Un método Aclaración Nueva visualizar biliar Degeneración Durante Hígado metamorfosis en la lamprea de mar ( Petromyzon marinus)

Resumen

Lamprea de mar pierde la vesícula biliar y los conductos biliares durante la metamorfosis, un proceso similar a la atresia biliar humano. Un nuevo método de fijación y aclaración (CLARITY) se modificó para visualizar todo el árbol biliar mediante microscopía confocal de barrido láser. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la degeneración biliar.

Resumen

La atresia biliar es una rara enfermedad de la infancia, con un estimado de 1 en 15.000 de frecuencia en el sureste de los Estados Unidos, pero más común en los países del este de Asia, con una frecuencia reportada de 1 en 5000 en Taiwán. Aunque se sabe mucho sobre la gestión de la atresia biliar, su patogenia sigue siendo difícil de alcanzar. La lamprea marina (Petromyzon marinus) ofrece una oportunidad única para examinar el mecanismo y la progresión de la degeneración biliar. Lamprea de mar se desarrollan a través de tres etapas de la vida distintas: larva, parasitarias y adultos. Durante la transición de larvas a juveniles parasitaria, la lamprea de mar sufren metamorfosis con dramática reorganización y remodelación en la morfología externa y los órganos internos. En el hígado, todo el sistema se pierde biliar, incluyendo la vesícula biliar y el árbol biliar. Un nuevo método desarrollado la llamada "CLARIDAD" se modificó para aclarar todo el hígado y el cruce con el intestino en metamórfica lamprea de mar. Laproceso de degeneración biliar fue visualizado y discernido durante la lamprea de mar metamorfosis mediante el uso de microscopía confocal de barrido láser. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar la atresia biliar en un modelo animal único.

Introducción

Lamprea de mar desarrollarse a través de tres etapas de la vida distinta ^1,2. Lamprea marina larvas (L) pasan la mayor parte de tiempo en madrigueras como filtradores bentónicos. Después de pasar por siete etapas metamórficas de cambios drásticos en la morfología externa y la reorganización de los órganos internos ^3, a los juveniles (JV) entran en una etapa parasitaria durante el cual se alimentan de sangre y fluidos de los tejidos del pez hospedador, el aumento de la masa corporal de más de 100 veces . 1.0 del a 1,5 años que se alimentan de los peces de acogida en el mar o grandes lagos, los adultos dejan de alimentación durante el comienzo de ....

Protocolo

1. Preparación de la Solución

1. Hacer 1 L de 10x 0,1 M solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4): Pesar 26,2 g de fosfato de sodio (monobásico), 115 g de fosfato de sodio (dibásico), y 87,66 g de NaCl. Disolver en aproximadamente 800 ml de H ₂ O destilada, ajustar el pH, y llevar el volumen hasta 1 litro con _H2O destilada
   1. Hacer 1 L de solución salina tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4): Tomar 100 ml de 10x PBS y añadir 900 ml de _H2O destilada
   2. Hacer 1 L de 0,1 M de tampón fosfato salino (pH 7,4) con 0,1% de Triton X-100: Tomar 100 ml de 10x de PBS, añadir 1 ml de Triton X-100, y llevar el volumen hasta 1....

Resultados

Varios acontecimientos importantes del desarrollo se producen en el sistema hepatobiliar durante la lamprea de mar metamorfosis. El conducto biliar y la vesícula biliar sufren apoptosis y degenerado (Figura 1). Combinando el método de clarificación modificado y tinción con hígado marcador de células citoqueratina 19 (CK19, presente en ambos cholangiocytes y hepatocitos antes y después de la metamorfosis ¹³⁾ y Bcl2 marcador anti-apoptótica usando microscopía confocal, todo el sistema biliar fu.......

Discusión

Este protocolo se modificó a partir de un nuevo método llamado "claridad" ^12, que se reticula tejido intacto con poliacrilamida para formar un hidrogel nanoporoso, y luego despoja de la membrana plasmática del tejido para conseguir la transparencia óptica y la permeabilidad macromolecular. "CLARIDAD" permite obtener imágenes de los tejidos intactos de proyección de largo alcance y el cableado del circuito local en el sistema nervioso. Este nuevo método se puede utilizar para visualizar tod.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
40% acrilamida	Bio-Rad	161-0140
2% bis-acrilamida	Bio-Rad	161-0142
TEMED	Bio-Rad	161-0800
persulfato de amonio	Sigma	A3678-25G
ácido bórico	Sigma	B7901-1KG
saponina	Sigma	47036
dodecil sulfato de sodio	Sigma	L337-500G
fosfato de sodio (monobásico)	Sigma	04269-1KG
fosfato de sodio (dibásico)	Sigma	S5136-1KG
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
glicerol	Sigma	G9012-500ML
16% paraformaldehído	Ciencias de Microscopía Electrónica	15710-S
Pellets de NaOH	EMD	SX0590-3
Tubos de centrífuga de 15 ml Herramientas	de cualquier marca
	Cualquier marca

de disección