añadir suspensión celular a un non humedece tubo de 10 ml, teniendo cuidado de no mojar la mitad superior del tubo.
    3. Retire el tapón del tubo y colocar el tubo en posición horizontal.
    4. Añadir 58 l de diluyente C (en el kit de tinte PKH-26) a la porción sin contacto en la parte superior del tubo, y para este complemento 42 l de 1 mM de stock PKH-26.
    5. Tapar el tubo y mezclar solución de células con el colorante a fondo por agitación.
    6. Se incuban las células durante un mínimo de 10 min a temperatura ambiente (20 ° C).
    7. Lavar las células dos veces: Resuspender las células a 10 ml con 20 ° C RPMI que contenía 5% de FCS. Se sedimentan las células mediante centrifugación a 300 xg durante 10 min a 20 ° C. Aspirar el sobrenadante con una pipeta de transferencia. Repita.
  8. La inyección de los TLC en los animales huéspedes
    Nota: Para medir las respuestas de células T in vivo, los TLC se inyectan en animales que tienen una respuesta inmune activa y dejados in situ durante un máximo de 24 h. Es crítico que los TLC también se inyectan en un animal no expuestos como un control negativo.
    1. Contar y resuspender las células en 2,5 x 10 8 células por ml en PBS. Inyectar 200 l de células por vía intravenosa en ratones huésped, incluyendo un animal ingenuo como control.

3. Citometría de Flujo

  1. 18-24 horas después de la inyección de sangre TLC cosecha o el bazo (u otros tejidos de interés) de los ratones receptores.
  2. Preparar suspensión de células individuales de los tejidos por maceración a través de un tamiz con poros de 70 micras con un émbolo de la jeringa de 5 ml.
  3. Resuspender las células en hasta 65 x 10 6 células / ml en PBS que contenía 0,1% de BSA.
  4. Dispensar 100 ml de alícuotas de la suspensión celular en pocillos de una placa de microtitulación para el etiquetado de anticuerpos.
  5. Las células de la etiqueta con anticuerpos marcados con fluorocromos y sondas fluorescentes de viabilidad con fluorescencia espectralmente compatible con CFSE, CTV y CPD. Nota: Los anticuerpos para marcadores de células B tales como B220 y marcadores de activación como CD69 son esenciales para medir la activación de células B si se utiliza el FTA medir las respuestas de células T H 2. Incluya un anticuerpo para CD45.1 y / o CD45.2 si los acuerdos de libre comercio y los ratones de acogida tienen una diferencia alotípica CD45.
  6. Añadir 100 l de 2x solución madre de colorantes anticuerpos / viabilidad (en PBS que contenía 0,1% de BSA) a 100 ml de alícuotas de células, mezclar bien e incubar en hielo (4 ° C) durante 30 min.
  7. Lavar las células: células de sedimento por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante. Resuspender las células en 200 l de PBS que contenía 0,1% de BSA, las células de sedimento por centrifugación a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante.
  8. Resuspender las células en un volumen total de 400 l de PBS que contenía 0,1% de BSA, las células de filtro a través de una malla de 70 micras y analizar por citometría de flujo en un citómetro de flujo capaz de detectar los tintes y conjugados fluorescentes pertinentes. Obtener hasta 3 x 10 6 eventos de linfocitos con el fin de resolver cada grupo de células TLC y obtener suficientes células para estadísticaanálisis de cal. Nota: Asegúrese de que todos los controles típicos (tales como los controles de colores individuales) para citometría de flujo están empleados. Típicamente, CFSE requiere excitación de una fuente de láser azul (normalmente a 488 nm) y la detección de filtros de paso de banda centrado sobre 520 nm; CTV requiere de excitación de una fuente de láser violeta (normalmente a 405 nm) y la detección de filtros de paso de banda centrado en más de 450 nm; y CPD requiere de excitación de una fuente de láser rojo (normalmente a 633 nm o 640 nm) y la detección de filtros de paso de banda centrado sobre 670 nm.

