Un método de permeabilización de Drosophila Los embriones para ensayos de moléculas pequeñas Actividad

El embrión de Drosophila sigue siendo un modelo principal de investigación de los mecanismos fundamentales del desarrollo ^2. Este poderoso modelo se apoya en una amplia gama de herramientas de genética molecular que permiten la manipulación de prácticamente cualquier gen en cualquier punto del tiempo y dentro de cualquier órgano en desarrollo. El pequeño tamaño, el rápido desarrollo, y una amplia caracterización de la morfogénesis del embrión de Drosophila lo convierten en un modelo de elección para las pantallas de genética, muchos de los cuales han descubierto vías fundamentales de desarrollo ^3,4. Numerosos fenotipos en el embrión de Drosophila han sido caracterizados y son fáciles de interpretar, a menudo proporcionando un medio para identificar los mecanismos genéticos moleculares subyacentes responsables de un rasgo anormal.

Históricamente, una deficiencia del modelo de embrión de la mosca ha sido la dificultad de la introducción de pequeñas moléculas a tejidos embrionarios. Este obstáculo ha planteado limitaciones sobre: ​​1) nosción conocidas pequeñas moléculas bioactivas como sondas para interrogar a los mecanismos de desarrollo y 2) el uso de este modelo establecido para evaluar la actividad teratogénica o farmacológica de moléculas pequeñas no caracterizados. Como consecuencia, el potencial de detección de la embrión de la mosca se ha infrautilizado en la caracterización de pequeña molécula de la actividad.

Entrega de pequeñas moléculas para el embrión de la mosca se puede lograr con dos métodos: 1) permeabilización de la cáscara de huevo y 2) de microinyección. Este artículo presenta los avances en el método de permeabilización que son fáciles de ejecutar en el entorno de un laboratorio de Drosophila convencional. Cabe señalar que los recientes avances en los métodos de microinyección con tecnología de microfluidos también está contribuyendo a los métodos de introducción de compuestos en el ^5,6 embrión. La introducción de moléculas para el embrión es impedido por una capa cerosa de la cáscara del huevo ^7. La cáscara de los huevos de Drosophila se compone de cinco capas. Desdeadentro hacia afuera son: la membrana vitelina, la capa cerosa, la capa coriónica interior, el endochorion y la exocorion ^8. Las tres capas coriónicas exteriores se pueden eliminar mediante una breve inmersión del embrión en lejía diluida, un paso conoce como dechorionation. La capa cerosa expuesta puede entonces verse comprometida por la exposición a disolventes orgánicos, tales como heptano y octano ^7,9, haciendo que el embrión dechorionated permeable, mientras que permanece encerrado en la membrana vitelina subyacente. Sin embargo, el uso de estos disolventes introduce complicaciones debido a su toxicidad y la dificultad en la regulación de su fuerte acción permeabilizante, ambos de los cuales tienen efectos negativos sobre Stark ^9,10 viabilidad de los embriones.

Un método de permeabilización utilizando una composición denomina embrión permeabilización de disolvente (EPS) ha sido previamente descrito ^1. Este disolvente consiste en tensioactivos d-limoneno y derivados de las plantas que permiten que el disolvente sea misciblE con tampones acuosos. La baja toxicidad de d-limoneno y la capacidad para diluir el disolvente a concentraciones deseadas ha producido un método eficaz para generar embriones permeables con alta viabilidad ^1. Sin embargo, dos factores endógenos han continuado para llevar limitaciones a la aplicación. En primer lugar, los embriones demuestran la heterogeneidad de la permeabilidad después del tratamiento de EPS, incluso cuando se tiene cuidado de mantener la estadificación del desarrollo de cerca. En segundo lugar, los embriones mayores de aproximadamente ocho horas han demostrado ser difícil para permeabilizar, consistente con un endurecimiento de la cáscara del huevo que se produce después de la puesta de huevos ^11.

