Desde Voxels al Conocimiento: Una Guía Práctica para la segmentación del Complejo Microscopía Electrónica 3D-Data

Summary

El cuello de botella para la microscopía electrónica 3D celular es la extracción de características (segmentación) en mapas muy complejos de densidad 3D. Hemos desarrollado un conjunto de criterios, que proporciona orientación sobre qué enfoque de segmentación (manual, semiautomático o automático) es el más adecuado para los diferentes tipos de datos, proporcionando así un punto de partida para la segmentación efectiva.

Abstract

Enfoques modernos de microscopía electrónica 3D han permitido recientemente visión sin precedentes de la organización ultraestructural 3D de células y tejidos, lo que permite la visualización de grandes máquinas macromoleculares, tales como los complejos de adhesión, así como estructuras de orden superior, tales como el citoesqueleto y orgánulos celulares en su respectivo contexto celular y tisular. Dada la complejidad inherente de los volúmenes celulares, es esencial para extraer primero las características de interés con el fin de permitir la visualización, cuantificación, y por lo tanto la comprensión de su organización 3D. Cada conjunto de datos se define por las características distintas, por ejemplo, la relación señal-ruido, nitidez (nitidez) de los datos, la heterogeneidad de sus características, hacinamiento de características, presencia o ausencia de formas características que permiten una fácil identificación y el porcentaje de todo el volumen que una región específica de interés ocupa. Todas estas características deben ser consideradosla hora de decidir qué enfoque tomar para la segmentación.

Los seis conjuntos de datos 3D ultraestructural distintos presentados fueron obtenidos por tres imágenes diferentes enfoques: tomografía electrónica manchado incrustado resina, se centró de iones de haz y la microscopía electrónica de barrido cara- bloque serial (FIB-SEM, SBF-SEM) de las muestras ligeramente manchadas y muy manchadas , respectivamente. Para estos conjuntos de datos, se han aplicado cuatro enfoques de segmentación diferentes: (1) la construcción de modelos totalmente manual seguido únicamente por la visualización del modelo, (2) segmentación de trazado manual de los datos seguidos por la representación de la superficie, (3) enfoques semi-automatizado siguieron por la representación de la superficie, o algoritmos de segmentación de diseño personalizado (4) automatizados seguido por la representación de la superficie y el análisis cuantitativo. Dependiendo de la combinación de las características del conjunto de datos, se encontró que típicamente uno de estos cuatro enfoques categóricos supera a los otros, pero dependiendo de la secuencia exacta de criterios, more de un enfoque puede tener éxito. Basándose en estos datos, se propone un esquema de clasificación que clasifica tanto objetivas características del conjunto de datos y criterios subjetivos personales para el análisis de los diferentes conjuntos de datos.

Introduction

Tradicionalmente, la microscopía electrónica de campo (EM) se ha dividido en 1) la rama de la biología estructural mediante resolución TEM de alta y súper alta, por lo general se combina con los datos implícitos o explícitos con un promedio de investigar la) estructura tridimensional (3D de complejos macromoleculares con una composición definida y típicamente un tamaño relativamente pequeño ^1-4, y 2) la rama de formación de imágenes celular en el que la totalidad de escenarios celulares se visualizan ^1,5,6. Mientras que la rama de la biología estructural ha experimentado un desarrollo espectacular en los últimos cuatro decenios, la rama de biología celular se restringe sobre todo a dos dimensiones, a menudo en muestras de menos-que-óptimamente conservados. Sólo con el advenimiento de la tomografía de electrones en la última década ha célula biológica imagen ultraestructural ampliado en la tercera dimensión ^5,7, donde normalmente un promedio no se puede realizar como los escenarios móviles, y por lo tanto las características de interés, suelen ser único.

Aunque escenas celulares visualizados son a menudo impresionante para el ojo, la extracción eficiente de las características de interés y el posterior análisis cuantitativo de tales volúmenes celulares altamente complejas queda atrás, en parte porque la composición de proteínas precisa generalmente se desconoce, por lo tanto haciendo que sea difícil de interpretar estos celular volúmenes 3D. Para esta fecha, la amplia experiencia biológica es a menudo necesaria para poder interpretar las tomografías complejas, o incluso para identificar las regiones importantes y componentes esenciales en el volumen 3D. Como una complicación adicional, la visualización de volúmenes 3D es notablemente no trivial. Volúmenes 3D pueden ser considerados y, por tanto visualizar como pilas de imágenes 2D. Inspección rebanada por rebanada de imágenes 2D secuenciales reduce la complejidad, pero también los límites de extracción de características y el análisis cuantitativo de este modo a las dos dimensiones. Sin embargo, para la mayoría de los objetos en 3D, la representación de volúmenes 3D como meramente una pila de planos consecutivos conduce a una incompleta unad perspectiva sesgada en la naturaleza de un sistema en particular 3D. Los modos alternativos de inspección visual requieren o bien representación de volumen o de la prestación de la superficie, lo cual dado-la naturaleza a menudo densa de un volumen celular-puede conducir fácilmente a una vista obstruida de objetos anidados o abrumar a un usuario por completo, con lo que la segmentación manual interactivo difícil.

Para remediar estas barreras, una gran variedad de extracción de características automatizado (segmentación) enfoques han sido desarrollados que son típicamente densidad-o ^8-10 basado en gradiente. Sin embargo, estos métodos tienden a segmentar todo el volumen sin tener en cuenta cuáles son las áreas o características son de interés para el experto, aunque algunos métodos recientes pueden dirigirse a una característica específica de interés, tales como los filamentos de actina ^11. Además, los programas de ejecución de segmentación automatizado a veces pueden resultar en la producción de un gran número de sub-volúmenes (por ejemplo, al aplicar Immersio cuencan segmentación) que a menudo necesitan ser fusionado vuelta manualmente en que comprende toda la característica de interés o ser sujeto a una mayor segmentación. Esto es válido en particular para los conjuntos de datos complejos y llenos de gente, por lo que los algoritmos informáticos más representación son incapaces de extraer sólo las características de interés con fidelidad, y los esfuerzos sustanciales de curación por un experto a menudo son necesarios para producir un volumen segmentado deseada.

Por otra parte, las soluciones personalizadas a un problema muy específico se publican a menudo como un documento de reunión científica, con poco o ningún énfasis en haciéndolos amplia y completas herramientas accesibles a los investigadores que no tienen un conocimiento profundo de los campos de las matemáticas, la informática y / o gráficos por ordenador. Un entorno de software de programación adaptable, que contiene una serie de bibliotecas de análisis de imagen, puede ser un conjunto poderosa herramienta que permite a los usuarios escribir sus propios módulos de manera eficiente para la segmentación precisa. Sin embargo, este enfoque requiere extformación Ensive y un fondo en ciencias de la computación con el fin de aprovechar sus muchas características o capacidades para el análisis de imágenes. Uno puede trabajar dentro de un entorno de software versátil para determinados conjuntos de datos donde las características son más escasos, por ejemplo, mediante la utilización de potentes enfoques basados ​​en la forma que se basan en la geometría única de "plantillas" para separar los objetos de interés de su entorno ^12,13 .

Una variedad razonable de los paquetes de visualización de gráficos de ordenador existe para la segmentación manual interactivo y la construcción de modelos. Algunos paquetes están disponibles en el mercado, mientras que otros son de origen académico y distribuidos de forma gratuita, tales como: la Universidad de California en San Francisco Chimera ^14, Universidad de Colorado IMOD ^15, y la Universidad de Texas, Austin VolumeRover ^16. Sin embargo, la gran variedad y complejidad de las características y capacidades de estos programas poseen agudice la curva de aprendizaje de each. Ciertos programas de visualización proporcionan modelos geométricos simples, tales como bolas y palos de diferentes tamaños, que se pueden colocar en los mapas de densidad con el fin de crear un modelo simplificado del volumen 3D compleja. Estos modelos permiten mediciones geométricas y volumétricas simples y por lo tanto, van más allá de la "imagen bonita". Tal trazado manual de objetos funciona bien para volúmenes donde sólo un pequeño número de objetos necesidad de ser rastreado y se extrajo. Sin embargo, el reciente desarrollo de gran volumen de formación de imágenes 3D ultraestructural utilizando microscopía electrónica de barrido de haz de iones focalizado (FIB-SEM) ^17-20 de bloque serial o microscopía electrónica de barrido cara (SBF-SEM) ²¹ presenta la complicación adicional de que el tamaño de los datos 3D conjuntos pueden ir desde gigabytes a decenas y cientos de gigabytes e incluso los terabytes. Por lo tanto, estos grandes volúmenes 3D son prácticamente inaccesibles para la extracción de características manual, y por lo tanto eficiente semi-automatizado hazaña guiada por el usuarioUre extracción será uno de los cuellos de botella para el análisis eficiente de volúmenes 3D en el futuro previsible.