4. Análisis de Datos

  1. Analizar la citometría de flujo de datos mediante software citometría de flujo estándar (ver resultado representativo para un ejemplo del tipo de estrategia de gating propia).
  2. Para% de destrucción específica, calcular el número de células en cada grupo de células TLC pulsado con péptidos de unión de clase I-MHC-y los grupos de TLC que no fueron pulsadas con péptido ("ninguna"), y usando la siguiente fórmula para calcular% Destrucción específica.
    % Destrucción específica figure-protocol-1
    Nota: En la fórmula anterior "cebado" se refiere a objetivos de animales que se cree que tienen una respuesta inmune contra los péptidos diana, "naïve" se refiere a objetivos de animales no tratados previamente, "péptido" se refiere a objetivos pulsadas con péptidos y "nula" se refiere a las metas no pulsadas con ningún péptido.
  3. Para la activación de células B como una medida de la actividad de H T, calcular la media geométrica de intensidad de fluorescencia (GMFI) de CD69 de fluorescencia de anticuerpos en células TLC B pulsadas con péptidos del MHC de clase II-de unión en animales "preparado" y de esta restar el GMFI de la expresión de CD69 en las células correspondientes TLC B en animales "naive" para dar una medida de la actividad de H T.
  4. De las estadísticas que se generan en los pasos 4.2 y 4.3, el uso desoftware de hoja de cálculo matemático tal como GraphPad Prism para calcular otros parámetros cuantitativos y cualitativos tales como el área bajo la curva y la CE 50 (en una profundidad de descripción de cómo se realizan estos cálculos para la AUC se puede encontrar en
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, y por EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Como un ejemplo de la utilización del ensayo de TLC, un ratón BALB / c fue inmunizado con el virus vaccinia recombinante (VV) que expresan epítopos del VIH-I (VV-VIH) y las respuestas a los epítopos de CTL VIH-I, de la mordaza, de la mordaza de mut, Env y Pol, el VV CTL epítopos F2L y mut F2L, y el epítopo de células VIH-I T H, Gag Th (como se describe en 2) se evaluó a través de un parámetro de 252 TLC ensayo (Figura 1B). Epítopo variantes de la mordaza (mut GAG) y F2L (mut F2L) n...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La ventaja de ensayos basados ​​en TLC es que permiten la discriminación de> 250 poblaciones de células objetivo viable y completamente funcional de un solo animal huésped por citometría de flujo. Esto proporciona un nivel de complejidad a fluir ensayos in vivo basados ​​en citometría de que no ha sido posible antes. Esto se pone de relieve en los 2 experimentos con animales muestran arriba, donde las respuestas a 7 epítopos virales distintas a 6 concentraciones podrían ser monitoreados en réplicas ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas del proyecto # 1010395 (BQ y CP) y # 525431 (CR), y un Programa de Subsidios # 455395 (CP) de la Salud y medicina Consejo de Investigación Nacional de Australia, el Centro Australiano para la hepatitis y el VIH Virología EOI 2012 de subvención (CR y JJR) y una beca de la Fundación Gordon Bootes y Gretel (BQ y CR). Queremos agradecer Harpreet Vohra y Michael Devoy por su excelente mantenimiento del laboratorio JCSMR FACS, el Fondo para la Investigación del Cáncer de Australia Fundación de Recursos Biomolecular, JCSMR, ANU, para la síntesis de péptidos, y el Dr. David Boyle, CSIRO animales Laboratorios de Salud, Geelong, Australia para proporcionar a las poblaciones parentales vacunas contra el VIH.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RPMISigmaR8758
Suero fetal para ternerosSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anti-CD69 violeta brillante 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
Centrífuga VortexScientific Industries Inc
Citómetro de flujo Eppendorf
(Fortessa o equivalente con fuente láser azul, roja y violeta)BD Bioscience

Referencias

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Matriz de Objetivos FluorescentesCitometr a de FlujoMarcado con Colorante VitalPulsado con P ptidos del MHCCellTrace VioletTinci n con CFSEColorante de Proliferaci n CPDR plicas IntraensayoEvaluaci n In vivo
El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.