ADN-ARN combinado fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

Resumen

La hibridación fluorescente in situ (FISH) permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo dentro de las células. Se describen un protocolo para el combinado, la detección simultánea de ARN y ADN por medio de pescado, que se puede utilizar para estudiar inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón.

Resumen

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica molecular que permite la detección de ácidos nucleicos en las células. FISH de ADN se utiliza a menudo en la citogenética y el diagnóstico del cáncer, y puede detectar aberraciones del genoma, que a menudo tiene importantes implicaciones clínicas. ARN FISH se puede usar para detectar moléculas de ARN en las células y se ha proporcionado información importante en la regulación de la expresión génica. La combinación de ADN y ARN FISH dentro de la misma célula es técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN de pescado podría ser demasiado fuertes para moléculas de ARN de cadena simple frágiles. Damos a conocer un protocolo de fácil aplicación que permite a la combinada, la detección simultánea de Xist ARN y el ADN codificado por los cromosomas X. Este protocolo FISH de ADN-ARN combinado probable que se puede aplicar a otros sistemas en los que necesitan tanto ARN como ADN para ser detectado.

Introducción

El estudio de las células y los tejidos mediante hibridación in situ fluorescente (FISH), desde su introducción a finales de 1970 ^1, permite a los investigadores estudiar los genes, la organización de la cromatina y la expresión génica a nivel subcelular. FISH ADN se utiliza con frecuencia en citogenética, cariotipo ^2, el diagnóstico del cáncer ³ y antes de la implantación de cribado genético ^4, y tiene un papel importante en la investigación molecular ^{de 5-6,} ya que permite la detección de ácidos nucleicos en su ambiente nativo. Análisis de la expresión de células individuales por ARN FISH puede detecta....

Protocolo

1. Inducción de la diferenciación de células madre embrionarias Mujer para inducir inactivación del cromosoma X

NOTA: las células madre embrionarias de ratones hembra (disponibles bajo petición) se cultivan en condiciones normales de células ES en placas de cultivo gelatinizados recubiertas con fibroblastos de embriones de ratón (MEFs). Estamos aquí, suponemos que el lector está familiarizado con las técnicas de cultivo celular convencionales ^39-41. Para inducir la diferenciación, las células ES cultivadas en placas de T25 serán separados de las MEFs, y se colocaron en placas en medio de diferenciación.

1. Retire medio ....

Resultados

Usando el protocolo antes mencionado para combinado de ADN-ARN FISH, hemos sido capaces de visualizar inactivación del cromosoma X en la diferenciación de células madre embrionarias femeninas. Figura 1 muestra un ejemplo representativo de un experimento FISH de ADN-ARN, donde se detectó tanto Xist (que es visible como una llamada de Xist ARN nube en el cromosoma X inactivo y un puntito basal de transcripción en el cromosoma X activo), y una región del cromosoma X, que es visible como u.......