Presentado aquí son cuatro enfoques diferentes de segmentación que se utilizan habitualmente en una gran variedad de tipos de imágenes biológicas. Estos métodos se comparan entonces para determinar su eficacia para diferentes tipos de conjuntos de datos, lo que permite una recopilación en una guía para ayudar a los biólogos a decidir lo que puede ser el mejor enfoque de segmentación para la extracción de características eficaz de sus propios datos. Como los manuales de usuario detallados están disponibles para la mayoría de los programas descritos, el objetivo no es hacer que los potenciales usuarios familiarizados con cualquiera de estos paquetes particulares. En cambio, el objetivo es demostrar los puntos fuertes y las limitaciones de estas diferentes estrategias de segmentación mediante su aplicación a seis ejemplo conjuntos de datos con características diversas. A través de esta comparación, un conjunto de criterios se han desarrollado que se basa tanto en las características de la imagen objetiva de laConjuntos de datos 3D, como el contraste de datos, vivacidad, hacinamiento, y la complejidad, o se derivan de consideraciones subjetivas, como el objetivo deseado para la segmentación, las morfologías de las características para ser segmentados, la densidad de población de las características de interés, es decir, la fracción de el volumen ocupado por la característica de interés, y cómo se procede de manera óptima con recursos finitos, como el tiempo y la disponibilidad de personal. Estos diferentes conjuntos de datos de ejemplo ilustran cómo estos criterios objetivos y subjetivos pueden aplicarse secuencialmente en una variedad de combinaciones para producir un emparejamiento de ciertos enfoques de extracción de características con ciertos tipos de conjuntos de datos. Las recomendaciones que se dan se espera ayude novatos enfrentan a una gran variedad de opciones de segmentación elegir el enfoque de segmentación más eficaz para su propio volumen 3D.

Mientras que el enfoque de este trabajo es la extracción de características, la atención a la recogida de datos y los datos de pre-procesamiento es crucial para s eficientesegmentation. A menudo la tinción de las muestras puede ser desigual, y por lo tanto, posibles artefactos de tinción debe ser considerado en el procedimiento de segmentación. Sin embargo, la mancha por lo general proporciona una mayor relación señal-ruido, y por lo tanto requiere menos filtrado y otro tratamiento matemático de los volúmenes celulares, lo que potencialmente podría también resultar en artefactos. Los conjuntos de datos de imagen RAW respectivos deben ser adquiridos en los ajustes de contraste y de píxeles cámara correctos, alineados, y reconstruida en un volumen 3D. Para tomografías, imágenes alineadas se reconstruyen típicamente usando ponderado de retroproyección, y luego el conjunto de datos es generalmente sometidos a algoritmos de eliminación de ruido, tales como la difusión anisotrópica no lineal ^22, filtrado bilateral ^23, o la mediana de filtrado recursivo ^24. Datos de imágenes FIB-SEM y SBF-SEM se alinean mediante cortes consecutivos-cross correlación en XY programas que utilizan como ImageJ ^25. Mejora de contraste y filtrado se pueden aplicar para aumentar las características deinterés y así de-ruido la pila de imágenes. El filtrado puede llevarse a cabo ya sea en todo el volumen antes de la selección subvolumen o en los subvolúmenes seleccionados, como los enfoques de filtrado pueden ser computacionalmente caro. Down-muestreo de los datos (binning), que se utiliza a veces para reducir el ruido y / o la reducción de tamaño del archivo, sólo se recomienda si los datos han sido sobremuestreada significativamente en comparación con la resolución anticipada.

Después de reducción de ruido, las imágenes procesadas a continuación pueden ser segmentados por diferentes métodos, y el enfoque en este estudio está en los cuatro siguientes: (1) Manual de generación de modelo abstracto a través de la creación de un modelo de bola y el palo, (2) el trazado manual de las características de interés, (3) la densidad umbral basado automatizado, y (4) la segmentación automatizada hecho a medida a través de una secuencia de comandos para la segmentación específica del proyecto. Segmentación Boundary ⁸ y segmentación de cuencas inmersiva ¹⁰ mejores alternativas a umbral simple, pero tbueno pertenecer a la misma categoría y no se han incluido explícitamente en esta discusión.

El trazado manual de densidades requiere esbozar las características de interés, corte por corte, que permite la retención de la densidad original de las respectivas áreas subcelulares. Este enfoque permite el máximo control del proceso de segmentación, pero es un proceso tedioso y de trabajo intensivo.

Enfoques automáticos de segmentación de la densidad (y relacionados) a base de umbral son semi-automático, donde un algoritmo elige pixeles basado en un conjunto de parámetros definidos por el usuario. Varios (gratis) paquetes de visualización académicas, como UCSF Chimera, IMOD, Fiji ^26, y VolumeRover están disponibles, así como comercial (que requieren licencias pagadas) paquetes, y ambos tipos suelen incluir uno o más de estos enfoques de segmentación. Los paquetes de software utilizados en este trabajo para ilustrar estos diferentes métodos incluyen tanto programas comerciales y s abiertos académicosOurce programas para generar manualmente un modelo abstracto, así como la segmentación manual y automatizado densidad. Sin embargo, el software de código abierto puede a veces ofrecer opciones más avanzadas a través de la posibilidad de personalización.

Una comparación de estas técnicas que utilizan diferentes tipos de conjuntos de datos llevó a la siguiente presentación de las normas y directrices sobre la forma de abordar la segmentación de los diversos volúmenes 3D de datos biológicos, que a nuestro entender no ha sido aún publicados. Por lo tanto, esta es la primera comparación sistemática de los diferentes enfoques y su utilidad en conjuntos de datos con diferentes características para los usuarios con diferentes objetivos.

Protocol

1. Manual Abstraído Modelo Generación

Nota: Los detalles de la metodología se describen a continuación son específicos de la quimera, pero otros paquetes de software pueden utilizarse en su lugar. Utilice este enfoque cuando el único objetivo es crear un modelo geométrico (por ejemplo, un modelo de bolas y palo) con el fin de realizar mediciones geométricas, en lugar de mostrar la forma del volumen de los objetos.

1. Importe el volumen de datos en un programa adecuado para la generación manual de modelo abstracto.
   1. Seleccione Archivo> Abrir mapa para tirar el cuadro de diálogo Abrir archivo. Navegue hasta la ubicación del archivo de mapa deseado.
   2. Tire hacia arriba de la Volume Viewer (Herramientas> Datos de Volumen> Volume Viewer) y seleccione Opciones> Estilo de visualización para mostrar los datos con diferentes estilos de reproducción.
   3. Ajuste el umbral de la pantalla arrastrando la barra vertical en el histograma en el Visor de volumenventana.
2. Navegue a través del volumen 3D (por ejemplo, rebanada por rebanada) para seleccionar un área de interés para la segmentación y aflora una sub-volumen más pequeño si es necesario.
   1. En el cuadro de diálogo Visor de volumen, haga clic en Eje, a continuación, seleccione X, Y o Z.
   2. En el cuadro de diálogo Visor de volumen, seleccione Características> Planes. Haga clic en uno para establecer la profundidad para mostrar el plano correspondiente al número en el cuadro de la izquierda y haga clic en Todas para ver todos los planos.
   3. En el cuadro de diálogo Visor de volumen, seleccione Opciones> Selección Subregión.
      1. Haga clic y arrastre para crear un cuadro rectangular alrededor de la región de interés.
3. Coloca los marcadores a lo largo de la característica de interés y conectarlos con engarces en su caso (a menudo realizan automáticamente por el programa) hasta que el modelo se ha completado.
   1. Desde la barra de menú Volume Viewer, seleccione Herramientas>Diálogo trazador de volumen para abrir el diálogo de Tracer volumen. En el cuadro de diálogo de Tracer Volumen, seleccione Archivo> Nuevo Set Marker.
   2. En el cuadro de diálogo de Tracer Volumen, comprobar Mouse> Coloque los marcadores en alta calidad, Coloque marcadores en los aviones de datos, mover y cambiar el tamaño de los marcadores, Link nuevo marcador al marcador seleccionado, y Link marcadores seleccionados consecutivamente.
   3. Haga clic en la muestra de marcador de color y seleccione un color. Repita este paso para Enlace color.
   4. Ingrese radios para los elementos de construcción de modelos de marcadores y enlaces.
   5. En la ventana de Tracer Volumen, seleccione Coloque marcadores utilizando el botón [derecha] ratón e inserte radios para los marcadores y enlaces.
   6. Haga clic derecho sobre los datos de volumen para iniciar el que se establecen los marcadores. Los marcadores se conectarán automáticamente.
   7. En el cuadro de diálogo de Tracer Volumen, seleccione Archivo> Guardar conjunto marcador actual, a continuación, Archivo> Cerrar marcador conjunto.
4. Abra un nuevo conjunto marcador (Paso 1.3.1) para comenzar a construir un modelo en una segunda característica de interés deseado. Utilizar colores contrastantes entre conjuntos de marcadores para enfatizar las diferencias en características.

