Introducción de pequeñas moléculas para el desarrollo de embrión de Drosophila ofrece un gran potencial para la caracterización de la actividad biológica de nuevos compuestos, fármacos y toxinas, así como para sondear las vías fundamentales de desarrollo. Los métodos descritos en este documento describen los pasos que superan las barreras naturales de este enfoque, la ampliación de la utilidad del modelo de embrión de Drosophila.
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Artículo de método
Un método de permeabilización de
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Resumen
Resumen
El embrión de Drosophila ha sido durante mucho tiempo un modelo de laboratorio de gran alcance para dilucidar los mecanismos moleculares y genéticos que controlan el desarrollo. La facilidad de manipulaciones genéticas con este modelo ha suplantado enfoques farmacológicos que son comunes en otros modelos animales y ensayos basados en células. A continuación se describe los recientes avances en un protocolo que permite la aplicación de pequeñas moléculas a la fruta en desarrollo embrión de la mosca. El método de detalles de medidas para superar la impermeabilidad de la cáscara del huevo, mientras que el mantenimiento de la viabilidad del embrión. Cáscara de huevo de permeabilización a través de una amplia gama de etapas de desarrollo se logra por aplicación de un d-limoneno embrión permeabilización descrito anteriormente disolvente (EPS 1) y por el envejecimiento de los embriones a temperatura reducida (18 ° C) antes de los tratamientos. Además, se describe el uso de un colorante rojo lejano (Cy5) como un indicador de la permeabilización, que es compatible con aplicaciones posteriores que implican estándar gripe rojo y verdecolorantes orescent en preparados en vivo y fijos. Este protocolo es aplicable a los estudios que utilizan compuestos bioactivos para investigar los mecanismos de desarrollo, así como para los estudios dirigidos a evaluar la actividad teratogénica o farmacológica de moléculas pequeñas no caracterizadas.
Introducción
El embrión de Drosophila sigue siendo un modelo principal de investigación de los mecanismos fundamentales del desarrollo 2. Este poderoso modelo se apoya en una amplia gama de herramientas de genética molecular que permiten la manipulación de prácticamente cualquier gen en cualquier punto del tiempo y dentro de cualquier órgano en desarrollo. El pequeño tamaño, el rápido desarrollo, y una amplia caracterización de la morfogénesis del embrión de Drosophila lo convierten en un modelo de elección para las pantallas de genética, muchos de los cuales han descubierto vías fundamentales de desarrollo 3,4. Numerosos fenotipos en el em....
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Protocolo
1. Preparación de los cultivos de la mosca, soluciones y dispositivos para la manipulación de embriones
- Preparar un cultivo en jaulas de Drosophila. Coloque 500 + apareamiento moscas de la cepa deseada en una jaula de población provista de una placa de agar-uva 10 cm y un lugar de pasta de levadura. Mantener la cultura en una incubadora a 25 ° C Humedad. Nota: Culturas jaula requieren uno o dos días de condicionamiento para obtener patrones de embriones por el que se coherentes. Placas de uva con pasta de levadura se cambian una vez por la mañana y otra por la noche durante el acondicionamiento.
- Preparar EPS. Soluciones c....
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Resultados
Dispositivos para la manipulación de embriones se representan en la Figura 1 para ayudar en la visualización de los dispositivos "caseros" para la manipulación de los protocolos anteriores. Resultados visto en la Figura 2 ilustran el efecto robusto de la cría de embriones a 18 ° C en su capacidad de ser permeabilizadas por EPS en las etapas tardías de desarrollo. Esta condición se aplica en la etapa de protocolo 2.1. Eficacia del colorante ácido carboxílico CY5 para revelar lo.......
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Discusión
El método anterior describe un medio para la obtención de embriones de Drosophila viables que sean accesibles a los pequeños tratamientos de moléculas a través de una amplia gama de desarrollo. Este método introduce el nuevo hallazgo y simple que el envejecimiento de los embriones a 18 º C permite la permeabilización de embriones de etapa tardía con la misma eficacia que visto previamente sólo en embriones en etapa temprana. Además, el uso de la Cy5 tinte ácido carboxílico rojo lejano como un indicador de la pe.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por R03ES021581 NIH/NIEHS (otorgado a M.D.R.) y por el Centro de Salud Ambiental de la Universidad de Rochester (NIH/NIEHS P30 ES001247).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jaula para moscas | Flystuff.com | 59-101 http://flystuff.com/general.php | |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | solicita un pedido especial | http://www.stepan.com/ |
| Alcohol etoxilado [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | solicita un pedido especial | http://www.stepan.com/ |
| d-limoneno (grado de pureza ultra alta) | Florida Chemical Co. | convocatoria para pedido especial | http://www.floridachemical.com/ |
| Hipoclorito de sodio | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS polvo | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamina B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 ácido carboxílico | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields y Sang M3 medio | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Malla de nylon Nitex | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Membrana de oxígeno disuelto (OD) | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular n.º 1 deslizamiento de cubierta | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Mezcla de placas de uva y agar | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
Referencias
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J. Drosophila blastoderm patterning. Curr Opin Gene....
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