Descrito aquí están los avances en el método de EPS que: 1) ayudar en la identificación y el análisis de los embriones casi idénticamente permeabilizadas, incluso después de las etapas de fijación y inmunoticción se han ejecutado y 2) permiten la permeabilización de los embriones en los puntos de tiempo de desarrollo tardías (> 8 horas, el escenario 12 años o más). Específicamente, la aplicación de un colorante rojo lejano,Ácido carboxílico Cy5, se describe que sirve como un indicador de la permeabilidad, que persiste en el embrión durante el desarrollo y después de la fijación de formaldehído. Además, se muestra que la cría de los embriones a los 18 ° C mantiene la cáscara del huevo en un estado sensible EPS, lo que permite la permeabilización de los embriones de etapa tardía (etapas 12-16).

Estos avances superan las limitaciones mencionadas anteriormente en la metodología EPS. Por tanto, esta aplicación proporcionará a los investigadores una manera de introducir pequeñas moléculas de interés para el embrión en puntos de tiempo de desarrollo distintas, manteniendo la viabilidad.

1. Preparación de los cultivos de la mosca, soluciones y dispositivos para la manipulación de embriones

1. Preparar un cultivo en jaulas de Drosophila. Coloque 500 + apareamiento moscas de la cepa deseada en una jaula de población provista de una placa de agar-uva 10 cm y un lugar de pasta de levadura. Mantener la cultura en una incubadora a 25 ° C Humedad. Nota:   Culturas jaula requieren uno o dos días de condicionamiento para obtener patrones de embriones por el que se coherentes. Placas de uva con pasta de levadura se cambian una vez por la mañana y otra por la noche durante el acondicionamiento.
2. Preparar EPS. Soluciones calientes de tensioactivos (cocamida DEA y alcohol etoxilado) a 37 ° C. Pipetear 18 ml de d-limoneno a un vial de centelleo de vidrio equipado con una pequeña barra de agitación. Pipetear 1 ml de cada uno de los dos tensioactivos (concentración final de 5% de cada uno) a la d-limoneno. Mezclar bien y retirar una barra de agitación. NOTA: Esta solución madre de EPS es bueno para unos 2 meses a temperatura ambiente. La solucióndebe ser calentado a 37 ° C y agitó por rotación para solubilizar completamente los tensioactivos antes de su uso. EPS y d-limoneno se deben almacenar en un recipiente de vidrio, ya que se disolverán algunos plásticos con el tiempo.
3. Prepare la solución dechorionation embrión, medios de incubación, teñir y soluciones de drogas. Mezclar 25 ml de cloro con 25 ml de _H2O y colocar en un plato poco profundo. Preparar medio modificado básico de incubación (MBIM) y MBIM-T de acuerdo a la receta antes ^1,12. Preparar Shields y Sang M3 medio de cultivo celular y PBS de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Lista de Materiales). Preparar la solución madre de tinte permeabilización en 10 mM de concentración en DMSO.
4. Montar dispositivos y suministros embrión de manejo:
   1. Preparar dechorionation y cesta tratamiento EPS (ver Figura 1 A). Cortar una sección de 3 cm de polipropileno de 50 ml centrífuga tubo desechable / cultura con una sierra de dientes finos. Hacer el rubor superficie de soldadura por frotamiento la sección del tubo de papel de lija adheridoa una superficie de mesa. Soldar la sección de tubo de malla de nylon Nitex a fundiendo el borde de la sección de tubo sobre una llama y presionando a la malla en una placa de vidrio. Deje enfriar y corte de malla extra. NOTA: Los lados escarpados y el fondo permiten un enjuague rápido y completo fuera de cloro residual y EPS en los pasos respectivos. Los pasos de soldadura deben llevarse a cabo bajo una campana de humos.
   2. Prepare una canasta de desarrollo. Cortar parte superior de una centrifugadora de tubo de 50 ml / cultura a ras con el borde de la tapa. Eliminar y modificar la tapa cortando una abertura central y muescas a lo largo de la llanta como se muestra en la Figura 1B. Atornille la tapa sobre la malla y en la rosca de la sección del tubo de corte y recorte de malla extra. NOTA: La tapa contiene muescas en el borde que permita la difusión al medio mayor cuando se encuentra en el 60 mm placa de depósito (Figura 1B ').
   3. Preparar los componentes de una cámara de diapositivas. Corte un cuadrado de membrana DO que es mayor quela abertura de la cámara de diapositivas. Aplique una capa muy fina de grasa de vacío en el labio interior de la abertura. Coloque la membrana de oxígeno en el sellado contra la grasa con el anillo de retención de apertura. Recorte el exceso de membrana DO cortando de nuevo cerca del anillo de retención. NOTA:. Especificaciones de la cámara de diapositivas se pueden encontrar en Kiehart et al ¹³ Esta cámara no está disponible comercialmente y no requiere fabricación a la medida por un taller mecánico.