2. Rastreo Manual de Funciones de interés

Nota: Los detalles de la metodología se describen a continuación son específicos de Amira, pero otros paquetes de software pueden utilizarse en su lugar. Utilice este método cuando la densidad de población es relativamente pequeña y cuando la precisión de extracción de características es de suma importancia, como el trazado manual es un enfoque mucho tiempo.

1. Datos sobre el volumen de importación en un programa con las opciones de rastreo manual. Software con esta capacidad en general ofrecen al menos una herramienta básica pincel.
   1. Para grandes volúmenes o tomografías (por ejemplo, de 16 bits 2048 x 2048 o mayor .rec o .mrc tomografías generada en IMOD): Seleccione Open Data> clic derecho sobre filename.rec> Formato ...> Seleccione Raw como LargeDiskData > Aceptar> Cargar. Seleccione Parámetros de datos crudos adecuado de la información de cabecera> Ok. Alternar y Guardar como un nuevo filename.am archivo para su uso en los siguientes pasos.
   2. Para los archivos de menor tamaño de imagen 3D de pila (por ejemplo, .tif 3D o .mrc o rec): Datos Abiertos> Seleccionar filename.tif o filename.mrc. Activar y haga clic derecho> Guardar como filename.am . Si se genera un error o el programa no responde, el archivo puede ser demasiado grande y se puede abrir siguiendo el Paso 2.1.1.
2. Navegue a través de los cortes para seleccionar un sub-volumen 3D para la segmentación, y después recortar a esta área de interés.
   1. En la ventana Visor 3D, seleccione Orthoslice abrir el archivo de imagen. Usar control deslizante en la parte inferior para desplazarse a través de las rebanadas.
   2. Para recortar datos más grandes abiertos como LargeDiskData, toggle nombre del archivo en la ventana de piscina> Haga clic derecho> LatticeAccess. Enter Tamaño de la caja deseada> Aplicar. Guardar nuevo archivo.
3. Crear archivo de segmentación.
   1. Mueva el archivo en la ventana de piscina> Haga clic derecho> Etiquetado> LabelField. Un nuevo archivo se creará y se carga automáticamente en la pestaña Segmentación Editor.
4. Trazar la frontera de la primera característica de interés, a continuación, rellene el trazo a mano o mediante el uso de un comando específico para el software utilizado. Siga la característica de interés a través de todas las divisiones y repetir la segmentación trazado manual. Utilice los siguientes comandos al utilizar Amira:
   1. Para utilizar la herramienta Pincel, alterar el tamaño del pincel como se desee, a continuación, utilizar el puntero del ratón para trazar la frontera de la característica de interés.
   2. Llene el área de trazado con acceso directo "f". Añadir a la selección haciendo clic en el botón con el signo más o el acceso directo "a". Si es necesario, pulse "u" para deshacer, y "s" para restar o borrar.
5. Generar un renderizado de superficie para la visualización y cualitativa básica o análisis cuantitativo por el software de instrucciones guía del usuario.
   1. En la pestaña piscina de objetos, cambiar el nombre del archivo-labels.am en la ventana de piscina> Haga clic derecho> SurfaceGen.
   2. Seleccione Propiedades superficiales deseadas> Aplicar. Un nuevo filename.surf archivo se creará en la piscina.
   3. Para visualizar el volumen segmentado, alternar filename.surf en ventana piscina> Haga clic derecho> SurfaceView.
   4. Utilice las herramientas de la ventana 3dviewer para mover, rotar y hacer zoom en el volumen 3D.
6. Extraer las densidades exactas y determinar medidas, como el volumen o superficie. Exportación a otros programas de visualización más avanzado, análisis y simulación.
   1. En la ventana de 3dviewer, haga clic en la herramienta Medida> Seleccione la opción adecuada (longitud y ángulo 2D 2D para mediciones en un solo plano 2D, 3D longitud y ángulo 3Dpara mediciones en un volumen 3D).
   2. Haga clic en la superficie de malla para medir la longitud deseada, la distancia y los ángulos. Los valores se muestran en la ventana Propiedades.

3. automatizado de segmentación basada en la densidad

Nota: Los detalles de la metodología se describen a continuación son específicos de Amira, pero otros paquetes de software pueden utilizarse en su lugar.

1. Utilice este enfoque en conjuntos de datos con cualquier variedad de contraste, nitidez, o hacinamiento de retirar las densidades de interés.
2. Datos sobre el volumen de importación en un programa dotado de umbral, varita mágica, u otras herramientas basadas en la densidad para la segmentación automática. Siga los pasos descritos en 2.1-2.1.2 en las instrucciones para el trazado manual.
3. Navegue a través de las rebanadas y seleccionar el área para la segmentación. Si es necesario, recortar un sub-volumen 3D más pequeña para la segmentación. Siga los pasos descritos en 2.2-2.2.2 en las instrucciones para el trazado manual.
4. Seleccione la densidad deuna característica de interés, normalmente haciendo clic o la colocación de un punto de marca o de anclaje en la función. Si se permite en el software, introduzca un rango de números que abarca intensidad de los píxeles de la función y ajustar esta tolerancia si lo deseas. Densidades pertenecientes a la característica serán recogidos de conformidad con la intensidad de valor de píxel o la tolerancia del ancla. Utilice los siguientes comandos al utilizar Amira.
   1. Utilice la herramienta Varita mágica para las características con márgenes distinguibles.
      1. Haga clic en el área de interés, y luego ajustar los deslizadores en pantalla y Masking para capturar correcta gama de valores para que la característica está totalmente destacó. Añadir selección con acceso directo "a".
   2. Utilice la herramienta Umbral de características sin márgenes claramente distinguibles.
   3. Seleccione el icono Umbral. Ajuste el deslizador para ajustar la densidad dentro del rango deseable de manera que sólo las características de interés están enmascarados. Haga clic en el botón Seleccionar, a continuación, agregar la selección con acceso directo220; un ".
   4. Para toda segmento de volumen, seleccione Todos los cortes antes de añadir selección.
   5. Para eliminar el ruido, seleccione Segmentación> Eliminar Islas y / o segmentación> etiquetas suaves.
5. Generar una superficie para la visualización y el análisis cualitativo como se describe en la sección de trazado manual 2.6-2.6.2. Si se desea, la exportación a otros programas para la visualización 3D adecuado, análisis cuantitativos y simulaciones.

4. hecho a medida Automated Segmentación

Nota: Utilice este método para crear secuencias de comandos personalizadas para la segmentación automática, que requiere experiencia previa en informática, pero permite la posibilidad de crear un modelo preciso de la densidad de un gran volumen.

