El estudio de ADN Looping por FRET sola molécula

Resumen

Este estudio presenta un procedimiento experimental detallado para medir la dinámica de bucle de ADN de doble cadena utilizando una sola molécula de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). El protocolo también se describe cómo extraer la densidad de probabilidad de bucle llamado factor J.

Resumen

De flexión de ADN de doble cadena (dsDNA) se asocia con muchos procesos biológicos importantes, tales como el reconocimiento de DNA-proteína y el empaquetamiento del ADN en nucleosomas. Termodinámica de ADN de doble cadena de flexión se ha estudiado mediante un método denominado ciclación que se basa en la ADN ligasa para unir covalentemente los extremos pegajosos cortos de un ADN de doble cadena. Sin embargo, la eficiencia de la ligadura puede verse afectada por muchos factores que no están relacionados con dsDNA bucle tales como la estructura del ADN que rodea los extremos pegajosos unidas, y ligasa también puede afectar a la velocidad de bucle evidente a través de mecanismos tales como la unión no específica. Aquí, se muestra la forma de medir la cinética de bucle de ADN bicatenario sin ligasa mediante la detección de la formación de bucle de ADN transitoria por FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente). moléculas de ADN de doble cadena se construyen usando un simple protocolo basado en PCR con un par de FRET y un enlazador biotina. La densidad de probabilidad de bucle conocido como el factor de J se extrae de la tasa de bucle y la tasa de recocido entre dos desconexiónted extremos pegajosos. Al poner a prueba dos dsDNAs con diferentes curvaturas intrínsecas, se muestra que el factor J es sensible a la forma intrínseca de la ADN de doble cadena.

Introducción

La comprensión de las propiedades mecánicas de ADN de doble cadena es de importancia fundamental en las ciencias básicas y aplicaciones de ingeniería. La estructura de ADN de doble cadena es más complicado que una escalera helicoidal recto debido ángulos de balanceo, inclinación y giro entre pares de bases sucesivas pueden variar con la secuencia. Fluctuaciones térmicas pueden provocar dsDNA a someterse a diversos modos de fluctuaciones conformacionales como la flexión, torsión y estiramiento. Transiciones de fusión tales como el retorcimiento y también pueden ocurrir en condiciones extremas.

Entre estos movimientos, dsDNA flexión tiene e....

Protocolo

1. Preparación de la muestra de ADN bicatenario

1. Diseñar ADNs curvas a nivel mundial mediante la repetición de una secuencia de 10-mer. Por ejemplo, 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) ₇ - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'es un ADN curvada 186-pb donde X es una base adicional al azar y la secuencia que flanquea la secuencia de 10-mer repitiendo son secuencias adaptadoras.
   NOTA: En este ejemplo se seleccionaron dos 10-meros con preferencias opuestas a la formación de nucleosomas en base a un estudio a gran escala de ocupación nucleosoma por Kaplan et al ^15.. Desde la repetición helico....

Resultados

Moléculas de ADN utilizados para el estudio de bucle consisten en una región dúplex de la secuencia y longitud variables y salientes monocatenarios que son complementarios entre sí. Los salientes, que son 7 bases de longitud, pueden hibridar entre sí para capturar el estado de bucle. Cada saliente contiene ya sea Cy3 o Cy5 que está vinculado en la columna vertebral del ADN a través de la química amidita. El Cy5-alero también está vinculado con biotina-TEG (15-átomo de Tetra-etilenglicol espaciador) para la inmovilizació.......