2. Staging, Dechorionation y EPS Tratamiento de Embriones

1. Staging embriones mediante la recolección oportuna. Fije una placa de uva / levadura fresca a la jaula de la cultura mosca en la AM. Permitir que los embriones que se establezcan durante 1 hora a 25 ° C. Descartar esta placa y reemplazar con una placa de uva / levadura fresca para una colocación posterior de embriones de 2 horas a 25 ° C. Reunir esta placa y lugar en 18 ° C incubadora para su posterior puesta en escena del desarrollo. NOTA: 1 hr de desarrollo a 25 ° C es igual a 2 h de desarrolloa 18 ° C. El efecto de envejecimiento a 18 ° C frente a 25 ° C en el mantenimiento de EPS permeabilización en embriones de etapa tardía se puede ver en la Figura 2.
2. Dechorionation. Enjuague suavemente los embriones fuera de la placa de la uva en la cesta de malla utilizando 25 ° C el agua del grifo y un pincel. Enjuague el exceso de levadura lejos de los embriones en el cesto bajo un chorro suave de agua del grifo. Sumerja la canasta en el 50% de lejía durante 2 min. Lave los embriones a fondo bajo un chorro de agua del grifo. NOTA: rociar suavemente solución de cloro en los embriones de forma intermitente con una pipeta de plástico. Mientras que 2 minutos suele ser suficiente para dechorionation completa, este tiempo de incubación debe comprobarse por examen directo y se ajusta en consecuencia. Mantener embriones dechorionated en el cesto inmersos en el agua del grifo y proceder de inmediato a la etapa EPS.
3. Tratamiento EPS
   1. Preparar seis platos de 60 mm con aproximadamente 10 ml de PBS en cada uno. Preparar EPS dilución disolviendo 75 mu l EPS en 2.925 ml MBIM (1:40) en un vaso de precipitados de 50 ml de vidrio con agitación. Nota: Un blanco forma una emulsión de esta mezcla.
   2. Secar el exceso de agua de la parte inferior de la cesta de malla con un laboratorio de limpiar. Sumerja cesta en EPS diluidas en vaso y de inmediato girar para dispersar los embriones en la solución de EPS en el fondo de la cesta. Continuar remolinos de movimiento durante 30 segundos. NOTA: EPS diluciones y tiempos de exposición pueden ser variadas para controlar la permeabilidad. Se recomienda que EPS óptimas diluciones y tiempos de tratamiento se establecerán empíricamente con las cepas de moscas que se utilizan. Aumentando el tiempo de exposición a 60-90 seg es favorable para la etapa 12 y embriones de más edad.
   3. Quite la canasta, seque el exceso de EPS con un laboratorio de limpiar. Proceder con seis lavados secuenciales en 10 ml de PBS en los platos de 60 mm. Usar una pipeta de plástico para rociar suavemente con PBS embriones en cada uno de los seis lavados. Proceder a teñir y etapas de tratamiento de drogas. Nota: EPS pueden eliminarse por el desagüe.