1. Herramientas (Ejemplo de una segmentación de Shape-Supervisado en MATLAB ²⁷⁾
   1. Imagen de tratamiento previo:, mejora de la imagen de eliminación de fondo y realizar des-noisingutilizando la siguiente tubería:
      1. Cargue la imagen utilizando el comando imread.
         1. En la línea de comandos, escriba: >> im = imread ($ image_path), donde $ image_path es la ubicación de la imagen a analizar.
      2. Desde la caja de herramientas de procesamiento de imágenes, llame Wiener filtro usando una proporción estimada o conocida por el ruido-potencia de la señal (NSR).
      3. En la imagen procesada con anterioridad, llame a la función de apertura de imagen imopen para estimar la capa de fondo, a continuación, asignar el resultado como una máscara diferente.
         1. En la línea de comandos, escriba:. >> Fondo = imopen (im, Strel ($ shape_string, $ size)), en este método, $ shape_string es igual a 'disco' de $ variable de tamaño viene dado por el analizador es decir >> fondo = imopen (im, Strel ('disco', 15)).
      4. Restar la imagen filtrada con el fondo.
         1. En la línea de comandos, escriba: >> im2 = im -fondo
      5. Dependiendo de la calidad de los resultados, realice la normalización de imágenes con o sin método de adaptación de Otsu ^28, que se puede llamar mediante el imadjust función de la Imagen Processing Toolbox.
         1. En la línea de comandos, escriba: >> im3 = imadjust (IM2)
      6. Preparar las características de interés para la segmentación, la limitación de las regiones de interés recortando la imagen normalizada.
         1. El uso del comando imtool, explorar la región de interés que ha de ser cosechado y proporcionar las coordenadas para el comando: >> im3_crop = imcrop (im3, [x1 y1 x2 y2]), donde el vector [x1 y1 x2 y2] corresponde a la región cuadrada a recortar.
   2. Reconocimiento de formas / clasificación de forma supervisada: Capacitar al algoritmo, proporcionando ejemplos concretos para cada categoría diferente de los objetos (los rastros lineales en una imagen 2D a través de las características de interés).
      1. Compruebe que VLFEAT ²⁹ API se ha instalado correctamente y visitar el sitio web de VLFEAT para la documentación más detallada.
      2. En la línea de comandos, escriba: >> [ÁRBOL, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K, $ NLEAVES) donde $ K es el número de grupo para ser utilizado o el número de clases que el observador quiere organizar los datos en, y $ NLEAVES es el número deseado de racimos de la hoja, es decir >> [ÁRBOL, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4100)
      3. Utilizar las funciones segmentadas manualmente como entrada para VLFeat.
         NOTA: Esta biblioteca de código abierto basada en C realizará parches de píxel, la agrupación de parches y posicionamiento centro de la agrupación en función del tipo de método elegido para trabajar mejor para los conjuntos de datos. Las opciones disponibles van desde agrupamiento k-mean a basado Texton-se aproxima a ^30, y la salida es una matriz numérica que describe las características ideales en función de los ejemplares dados.
2. Segmentación: Utilice este fully automatizado, aunque computacionalmente costosa, enfoque para segmentar múltiples clases de objetos de forma simultánea, que se escriben como mapas separados para su posterior visualización y análisis.
   1. Cargue la matriz numérica generada anteriormente (modelo).
   2. Llame a la función de la máquina de soporte vectorial (SVM) en VLFeat, utilizando el modelo y la imagen que se segmentado como una entrada.
      1. En la línea de comandos, escriba: >> [w, b] = vl_svmtrain (x, y, 0.1), donde x es el original recortada imagen im2_crop e y es la imagen objetivo, la imagen que se ha segmentado manualmente. Utilice >> ISEG = VL_IMSEG (I, etiquetas) para dar color a los resultados de acuerdo a las etiquetas generadas por la agrupación.
         NOTA: A partir de las características del modelo, VLFeat clasificará la imagen en el número de clases (las características de interés) asignados desde el principio. Dependiendo del grado de exactitud deseado, es posible combinar este método con otros enfoques o estimación CLUSTer parámetros tales como centros de casco y de racimo. La salida del algoritmo SVM es un modelo probabilístico y múltiples máscaras binarias de las clases deseadas en los nuevos conjuntos de datos.
   3. Guardar los resultados introduciendo el comando: >> imwrite (im, $ formato, $ archivo) donde $ formato es 'TIFF' y $ nombre_archivo es la ruta para el archivo de salida.
   4. Para la visualización de imágenes, introduzca el comando: >> imshow (im).

Results

La Figura 1 muestra un flujo de trabajo típico para formación de imágenes de microscopía electrónica celular 3D, incluyendo la tomografía de electrones, FIB-SEM, y SBF-SEM. El flujo de trabajo incluye la recolección de datos en bruto, la alineación y la reconstrucción de datos en un volumen 3D, reducción de ruido a través del filtrado, y cuando sea necesario, recortar la región de interés con el fin de maximizar la eficacia de la segmentación software elegido. Tales datos preprocesado está entonces listo para la extracción de características / segmentación.

La Figura 2 ilustra el flujo de trabajo se establece en la Figura 1 con cuatro conjuntos diferentes de datos (que se introducirán más adelante), dos de los cuales son muestras incrustado en resina registrados por tomografía de electrones (figuras 2A, 2B), con los otros dos derivados de FIB -SEM y SBF-SEM, respectivamente (Figuras 2C, 2D). Imágenes en la figura 2 la columna 1 son la proyecciónVistas (Figuras 2A1, 2B1) y bloque de imágenes de la superficie (Figuras 2C1, 2D1), respectivamente, que tras la alineación y la reconstrucción se ensamblan en un volumen 3D. La columna 2 muestra rebanadas a través de este tipo de volúmenes en 3D, que en el filtrado (columna 3) muestran una reducción significativa en el ruido y por lo tanto a menudo aparecen más nítidas. Después de seleccionar y recortar el volumen 3D grande para la región de interés (columna 4), representaciones en 3D de funciones segmentadas de interés (columna 5) se pueden obtener y más inspeccionados, codificados por color y se analizó cuantitativamente.

Un total de seis conjuntos de datos 3D, conteniendo cada uno una pila de imágenes obtenidas a través de cualquiera de tomografía de electrones (3) conjuntos de datos, FIB-SEM (2 conjuntos de datos), o SBF-SEM (1 conjunto de datos) se utilizan para comparar cómo cada uno de los cuatro métodos de segmentación realizan (Figura 3). Los conjuntos de datos se derivan de una variedad de diferentes proyectos de investigación en el laboratorio y por lo tanto proporcionan arconjunto easonably diverso de conjuntos de datos experimentales típicos. Todos los conjuntos de datos fueron examinados por cuatro investigadores independientes, cada uno de los cuales están más familiarizados con un método particular, y que fueron acusados ​​de proporcionar el mejor resultado posible para cada uno de los seis conjuntos de datos.

Los conjuntos de datos son a partir de muestras de la siguiente manera: 1. Las figuras 3A1-3A5: de alta presión congelado, congelar-sustituido y embebido con resina polluelo pelo oído interno estereocilios celular ^31, 2. Las figuras 3B1-3B5: alta presión-congelado, congelación sustituido y pared celular vegetal embebida de resina (no publicado), 3. Las figuras 3C1-3C5: alta presión congelado, helada-sustituido y embebido en resina interna cinocilio las células ciliadas del oído (no publicado), 4. figuras 3D1-3D5: alta presión- congelado, helada-sustituido y bloques incrustado en resina de las mitocondrias situadas en las glándulas mamarias células epiteliales humanos HMT-3522 S1 acinos, que han sido cultivadas en laminina extracelular ricamatriz ular ^32,33, 5. Las figuras 3E1-3E5: sin manchas de sobremesa-procesado, bloques embebidos en resina de un reductor de sulfato de biopelículas bacterianas (manuscrito en preparación), y 6 figuras 3F1-3F5: límite de la membrana de las células vecinas de la HMT -3522 acinos S1.

Como se puede ver en la figura 3, los diferentes enfoques de segmentación pueden conducir a resultados similares para la mayoría de algunos tipos de conjuntos de datos, pero completamente diferentes resultados para otro tipo de datos. Por ejemplo, el conjunto de datos estereocilios de las células ciliadas (Figura 3A) produce volúmenes razonables de segmentación con los cuatro enfoques, con el modelo abstracto Manual generada por un usuario experto siendo la más clara para interpretar y medida. En este caso, dicho modelo permite mediciones rápidas de distancias de filamentos filamentos, contando el número de enlaces que se encuentran entre los filamentos alargados, así como la determinación de las partes faltantes de la mapa de densidad correspondientesa lugares donde el espécimen fue dañado durante la preparación de la muestra ^34. Dicha información es mucho más difícil de adquirir mediante el uso de los otros tres enfoques de segmentación, aunque la segmentación automatizada hecho a medida ofrece mejores resultados que el umbral puramente densidad basados.

Para la pared celular de la planta (Figura 3B), la generación de modelo manual parecía ser el más eficiente en la transmisión de un sentido de orden en la pared celular, que ninguno de los otros enfoques lograr. Sin embargo, el modelo abstracto no captura el hacinamiento de los objetos en el conjunto de datos. Manual de funciones de interés rastreo parece dar un mejor resultado que los enfoques supervisados ​​en forma a base de la densidad o. Por otro lado, el trazado manual es muy intensiva en trabajo y la identificación de las fronteras de las características es algo subjetivo. Por lo tanto, los enfoques automatizados pueden ser preferidos para la segmentación de grandes volúmenes con un potencial de compromiso entre la precisión yrecursos gastados en la segmentación manual.