Discusión

Se utilizó un ensayo simple de una sola molécula basado en FRET para estudiar la cinética de bucle de ADN de diferentes formas intrínsecas. ADNs curvados se pueden preparar mediante la repetición de una secuencia de 10-mer, en fase con el período helicoidal de 10,5 pb, y sus curvaturas pueden ser estimados utilizando la página. Estos dsDNAs están diseñados con extremos pegajosos para permitir la estabilización transitoria de bucle. Se extrajo la tasa de bucle desde el aumento exponencial en el número de moléculas en buc.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de extracto FRAG de ADN pequeño-100PR	VWR	97060-558
Solución de acrilamida al 40% 500 ml	VWR	97064-522
Solución de bis-acrilamida al 2% (p/v) 500 ml	VWR	97063-948
GeneRuler Escalera de ADN de 100 bp, 100-1.000 pb	Fermentas	SM0241
Mini Sistema PAGE Vertical	VWR	89032-300
Filtro de jeringa 0,2 μ m CS50	VWR	A2666
Trolox	Sigma-Aldrich	238813-1G	Extintorador de estado triplete
Ácido protocatecuico (PCA)	Sigma-Aldrich	08992-50MG	sistema de eliminación de oxígeno
Protocatecuato 3,4-dioxigenasa (PCD)	Sigma-Aldrich	P8279-25UN sistema de eliminación de	oxígeno
mPEG-silano, MW 2.000 1 g	Laysan Bio	MPEG-SIL-2000-1g
Biotina-PEG-Silane, MW 3,400	Laysan Bio	Biotina-PEG-SIL-3400-1g
Avidin, NeutrAvidin Proteína de unión a biotina	Invitrogen	A2666
Phusion Polimerasa de ADN de alta fidelidad de inicio en caliente	New England Biolabs	F-540L
Kit de extracción de fragmentos de ADN en gel/PCR	IBI Scientific	IB47020
Portaobjetos de microscopio de vidrio liso de primera calidad	Fisher Scientific	12-544-1
VWR Micro cubreobjetos, rectangular, n.º 1	VWR	48404-456
Fisher Scientific Isotemp 1006S Enfriador/calentador de recirculación	Fisher Scientific		control de temperatura
Objetivo Collar de enfriamiento	Bioptechs	150303	control de temperatura
KMI53 Biológico Micrómetro Platina de medición	Semprex	KMI53
Láser DPSS de alto rendimiento 532 nm 50 mW	Óptica	Edmund NT66-968	Excitación Cy3
CUBE Fibra Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fibra, Conector FC/APC Coherente		1139604	Excitación Cy5
650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter	Semrock	FF650-Di01-25x36	dicroico
Combinador de haz LaserMUX, refleja 514.5, 532 y Láseres de 543,5 nm, 25 mm	Semrock	LM01-552-25	combinando Filtro de fluorescencia dicroico
Brightline 593/40	Semrock	FF01-593/40-25 Filtro de	emisión Cy3 Filtro de paso
largo EdgeBasic LWP de 635 nm, 25 mm	Semrock	BLP01-635R-25	Filtro de emisión Cy5
Tecnología EMCCD iXon+	Andor Marco	DU-897E-CS0-#BV
IX51	Olympus
Objective UApo N 100X/1.49 Aceite TIRF	Olympus
Aceite de inmersión tipo-F para microscopía de fluorescencia	Olympus	IMMOIL-F30CC
2 mm Diámetro 45° Lente de varilla recubierta de aluminio	Edmund optics	54-092	espejo en miniatura
1/4" de recorrido etapa de traducción de un solo eje	Thorlabs	MS-1	traducción de espejo en miniatura
y Oslash; Doblete acromático de 1", ARC: 400-700 nm, f=200 mm	Lente de enfoque Thorlabs	AC254-200-A
Ranura mecánica ajustable	Thorlabs	VA100
Espejo dieléctrico	Thorlabs	BB1-E02
Ø Doblete acromático de 1", f = 100 mm	Thorlabs	AC254-100-A lente	relé
Montura de lente para Ø Óptica de 1"	Thorlabs	LMR1
Montura de filtro dicroico	Thorlabs	FFM1
Plataforma de cubo de jaula fija	Thorlabs	B3C
Montura cinemática para Ø Óptica de 1"	Thorlabs	KM100
N-BK7 lente plano-convexa, y Oslash; 1", f = 40 mm	Thorlabs	LA1422-A	lente colimadora
N-BK7 lente plano-convexa, Ø 6,0 mm, f = 15 mm	Thorlabs	LA1222-A	telescópica
N-BK7 Lente plano-convexa, Ø 6,0 mm, f = 150 mm	Lente telescópica	Thorlabs	LA1433-A