3. Tinte de Drogas y Tratamiento de permeabilizada embriones

1. Tinte Tratamiento
   1. Añadir 5 l de 10 mM de CY5 colorante ácido carboxílico * a 1 ml de MBIM-T (50 mM de concentración final) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y agitar para mezclar. NOTA: * Elección de colorante depende de análisis de aguas abajo. Carboxílico CY5 es eficaz para su posterior análisis mediante la fijación y la inmunotinción. Rodamina B es útil para el análisis de embriones vivos. La emisión roja de Rodamina B, y la emisión verde de sus metabolitos ^1, puede presentar algunas complicaciones con aplicaciones posteriores utilizando fluorescencia. Fármaco o toxina se pueden añadir a la solución de tinte para iniciar el tratamiento en esta etapa, o para limitar el tratamiento de fármaco / toxina a un pulso en esta etapa. Se debe tener cuidado al manejar y disponer de fármacos y toxinas según MSDS y normas de seguridad ambiental.
   2. Transferencia de embriones de la canasta de malla para la solución de colorante utilizando un pincel. Tapar el tubo e invierta varias veces para asegurar laembriones flotan libremente en suspensión en la solución de colorante. Coloque el tubo en un agitador oscilante durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   3. Retire el tubo de nutator y dejar los embriones se depositan. Retire la solución de tinte con una pipeta fina y reemplazar con 1 ml de MBIM-T para lavar. Invertir el tubo para resuspender completamente embriones. Deje que los embriones se depositan y repetir con tres más lavados MBIM-T. Retire todo MBIM-T de enjuague final y proceder al paso de incubación.
2. Incubación para el Desarrollo de Embriones
   1. Transferencia de embriones a una de dos cámaras: La cesta desarrollo o la cámara de diapositivas. NOTA: La cesta de desarrollo se prefiere para períodos de desarrollo más largos, y es necesario si de fijación y de inmunotinción pasos subsiguientes son para ser ejecutado. La cámara de diapositivas es óptimo para time-lapse de una resolución más alta y es más eficaz durante períodos cortos de desarrollo (por ejemplo, los primeros eventos embrionarias). Fármaco o toxina se pueden añadir al medio a varias concentraciones y embrión desarrollo se puede controlar en tiempo real con embriones vivos o en un punto final usando la fijación estándar y protocolos de inmunotinción.
   2. Desarrollo en Cestas
      1. Limpie una canasta desarrollo por chorros con etanol al 70%, enjuague bien con agua desionizada y séquela con laboratorio de limpiar. Preparar 6 ml de medio de incubación con la concentración deseada de fármaco o toxina. Coloque la cesta del desarrollo en el medio en 60 mm plato toma cuidado de no atrapar burbujas de aire debajo de la base de malla. NOTA: Dos medios de comunicación se utilizan comúnmente: solo MBIM, o MBIM/M3 en una mezcla 50:50, siendo este último más eficaz para períodos más largos de desarrollo.
      2. Transferencia de embriones permeabilizadas para engranar la superficie en la base de la cesta con un pincel. Rociar suavemente los embriones con los medios de comunicación desde el depósito de los alrededores. Dispersar los embriones con el pincel de manera que están en una monocapa sobre la malla. Nota: Continúe con imágenes de microscopía y evaluar permeabilización y viabilidad características de la preparation (ver paso 4).
   3. Desarrollo de la Cámara de diapositivas
      1. Invertir cámara de portaobjetos y aplique una pequeña gota de grasa de vacío en el perímetro de la abertura. Coloque 150 l de medio con la cantidad deseada de fármaco o toxina en la superficie de la membrana de la DO dentro de la abertura. NOTA: Dos medios de comunicación se utilizan comúnmente: solo MBIM, o MBIM/M3 en una mezcla 50:50, siendo este último más eficaz para períodos más largos de desarrollo.
      2. Transferencia de embriones permeabilizadas a la caída de los medios de comunicación con un pincel. Dispersar los embriones que hacen a establecerse en la membrana dentro de la gota.
      3. Aplique cuidadosamente un cubreobjetos circular de 25 mm sobre la abertura de aplanamiento de este modo el medio. Presione hacia abajo suavemente a lo largo del perímetro del cubreobjetos para formar un sello con la grasa. Nota: Proceder a la microscopía de imagen para evaluar la permeabilización y viabilidad características de la preparación (ver paso 4).