Para el conjunto de datos cinocilio (Figura 3C), manual de generación del modelo abstracto produce el resultado más limpio y revela una arquitectura inesperada de tres microtúbulos en el centro de la cinocilio, un detalle que es fácilmente visible en los datos recortadas, pero perdió en todos los otros enfoques , presumiblemente debido a manchar heterogeneidad. Sin embargo, otras características potencialmente cruciales del mapa de densidad se pierden en la generación manual de un modelo abstracto. Esto es debido al hecho de que la naturaleza subjetiva de la formación de modelo manual conduce a una idealización y la abstracción de la densidad real observado, y por lo tanto a una interpretación subjetiva durante la formación del modelo. Por lo tanto, este ejemplo demuestra cómo bien manual de generación de modelo abstracto le permite a uno concentrarse en un aspecto específico del volumen 3D. Sin embargo, la percepción selectiva y la simplificación no logra hacer una relación completa de todos los co proteínamplexes presentes en el conjunto de datos. Por lo tanto, si el objetivo es mostrar la complejidad de los datos, entonces uno está mejor servido con cualquiera de los otros tres enfoques.

En el caso de la glándula mamaria acinos-matriz cultivadas 3D (Figura 3D), las mitocondrias de alto contraste están segmentados por los cuatro enfoques con facilidad, con el trazado manual de características de rendimiento no es demasiado sorprendente los mejores resultados con la menor cantidad de contaminación ( Figura 3D3). Sin embargo, el trazado manual es muy intensiva en trabajo y por lo tanto es de uso limitado para grandes volúmenes. Tanto umbral basado en la densidad y la segmentación automatizada de forma supervisada extraen las mitocondrias bastante bien, y daría lugar a una segmentación casi perfecto, si se emplean más trucos para la limpieza (por ejemplo, la eliminación de todos los objetos por debajo de un determinado umbral de densidad voxel) como disponible en diferentes paquetes. En este caso, manual de construcción de modelos abstraído no dióresultados prometedores, en parte debido a que las mitocondrias no pueden fácilmente ser aproximadas con los modelos de bola y el palo.

Con respecto a la comunidad bacteriana del suelo / biopelícula (Figura 3E), tres de los cuatro enfoques obtener resultados razonables, con la generación modelo manual no realizar bien debido al desafío de la representación de objetos biológicos, tales como bacterias, por formas geométricas. Apéndices extracelulares procedentes de las bacterias se pueden detectar en los enfoques de segmentación automatizados pero no tan bien en la localización característica manual. Supervisado en forma de segmentación automatizada hecho a medida puede separar aún más las funciones extracelulares de las bacterias a pesar de sus densidades similares (datos no presentados), lo que permite un fácil cuantificación, incluso de conjuntos de datos extremadamente grandes. Debido a que este es originalmente un conjunto de datos muy grande, la segmentación automatizada hecho a medida outcompeted claramente todos los otros enfoques, pero puede haber beneficiado de la baja complejidady la distribución relativamente escasa de los objetos de interés (bajo hacinamiento).

Al examinar la interfaz entre dos células eucariotas en un contexto similar a un tejido (Figura 3F), sólo el trazado manual de las características de interés produce buenos resultados. Enfoques automáticos de segmentación basado densidad no detectan el límite membrana entre células adyacentes por completo, e incluso los enfoques hechos a medida falla, en parte debido a la forma de una célula no es fácil de aproximarse o equipararse con formas, a pesar de su éxito claro para las bacterias en el biofilm (Figura 3E5).

La observación de la Figura 3 que los enfoques de segmentación hacen bien en algunos conjuntos de datos, pero no en otros llevó a la cuestión de lo que caracteriza a cada uno de estos conjuntos de datos, y si es posible categorizar los tipos de características de los datos o los objetivos personales que parecían coincidir bien con su respectivenfoque e. El estudio sistemático de este tema no se ha realizado previamente, y por lo tanto, como primer paso al establecimiento de una lista empírica de características de la imagen y los objetivos personales puede guiar a un novato en su intento de encontrar el mejor enfoque para la extracción de características de su respectiva serie de datos.

Se identificaron ocho criterios tan importantes se muestran en la Figura 4, y se pueden dividir en dos categorías principales: (1) las características que son inherentes al conjunto de datos, y (2) los objetivos personales del investigador y otras consideraciones que son algo más subjetiva, aunque igualmente importante. Los ejemplos mostrados se dibujan predominantemente a partir de los seis conjuntos de datos en la Figura 3, con tres conjuntos de datos adicionales están introduciendo: uno (Figura 4A1) es un crio-tomografía de una sección crio de la pared celular vegetal Arabidopsis thaliana, la segunda (figuras 4A2 , 4B1, 4D1 las figuras 3F1-3F5 pero es aún más complejo sustancialmente, y el tercero (figuras 4B2 , 4D2) es una sección de resina de tomografía interior estereocilios de las células ciliadas del oído en vista en sección transversal, similar al contenido de la muestra se muestra en la vista longitudinal en Figuress 2A1-2A5 y 3A1-3A5.

Para la categoría de los criterios objetivos como características de la imagen, se proponen cuatro rasgos inherentes a los conjuntos de datos de importancia:

1. El contraste de datos puede ser (1) baja (Figura 4A1) como es típico para las tomografías crio-EM, (2) intermedia (Figura 4A2) tales como en escenarios celulares sin orgánulo clara u otra característica prominente de pie, o (3) de alta (Figura 4A3), como es el caso para el kinocitomografía liary o los estereocilios en sección transversal, debido a la alineación de los elementos filamentosos claramente separados dentro de la dirección z.
2. Los datos pueden ser difusa (Figura 4B1), sin límites visiblemente claras entre dos objetos estrechamente posicionado, tales como células en un tejido, o crujientes (Figura 4B2), con límites bien definidos. Esto es en parte una función de la resolución de conjunto de datos, que es inherentemente superior por un factor de alrededor de 2-4 para tomografías de electrones en comparación con el FIB-SEM. Naturalmente, los límites más nítidos son deseables para ambos manual, así como los enfoques de segmentación automatizada, pero esencial para el último enfoque.
3. Los mapas de densidad puede ser lleno (Figura 4C1) tal como se refleja por los componentes de la pared celular vegetal estrechamente espaciados, o escasamente poblada (Figura 4C2), como son las bacterias en una colonia, que ejemplifica la separación que hace que la segmentación de imágenes automatizado sustancialmente más fácil.
4. Mapas de densidad pueden ser altamente complejo con muy diferentes características a menudo con formas irregulares, como el tejido de la estría vascular alrededor de un vaso sanguíneo (Figura 4D1) o objetos-orgánulos como bien definidas con una organización similar, como los estereocilios en sección transversal ( Figura 4D2).

También tenga en cuenta las muy diferentes escalas en los diferentes ejemplos, por lo que la comparación un tanto difícil.

Además de los criterios más objetivos, como características de la imagen, cuatro criterios altamente subjetivos que guiarán la selección de la ruta adecuada también se proponen:

1. Objetivo deseado: El objetivo puede ser para visualizar el haz estereocilio pelo en su complejidad y para determinar y examinar la forma del objeto (Figura 4E1), o para crear un modelo de bolas y palo simplificado y resumido que se construye en el mapa de densidad y permite un conteo rápido de unand medición de los objetos geométricos (longitud del filamento, la distancia y el número de conexiones) (Figura 4E2).
2. La morfología característica puede ser muy irregular y complejo como las células, como las zonas de interacción célula-célula (Figura 4F1), algo de forma similar con algunas variaciones, tales como las mitocondrias (Figura 4F2), o en su mayoría de forma idéntica, tales como filamentos de actina y cruz enlaces en un haz de pelo en la orientación longitudinal (Figura 4F3).
3. La proporción de la característica de interés (densidad de población) es importante, ya que uno puede desear para segmentar todas las características de un conjunto de datos 3D, como es el caso de las paredes celulares de las plantas (Figura 4G1), o sólo una pequeña fracción del volumen celular como es el caso de las mitocondrias en una escena celular heterogénea (Figura 4G2). Dependiendo del tamaño del conjunto de datos y el porcentaje de volumen que requiere la segmentación, puede ser más eficaz utilizarenfoques manuales. En otros casos, como cuando uno está interesado en una variedad de características, simplemente no hay alternativa al uso de métodos semiautomáticos de segmentación.
4. Otro criterio subjetivo clave es la cantidad de recursos que uno esté dispuesto a invertir en el proceso de segmentación y qué nivel de fidelidad es necesaria para responder a una cuestión biológica. Uno puede querer y necesidad de cuantificar los parámetros volumétricos de una función (por ejemplo, tamaño, volumen, superficie, longitud, distancia de otras características, etc), en cuyo caso puede ser necesaria más atención para obtener información cuantitativa precisa (Figura 4H1), o el propósito puede ser simplemente tomar una foto de su forma 3D (Figura 4H2). En un mundo ideal, donde los recursos son ilimitados, uno claramente no querría asumir ningún compromiso, sino más bien optar por el camino más preciso de extracción de características Manual asistida usuario. Si bien esto puede funcionar para muchos conjuntos de datos, en un futuro próximo volúmenes 3D wil l estar en el orden de 10k por 10k por 10k o superior, y la segmentación manual ya no será capaz de jugar un papel destacado en la segmentación de un espacio tan enorme. Dependiendo de la complejidad de los datos y otras características de los datos, la segmentación semi-automatizado puede convertido en una necesidad.