Discusión

Combinado de ADN-ARN FISH puede ser técnicamente difícil, ya que las condiciones adecuadas para el ADN FISH pueden ser demasiado fuertes para las moléculas de ARN menos estables. Varios enfoques se han aplicado al estudio de ambos ADN y el ARN en la misma célula, evitando la necesidad de incubación simultánea con sondas de detectar tanto el ADN y el ARN. Por ejemplo, en un enfoque de superposición, se realiza primero FISH ARN y las células son expuestas, y se toman las coordenadas. Posteriormente, los mismos portaobjeto.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
		madre embrionarias de ratón hembra	estarán disponibles a pedido
Los			de ratón pueden derivarse de embriones E13.5 o a través de fuentes comerciales por ejemplo, Medio
			de cultivo celular Millipore ESDMEM, 15% suero fetal de ternero, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, aminoácidos no esenciales, 0,1 mM γ-mercaptoetanol y 1.000 U/ml de LIF. Filtre, esterilice y almacene en 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
LIF	Chemicon	ESG1107
DMEM	Invitrogen	11960085
Suero de ternera fetal	Invitrogen	10099141
Penicilina– estreptomicina (100x)	Invitrogen	15140-122
Aminoácidos no esenciales	Invitrogen	11140-050
γ-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M7522
ES medio			IMDM-Glutamax, 15% suero de ternera fetal inactivado por calor, 100 U/ml penicilina, 100 mg/ml estreptomicina, aminoácidos no esenciales, 37.8 μ l/L de monotioglicerol y 50 μ g/ml de ácido ascórbico
IMDM-Glutamax	Invitrogen	31980-030
Ácido ascórbico (50 mg/ml)	Sigma-Aldrich	A4403
monotioglicerol	Sigma-Aldrich	M6145
T25 placas de cultivo celular	Greiner Bio-one	690160
placas de cultivo celular de 6 pocillos	Greiner Bio-one	662160
grado de cultivo celular PBS	Sigma-Aldrich	D8537
tripsina-EDTA 0,25% (v/v) de tripsina/0,2% (p/v) de EDTA en PBS	Gibco	25200-056
Tubos Falcon Falcon		352196
cubreobjetos de 24 x 24 mm	Menzle	780882
gelatina	Sigma-Aldrich	G1890-100G	preparar una solución de PBS de gelatina/cultivo celular al 0,2% y autoclave
Pepsin	Sigma-Aldrich	P7000	Diluido al 0,2% en 0,01 m de HCl (pH 2,0)
absoluto 100% etanol	Sigma-Aldrich	32221-2,5L	utiliza agua absoluta 100% libre de etanol y ARNasa para hacer soluciones de etanol al 70% y al 90%
agua libre de ARNasa	Puntas
Rainin	Bio Clean	GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F
kit de etiquetado de digoxigenina (traducción de DIG-Nick)	Kit
(traducción de Biotin Nick)	Roche	11745824910
Sephadex G50	Sigma-Aldrich	G5080
jeringa de 2 ml	BD Plastipak	300013
algodón
Tubos Eppendorf	Eppendorf
levadura ARNt 10 mg/ml	Invitrogen	15401-029
Salmón Esperma ADN 10 mg/ml	Invitrogen	15632-011
ratón cuna-1 ADN 1 mg/ml	Invitrogen	18440-016
Eppendorf microcentrífuga de sobremesa	Eppendorf Modelo	5417R
Centrífuga refrigerada Eppendorf	Eppendorf	Modelo 5810R
2 M NaAc, pH 5.6	Sigma-Aldrich	S7670
50+ solución			hibridación 50% formamida, 2x SSC, 50 mM tampón de fosfato pH 7, 10% sulfato de dextrano pH 7
formamida	Acros organics	3272350000
sulfato de dextrano	Fluka	31403
10 mM tampón de fosfato, pH 7			añadir 57,7 ml de 1 M Na2HPO4 y 42,3 ml de NaH2PO4 NaH2; use agua tratada DEPC y
tampón			70% formamida/2x SSC/10 mM tampón de fosfato pH 7
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287
2 M Tris solución
Tris-solución salina-Tween (TST)			100 ml 10x solución salina, 50 ml 2M Tris, 500 μ l Tween-20, agregue agua libre de ARNasa hasta que 1 L
10x solución			disuelva 85 g de NaCl en 1 L de H2O libre de ARNasa, y autoclave
Tris-saline-BSA (TSBSA)			500 μ l 10x solución salina, 250 μ l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml libre de ARNasa H2O
BSA, purificado, 100x	New England Biolabs	B9001S
anticuerpo anti-excavación para ovejas	diagnostics		use 1:500 diluido en TSBSA
anticuerpo anti-ovejas de conejo conjugado con FITC	Jackson labs		use 1:250 diluido en TSBSA
anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con FITC	Jackson los		utilizan 1:250 diluido en
el anticuerpo anti-biotina de ratón	uso de		1:200 diluido en el anticuerpo anti-ratón de burro TSBSA
conjugado con Rhodamine	Jackson los laboratorios		1:250 diluido en TSBSA
anticuerpo anti-caballo cabra conjugado con Rhodamine	Jackson los laboratorios		utilizan 1:250 diluido en TSBSA
Solución de lavado tris-salina (TS)			10 ml de solución salina 10x, 5 ml 2 M Tris, 85 ml de ARNasa libre de H2O Medio de
miscroscopio
esmalte
DAPI	Vectorlabs	H-1200

Las células fibroblastos embrionarios de diferenciación celular de de filtro estériles Baxter TKF7114 de etiquetado de biotina Roche 11745816910 esterilizado30120086 de de desnaturalización en autoclave de pH 7.5 salina Roche laboratorios TSBSA diagnóstico Roche utilizan montaje Vectashield con fluorescente de de uñas