4. Identificación de permeabilizada embriones viables

1. Identificar embriones permeabilizadas. Observe embriones bajo epifluorescencia con un microscopio equipado con una cámara digital. Adquirir imágenes (en la longitud de onda azul para determinar el perfil de la yema de autofluorescencia) de varios campos mediante microscopio fijo y ajustes de la cámara.
2. Determinar la permeabilización de embriones basados ​​en la intensidad de fluorescencia relativa. Utilice un estereomicroscopio con una distancia de trabajo grande para acomodar la cesta y para permitir las manipulaciones de los embriones. El microscopio debe estar equipado con una etapa XYZ programable, iluminación de epifluorescencia y una cámara digital. Imagen de los embriones que se ocupan de registrar la exposición y parámetros de posición etapa de cada imagen de embriones para que la reevaluación de los mismos embriones en un momento posterior (véase el resultado representativo en la Figura 3). Nota: Los patrones de absorción de colorante variarán dependiendo del colorante utilizado, duración de la exposición y la edad del embrión. Una amplia gamade absorción de colorante a través de una sola preparación es típica y refleja la variación en el grado de permeabilización.
3. Identificar los embriones viables. Después de posición de embriones permeabilizadas marcado, continuar con el desarrollo del embrión a temperatura ambiente o 25 ° C. Canasta o cámara de diapositivas Volver al microscopio. Observe debajo de fluorescencia azul canal y adquirir una imagen de autofluorescencia yema en embriones permeabilizadas previamente identificados. Evaluar la viabilidad de acuerdo con la progresión normal de la distribución de la yema (véase Rand et al. ¹ y resultado representativo en la Figura 3). Nota: Otras características morfológicas del embrión observado con microscopia de campo claro se pueden utilizar para evaluar la viabilidad. Se recomienda que se establece el nivel de permeabilidad que es compatible con la viabilidad puede determinarse empíricamente con cada colorante y la cepa de mosca utilizado.
4. Evaluar los efectos de drogas o toxinas en los embriones viables permeabilizadas.
5. Embriones processed con el protocolo anterior están a punto para un número de convencional análisis posteriores a la droga o exposición a toxinas. Varios de los diversos tipos de análisis son considerados en la discusión que sigue, e incluyen la observación directa de la morfogénesis en embriones vivos, así como los análisis de inmunotinción posterior a la fijación. Ambos enfoques se han mejorado por el uso de colorantes vitales (por ejemplo, GFP) que revelan los patrones de expresión de genes y linaje celular y la morfología de los perfiles.

Dispositivos para la manipulación de embriones se representan en la Figura 1 para ayudar en la visualización de los dispositivos "caseros" para la manipulación de los protocolos anteriores. Resultados visto en la Figura 2 ilustran el efecto robusto de la cría de embriones a 18 ° C en su capacidad de ser permeabilizadas por EPS en las etapas tardías de desarrollo. Esta condición se aplica en la etapa de protocolo 2.1. Eficacia del colorante ácido carboxílico CY5 para revelar los diversos niveles de permeabilidad se observa típicamente en el EPS embriones tratados se ve en la Figura 3. La dinámica de desarrollo de la distribución del colorante en la yema de huevo también se observa en la Figura 3, que revela un criterio utilizado para evaluar la viabilidad , como se describe en el Protocolo paso 4.2. La utilidad de la Cy5 tinte en la determinación de embrión permeabilización posterior al tratamiento de la toxina, la fijación de formaldehído y la inmunotinción se ilustra por el resultado en la Figura 4.

Figura 2. Efecto de envejecimiento a 18 ° C sobre la eficacia EPS en embriones de etapa tardía embriones fueron recolectados durante dos horas, seguido de envejecimiento a 18 ° C durante 20 horas (paneles AA ",. (Grupo CC"). Los embriones a 18 ° C fueron entonces dechorionated y se dividieron en dos muestras. La primera muestra se trató directamente con 1 mM de rodamina B colorante en MBIM-T durante 5 min, se lavó y se visualizó bajo campo claro y fluorescencia azul y rojo canales (Grupo AA "). La segunda muestra se trató con EPS (01:10 en MBIM durante 1 min), se lavó y luego se trató con 1 mM de rodamina B durante 5 min y se lavó antes de la visualización (Grupo BB "). Los embriones planteadas a 25 ° C se dechorionated y se trataron directamente con EPS (1:10 en MBIM durante 1 min), se lavaron y después se trataron con 1 mM de rodamina B durante 5 min antes de la visualización (Grupo CC "). Los embriones se determinó que en la etapa 14 por los pliegues del intestino revelado por autofluorescencia yema en el canal azul (Panel A ', B', C '). Los embriones criados a 18 ° C son impermeables antes de la EPS treatmenT como se ve por la ausencia de absorción de rodamina B (panel A "). EPS tratamiento de 18 ° C embriones produce un alto grado de permeabilidad como se ve por la captación de rodamina B (panel B "). Los embriones planteadas a 25 º C siguen siendo impermeable incluso con el tratamiento de EPS como se ve por la exclusión de rodamina B (panel C ").