En la Figura 5, fortalezas y limitaciones se mencionan brevemente en los cuatro enfoques de segmentación. Los objetivos personales y características de la imagen identificados en la Figura 4 que se puede emparejar con cada enfoque se resumen así. En la figura 6, los objetivos personales y características de la imagen de los seis conjuntos de datos ejemplifican cómo triage datos y decidir sobre el mejor enfoque. Ambas figuras 5 y 6 se amplían en la discusión.

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Figura 1 Flujo de trabajo para la reconstrucción de imágenes biológicas y análisis. Esta tabla ofrece una visión general de las diversas medidas adoptadas para recopilar y procesar imágenes recogidas por la tomografía, se centró haz de iones SEM, y la cara del bloque de serie SEM. Primas resultados de la recopilación de datos en serie de inclinación 2D o secciones seriadas. Estos conjuntos de imágenes 2D deben estar alineados y reconstruidos en 3D, después se filtró con el fin de reducir el ruido y mejorar el contraste de las características de interés. Por último, los datos pueden ser segmentadas y analizadas, lo que se traduce en un modelo 3D. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2.. Ejemplos de flujo de trabajo para los diferentes tipos de datos de la tomografía y FIB-SEM Cada paso del flujo de trabajo después de la recopilación de datos se muestra a través de cuatro grupos de datos (filas AD): resina incrustados tomografía manchado de estereocilios seccionada longitudinalmente, resina incrustada tomografía manchado de la pared celular vegetal celulosa, FIB-SEM de mama mitocondrias de las células epiteliales, y SBF-SEM de E. bacterias coli. Una rebanada 2D a través de los datos en bruto se muestra en la columna 1, y una imagen de los datos después de la alineación y la reconstrucción 3D comprende la columna 2 Las técnicas de filtrado aplicadas en la columna 3, son los siguientes: filtro de mediana (A3), filtro de difusión no anisotrópico (B3), desenfoque gaussiano (C3), y el filtro imadjust de MATLAB (D3). Un ejemplo de la mejor segmentación para cada conjunto de la superficie cultivada de interés (columna 4) los datos se muestra como una representación 3D de la columna 5. barras de escala: A1-A3 = 200 nm, A4 = 150 nm, A5 = 50 nm, B1-B3 = 200 nm, B4-B5 = 100 nm, alquilo C1-C3 = 1 mm, C4-C5 = 500 nm,D1-D3 = 2 mm, D4-D5 = 200 nm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 Aplicación de cuatro segmentación se acerca a los conjuntos de datos de ejemplo de conjuntos de datos Seis ejemplo fueron segmentados por los cuatro enfoques:. Manual de generación abstracta modelo, copiado manual, segmentación automatizada basada en la densidad y la segmentación automatizada a medida. Manual generación modelo abstracto fue eficaz para la resina incrustada tomografía manchado de estereocilios (A), ya que el objetivo era crear un modelo con fines cuantitativos en lugar de extraer las densidades. Para la resina incrustada tomografía manchado de la pared celular vegetal (B), Segmenta automatizado basado en la densidadción era el método más eficaz para extraer rápidamente la celulosa a través de muchas rebanadas, donde como los métodos manuales tuvieron mucho más esfuerzo en sólo unos pocos trozos de datos. Manual de generación del modelo abstracto generado el triplete de microtúbulos en el manchado de la tomografía cinocilio (C), mientras que otros métodos de segmentación no lo hicieron, sin embargo, los dos enfoques automatizados extrae las densidades más rápidamente y por lo tanto se prefiere. Debido a la forma de las mitocondrias de FIB-SEM de células epiteliales de mama (D), el trazado manual proporcionado el resultado más limpio, y la baja densidad de población combinado con el uso de métodos de interpolación permitidos para la segmentación rápida. Dado el gran volumen que necesitaba ser segmentada, adaptada a la medida de segmentación automatizada demostró ser más eficaz para segmentar las bacterias datos SBF-SEM (E), pero ambos enfoques automáticos fueron comparables. Aunque mucho tiempo, el único método para extraer el FIB-SEM de la membrana de células epiteliales de mama (F) fue trazado manual Escala Bares.:A1-A5 = 100 nm, B1-B5 = 100 nm, C1-C5 = 50 nm, D1-D5 = 500 nm, E1-E5 = 200 nm, F1-F5, bares = 500 nm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 4. características de la imagen del objetivo y los objetivos personales subjetivas para triage de los conjuntos de datos. Usando ejemplos del conjunto de datos características, se proponen criterios para informar a una decisión en cuanto a cuál es el enfoque de segmentación de usar. Con respecto a las características objetivas, los datos sí pueden tener contraste que es bajo, medio o alto (A1-A3), ser difusa o crujientes (B1-B2), espaciados o lleno (C1-C2), y tienen complejo o simplemente características organizados (D1-D2). Objetivos personales subjetivas incluyen el o deseada bjetivo dirigidas a un modelo simplificado o la extracción de las densidades exactas (E1-E2), la identificación de una hoja enrevesado, complicado volumen, o la morfología lineal como la característica de interés (F1-F3), la elección de una alta o baja densidad de población de la característica de interés (G1-G2), y decidir sobre el equilibrio entre alta fidelidad y alta de asignación de recursos para un rendimiento decreciente de las inversiones, como el tiempo (H1-H2) Escala Bares:. A1 = 50 nm, A2 = 1,500 nm , A3 = 100 nm, 1500 nm = B1, B2 = 200 nm, C1 = 100 nm, C2 = 200 nm, D1 = 10 mm, D2 = 200 nm, E1 = 100 nm, E2 = 50 nm, F1-F2 = 500 nm, F3 = 50 nm, G1 = 100 nm, G2 = 1 mm, H1-H2 = 100 nm. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5 Cuadro comparativo de las características de los datos y subjetiva tiene como objetivo apropiado para diferentes enfoques de segmentación. Esta tabla resume las fortalezas y limitaciones de cada enfoque de segmentación. Los criterios de la Figura 4 puede ayudar a identificar qué datos son adecuados para el método de segmentación. Estas características de la imagen objetivas y objetivos personales subjetivas fueron elegidos para un uso óptimo de cada enfoque, pero diferentes combinaciones pueden dificultar o ayudar a la eficacia de la segmentación. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Decisión diagrama de flujo para una eficiente tmonio de la segmentación se acerca para conjuntos de datos con diferentes características. Sobre la base de las características resaltadas en la Figura 4, este diagrama ilustra que cuatro criterios contribuyeron más a la decisión final sobre el mejor enfoque de segmentación para cada conjunto de datos de la Figura 3. Cada conjunto de datos es un código de color para seguir rápidamente las líneas gruesas representan el proceso de toma de decisiones primaria, así como las líneas de puntos que reflejan una ruta alternativa que pueden o no conducir a la misma aproximación. Los cinocilio, bacterias y conjuntos de datos de la pared celular vegetal fueron mejor segmentados con los dos enfoques automatizados. En contraste, los caminos de la membrana celular y las mitocondrias siempre conducen a trazado manual, debido a sus características difíciles. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Las estrategias eficaces para la extracción de características relevantes de volúmenes 3D EM se necesitan urgentemente para mantenerse al día con el tsunami de datos que ha afectado recientemente imágenes biológicas. Mientras que los datos se pueden generar en horas o días, se necesitan muchos meses para analizar los volúmenes 3D en profundidad. Por lo tanto, es evidente que el análisis de las imágenes se ha convertido en el cuello de botella para los descubrimientos científicos; sin soluciones adecuadas a estos problemas, los científicos de imagen se convierten en víctimas de su propio éxito. Esto es en parte debido a la alta complejidad de los datos y también la aglomeración macromolecular se encuentran típicamente en las células biológicas, donde las proteínas y complejos de proteínas frontera uno otro y esencialmente aparecen como un gradiente continuo de las densidades de escala de grises. El problema se complica por la preparación de muestras y de imagen imperfecciones, y en algunos casos los artefactos de reconstrucción de imagen, dando lugar a menos que perfecto datos volumétricos que pueden suponer desafíos para enfoque totalmente automatizadoes. Lo más significativo, sin embargo, es el hecho de que los expertos en la preparación de muestras, proyección de imagen, y la interpretación biológica rara vez son bien versados ​​en la ciencia computacional, y por lo tanto requieren de orientación sobre la forma de abordar eficazmente la extracción y análisis de características. Por lo tanto, mediante el uso de diversos ejemplos, el protocolo se explica cómo preparar los datos para la segmentación, así como los pasos para la generación manual de modelo abstracto, la segmentación automatizada basada en la densidad, el trazado manual de las características de interés, y la segmentación automática a medida. Los enfoques manuales y automáticas descritas en el procedimiento se pueden encontrar en una gran variedad de software de segmentación, algunos de los cuales se mencionan aquí, pero otros realizan funciones similares y son igualmente adecuados.