Figura 3. Incorporación de CY5 en embriones permeables y viables. Los embriones fueron recolectados a 25 ° C durante 2 horas y envejecido durante 14 horas a 18 ° C (equivalente a 7-9 embriones hr a 25 ° C, la etapa 12). Después de dechorination, EPS tratamiento se llevó a cabo (1:40 en MBIM durante 1 min) seguido de incubación en Cy5 (50 M en MBIM-T durante 15 min). Los embriones se lavaron tres veces en MBIM-T y transferidos a la cesta con el desarrollo MBIM en el depósito. Desarrollo se le permitió proceed durante 8 horas a temperatura ambiente. La captación de CY5 (rojo) se forma la imagen en el canal rojo lejano inmediatamente después del tratamiento de tinte y lavado (Panel A) y después de 8 horas de desarrollo (Grupo B). Distribución de la yema de huevo es visto por autofluorescencia en el canal azul. Absorción de colorante, por lo tanto, la permeabilidad, se considera para variar de embrión a embrión. Cy5 (rojo) se ve para localizar a la yema (azul), que se convierte en concentrado a la luz del intestino en la etapa 16 (púrpura, panel B).

Figura 4. Determinación de permeabilización y metilmercurio efectos en los embriones fijos y inmuno. Los embriones fueron recolectados a 25 ° C durante 2 horas y envejecido durante 14 horas a 18 ° C (equivalente a 7-9 embriones hr a 25 ° C, la etapa 12). Después de dechorination, se realizó el tratamiento de EPS (1:40 en MBIM durante 1 min) seguido de incubación enCy5 (50 M en MBIM-T durante 15 min), junto con el metilmercurio (MeHg M 50, panel B) o el control de disolvente DMSO (concentración final 0,1%, Panel A). Los embriones se lavaron con MBIM-T y se colocan en una cesta con el desarrollo MBIM: medio M3 en el depósito y se envejeció durante una 8 horas adicionales a temperatura ambiente. Los embriones fueron fijados en una de dos fases 4% de paraformaldehído preparación-heptano por un protocolo estándar 14. La tinción se realizó con anti-fasciclina II (verde en A, B y blanco en A ', B') para etiquetar las neuronas motoras y los anticuerpos anti-elav (rojas en A, B) para etiquetar todos los cuerpos celulares de las neuronas. Cy5 se revela por fluorescencia directa, lo que requiere una exposición prolongada, debido a la intensidad de fluorescencia disminuida debido a la fijación (CY5 es azul en todos los paneles de color pseudo). Los efectos de MeHg se observan en el patrón irregular y clusteanillo de los cuerpos celulares de las neuronas chordotonal laterales (elav positivo, etiquetadas en rojo y marcados con flechas blancas en B frente a A). Además, una característica de la ramificación segmentaria (SN) (flechas verdes sólidos en A ') se ve que es muy variable con la exposición MeHg (flechas verdes sólidos en B ") consistente con los efectos descritos anteriormente de MeHg en el embrión 15. Proyección de la intersegmental y segmentaria nervios en sus raíces se ven a desplazarse posteriormente a la exposición MeHg (flecha verde abierto en B '). Nota: El metilmercurio es una neurotoxina potente. Se debe tener cuidado de usar guantes y protección ocular al manipular. El vertido deberá hacerse a través de una instalación de seguridad del medio ambiente institucional y de servicios.

Los autores no tienen nada que revelar.