Los resultados demuestran que la eficacia de cada uno de los enfoques de segmentación 3D varía para cada tipo diferente de conjuntos de datos. A pesar de los diferentes enfoques producen cualitativamente srepresentaciones en 3D imilar como el producto final, la cantidad de tiempo y esfuerzo gastado en cada uno durante el proceso de segmentación variado significativamente. Las recomendaciones para las características de imagen adecuados y objetivos personales por cada enfoque de segmentación se resumen en la figura 5, que se explica con más detalle en las siguientes subsecciones. Estos criterios se aplicaron a los seis conjuntos de datos, como se muestra en el diagrama de flujo de decisiones de la Figura 6. Aunque las figuras 5 y 6 son más que la intención de proporcionar una justificación para cada conjunto de datos y cómo cada uno de los criterios se ponderarán en el proceso de toma de decisiones, que no proporcionan una orientación infalible, sino más bien un punto de partida. Hay simplemente demasiados criterios que influyen en el proceso de toma de decisiones: algunos son criterios objetivos, como las características del conjunto de datos, mientras que otros son criterios más subjetivos, como el objetivo deseado. Es seguro decir que los conjuntos de datos que muestran un alto nivel contraste con los límites de nítidas, tienen características que están bien separadas y relativamente homogénea (no demasiado diversa), y se procesan con el objetivo de mostrar un modelo de densidad para un gran número de objetos, los enfoques automatizados serán superiores, si no fuera por el hecho de que los enfoques manuales serían simplemente los recursos (tiempo) -prohibitive. Por otro lado, si el contraste es bajo, los datos son difusos y por lo tanto requiere el conocimiento de un experto, los objetos están llenas de gente, y las características muestran una alta diversidad y por tanto son heterogéneos, uno puede no tener ninguna otra opción que la extracción de características manual / segmentación.

Manual Abstraído Modelo Generación

Manual modelo de rastreo abstraído es particularmente eficaz en la segmentación de elementos lineales, proporcionando semillas puntos (bolas) que se pueden conectar automáticamente (se adhiere). Tales bolas y palos-modelos pueden ser muy poderosos para medir la longitud de unnd orientación de dicho modelo y proporcionan un modelo resumido de manera adecuada, tanto para la inspección cualitativa y análisis cuantitativo. Es de uso general al minimizar los recursos invertidos en el análisis Manual generación modelo abstracto es más importante que la fidelidad absoluta a las formas de los datos originales. Es más exitosa con características lineales y homogéneos de interés (por ejemplo, filamentos, tubos). Datos contraste, nitidez, y hacinamiento no juegan un papel importante en determinar el éxito de este método, siempre que el ojo humano puede reconocer el objeto de interés. A veces estos modelos también se pueden utilizar como un esqueleto para segmentar el mapa 3D en una zona alrededor del esqueleto. Aunque el modelo es abstracta y no un reflejo de densidades exactas, representa una versión esqueleto de la densidad 3D y por lo tanto permite la visualización libre de desorden y análisis cualitativo. Las mediciones cuantitativas tales como la longitud también se pueden determinar a partir del modelo aproximado. Para unaejemplo de software con manual generación modelo abstracto, por favor visite detallado manual de usuario de quimera en línea en http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .

Rastreo Manual de Funciones de interés

Rastreo pincel manual funciona bien con casi todos los características de los datos, sino que también es la que más tiempo consume método. A veces, es la única técnica para extraer una característica de interés a partir de una imagen de conjunto complejo que contiene una gran variedad de características, tales como la membrana celular fina y complicada. Una herramienta útil disponible en algunos programas permite la interpolación entre rebanadas intermitentemente segmentados cuando la característica de interés cambia suavemente. Trazado manual se puede aplicar de manera más eficiente si los datos son crujientes y tiene medio a alto contraste, pero también puede ser utilizadopara los conjuntos de datos más exigentes, siempre y cuando el usuario está familiarizado con el objeto de interés. La complejidad de los datos puede variar de objetos discretos a los conjuntos de datos complejos y llenos de gente, donde los objetos están muy juntos. En este último caso, la segmentación manual puede ser la única opción, como aproximaciones automáticas a menudo tienen dificultades para segmentar el volumen deseado y extraer demasiado o demasiado poco. Morfologías características difíciles, tales como hojas o volúmenes contorneados, también pueden ser extraídos por este método. Sin embargo, el usuario debe tener en cuenta que un conjunto de datos con varias características difíciles sólo se puede segmentar si la densidad de población de las características de interés es baja, como la segmentación de las altas densidades de población de las características de interés se convierte en tiempo prohibitivo. Para un ejemplo de software con el trazado manual, por favor visite detallado manual de usuario de Amira en línea en http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guids.pdf.

La segmentación automatizada basada en la densidad

En contraste con las técnicas manuales, los enfoques automatizados son generalmente menos-que consume tiempo, que es un factor importante a considerar cuando la segmentación de una gran pila de imágenes. Sin embargo, un simple umbral puede no ser tan precisa, y mucho más tiempo puede ser gastado en el refinamiento y la preservación del volumen segmentado de forma automática. Segmentación automatizada basada en la densidad funciona mejor en los conjuntos de datos que muestran un gran número de características similares de interés que todos requieren segmentación. Si los datos es más compleja, estas técnicas automatizadas todavía pueden servir como un paso inicial, pero es probable que requiera alguna intervención manual en la línea con el fin de especificar un volumen secundario que contiene la característica de interés. Esta estrategia generalmente funciona bien en morfologías lineales o volúmenes enrevesadas, pero rara vez es exitoso con hojas retorcidas delgados comomembranas celulares. Mínima intervención del usuario con los enfoques automatizados permite la segmentación a través de volúmenes grandes o pequeños, mientras que gastar algunos recursos del usuario, como el tiempo a cambio de la alta fidelidad. Para un ejemplo de software con la segmentación basada en la densidad automatizado, por favor visite detallado manual de usuario de Amira en línea en http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .

Hecho a medida Automated Segmentación

Hechas a medida segmentación automatizado permite la personalización poder de algoritmos para un conjunto de datos específico, pero a menudo es específica al conjunto de datos o tipo de datos, adecuados para un número limitado de características de función, y no se puede generalizar fácilmente. El procedimiento mostrado aquí difiere de los enfoques de segmentación automatizada generales, como la inmersión de las cuencas hidrográficas y otros niveles métodos set, que se basan en una determinación programada de puntos críticos de semillas, seguido por la expansión de cubo rápido marchando a partir de estos puntos de semillas. Una variación de este tema es la segmentación del límite, donde la información de gradiente vector informa límites de las entidades. En contraste, el script personalizado utilizado aquí se basa en una etapa de formación donde el usuario traza manualmente unos pocos ejemplos. A través de la máquina de aprendizaje, algoritmos específicos detectarán y luego aprender a reconocer de forma independiente las propiedades y características de los datos que se encuentran constantemente en los rastros. Un usuario experto puede reciclar a los algoritmos y mejorar la precisión de la segmentación mediante la inclusión de más ejemplo traza para proporcionar un conjunto más amplio de criterios de características. En general, los enfoques de fijación de umbrales y enfoques relacionados, o incluso hechos a medida pueden no ser tan útil para extraer un solo rasgo de interés por parte de una imagen con el complejo de la diversidad de orgánulos o marcas, curación puede ser tan laborioso como el trazado manual.

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Estrategias para el triage de datos y elección de un enfoque de segmentación

Teniendo en cuenta los criterios subjetivos y objetivos presentados en la Figura 4 y resumen de conjuntos de datos adecuados en la Figura 5, el esquema de toma de decisión representado en la Figura 6 puede ayudar a una evaluación eficaz de las estrategias de extracción de características para una gran variedad de conjuntos de datos. Los conjuntos de datos se triaged en cuatro decisiones consecutivas, cada uno de los cuales puede incluir uno cualquiera de los cuatro objetivos respectivos, así como los cuatro criterios subjetivos introducidos en la Figura 4. Como ejemplo, la Figura 6 es el racional para triaging cada uno de los datos de seis conjuntos muestran en la Figura 3. Sin lugar a dudas, para cada conjunto de datos que no hay un solo camino único, sino más bien diferentes caminos a través de esta matriz siguiendo diferentes criterios para la toma de decisiones que pueden conducir to el mismo o diferente recomendación para la segmentación de los datos. Mientras que cada conjunto de datos tendrá su propio conjunto de propiedades, que no pueden preverse, se dan seis ejemplos, cada uno emparejado con una explicación de la razón de ser del enfoque de extracción / segmentación característica preferida. La mayoría también incluir una propuesta para una ruta alternativa de decisión que cause el uso de la misma o un enfoque de segmentación diferente (Figura 6).

El cinocilio es un conjunto con límites claramente definidos, lo que hace que los enfoques automatizados más probabilidades de éxito de datos claras. Todas las características de interés están bien separados, de nuevo a favor de un enfoque automatizado. Además, las características de interés son similares entre sí, por lo que es un conjunto de datos relativamente homogénea ideal para la segmentación a medida. Por último, el objetivo era extraer toda la función, lo que favorece un enfoque semi-automatizado. Como consecuencia, se concluyó que un umbral automático (línea verde sólido), así como (por ejemplo, la forma de segmentación supervisada) enfoque de diseño personalizado (línea verde punteada) son tanto probable que lo haga bien en este conjunto de datos.

Criterios similares, aunque colocado en un orden diferente en la red de la toma de decisiones, se aplican al caso de las bacterias. Se recomienda un enfoque hecho a medida, en parte porque este conjunto de datos era muy grande; por lo tanto, los recursos limitados prohíben que un enfoque de intervención / segmentación manual de trabajo intensivo. Mientras umbralización habría producido resultados aceptables, el enfoque de diseño personalizado era capaz de ejecutar objetivo clave del estudio para separar las formas bacterianas redondeadas de los depósitos de metal extracelulares, situados ya sea en-entre las bacterias o justo al lado de las bacterias, y por lo tanto la Se prefirió el enfoque hecho a medida.

Para los conjuntos de datos estereocilios, la primera consideración era el objetivo deseado: la meta puede ser o bien para mostrar toda la densidado para crear modelos geométricos. El volumen de interés era una zona muy concurrida, y el objetivo era segmento de un gran número de objetos como objetos separados con el fin de ejecutar posteriormente el análisis volumétrico cuantitativo, incluyendo longitudes, números, distancias, orientación, etc Fue muy útil que los objetos de interés eran principalmente lineal, y esto hizo modelo geométrico trazando el método de elección. Sin embargo, si en vez el objetivo ha sido mostrar toda la densidad, a continuación, la morfología característica lineal, así como relativamente alto contraste con límites bien definidos haría un protocolo automatizado de umbral factible.

Las membranas de las células y de los casos de datos mitocondriales son un reto para los enfoques automatizados debido a sus categorías de característica morfología: hojas y volúmenes contorneados, respectivamente. El objetivo es trazar el contorno celular o mitocondrias con precisión, pero hay recursos finitos sólo para hacerlo. Además, las características de interest es compleja y no puede ser fácilmente detectado automáticamente o forma codificada, aunque por los datos de las mitocondrias establece el enfoque scripting personalizado dado por las bacterias, posiblemente, puede ser aplicado con mayor personalización. Afortunadamente, la membrana y las mitocondrias mismas sólo representan una pequeña fracción de la totalidad del volumen y, por tanto, el trazado manual es una sencilla aunque enfoque requiere mucho tiempo. Trazado manual también es el método de elección para tales conjuntos de datos cuando el contraste es más bien baja y los límites son más bien difusa. Como resultado, incluso si constituyen una porción significativa de los conjuntos de datos, tales hojas complicadas deben ser rastreados manualmente, simplemente debido a la falta de una mejor alternativa.

El conjunto de datos de plantas plantea sus propios desafíos, ya que el objetivo era segmento de todos los objetos, que son densamente espaciados y conforman un paisaje lleno de gente. Viendo la densidad como está permitiría mediciones sobre la forma y la organización de los objetos, pero bebido a segmentar manualmente cada objeto filamentosa es demasiado costosa, umbral automático fue empleado en su lugar.

Las diversas etapas y los resultados correspondientes en la creación de un modelo 3D se han mostrado aquí, pero lo más importante, las características de los datos y criterios personales que se consideren cruciales para determinar la mejor ruta de segmentación también se han dilucidado. Las características importantes de los datos de imagen en sí incluyen lo que se describe aquí como contraste, hacinamiento, crujiente, y el número de diferentes formas o características (tales como orgánulos, membranas, filamentos). Los criterios subjetivos a considerar incluyen el objetivo deseado de la segmentación (medición / recuento, la representación esqueleto de los datos / visualización volúmenes en representaciones 3D), las características morfológicas de la característica de interés (lineal, alargada, en red, compleja, enrevesada), la densidad de características de interés en relación a todo el volumen (la fracción de los objetos que estánimportante y necesita ser extraído), y el equilibrio de las concesiones de gastar recursos para la fidelidad de la segmentación de los datos originales y el retorno decreciente en la inversión que resulta en mejoras incrementales para sustancialmente mayor asignación de recursos.

El campo de la segmentación de la imagen ha madurado significativamente en los últimos años, sin embargo, no hay ninguna bala de plata, ningún algoritmo o programa que puede hacerlo todo. Tamaños de conjuntos de datos han crecido de cientos de megabytes a decenas de gigabytes de forma rutinaria, y ahora están empezando a superar terabytes, lo que hace casi imposible segmentación manual. Por lo tanto, se necesitan más recursos para ser invertidos en los enfoques de extracción de características inteligentes y tiempo efectivo que imitan el proceso de toma de decisiones humanas. Tendrán que ser combinado con (1) sistema de información geográfica (SIG) basado en bases de datos jerárquicas semánticas (similar a Google Earth), (2) las técnicas de extracción de datos (es decir, la transición Tales esfuerzosde un voxel a la representación / volumétrica geométrica) compatible con el diseño asistido por ordenador (CAD) de software con el fin de reducir significativamente la cantidad de datos y permitiendo así la visualización de volúmenes más grandes ^35, (3) las técnicas de simulación, ya que se utilizan frecuentemente en la disciplinas de la ingeniería, así como las capacidades (4) animación avanzada y creación de películas, incluyendo animaciones de sobrevuelo a través de (similar a lo que se desarrolló para la industria del juego).

Claramente, la extracción de características eficiente y segmentación se encuentra en el corazón de esta revolución que se avecina en imágenes de alta resolución celular, y si bien siempre se necesitan mejores métodos, los principios presentados aquí, así como los ejemplos de lo que el enfoque fue tomada por diferentes tipos de datos , proporcionará información valiosa para la toma de una decisión sobre qué postura tomar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira	FEI Grupo		http://www.vsg3d.com/amira/overview
Chimera	UCSF		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Fiji/ImageJ	Instituto Nacional de Salud		http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/
IMOD	Laboratorio de Boulder para Microscopía Electrónica 3D de Células		http://bio3d.colorado.edu/imod/
Photoshop,	Adobe http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html
MATLAB,	MathWorks		http://www.mathworks.com/
VLFeat,	VLFeat http://www.vlfeat.org/