Artículo de método

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

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DOI:

10.3791/51679

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1 de agosto de 2014

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1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

En este artículo

Resumen

El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó.

Resumen

Este informe demuestra el uso de dextrameros de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) para la detección de células T CD4 autorreactivas in situ en la proteína proteolípida de mielina (PLP) 139-151-encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida en ratones SJL y miocarditis autoinmune experimental (EAM) inducida por miosina α cardíaca (Myhc) 334-352 en ratones A/J. Se utilizaron dos conjuntos de cócteles de reactivos dextramerómeros, donde las células dextramer+ se analizaron mediante microscopio confocal de barrido láser (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (específicos)/anti-CD4 e IAs/Virus de la encefalomielitis murina de Theiler (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; y EAM, IAk/Myhc 334-352 dextrameros/anti-CD4 e IAk/ribonucleasa bovina (RNasa) 43-56 dextrameros (control)/anti-CD4. El análisis LSCM de secciones cerebrales obtenidas de ratones EAE mostró la presencia de células positivas para dextrameros CD4 y PLP 139-151, pero no para dextrameros TMEV 70-86, lo que sugiere que la tinción obtenida con dextrameros PLP 139-151 fue específica. Del mismo modo, las secciones cardíacas preparadas a partir de ratones EAM también revelaron la presencia de células Myhc 334-352, pero no de RNasa 43-56-dextramer+ como se esperaba. Además, también se ha ideado un método exhaustivo para analizar cuantitativamente las frecuencias de las células T CD4 específicas de antígeno en las imágenes seriadas 'Z'.

Introducción

El uso de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II tetrámeros para la detección de las células CD4 T específicas de antígeno ha sido un reto 1-7. Para aumentar la sensibilidad de detección de MHC de clase II tetrámeros, el equipo de investigación ha creado tetrámeros de próxima generación, denominados "dextramers" 8. Dextramers contienen cadenas principales de dextrano en el que se conjugan múltiples restos de estreptavidina-fluoróforo, de manera que varios monómeros, MHC-péptido biotinilados atado se pueden unir a una molécula de dextrano 9. Por lo tanto, grandes agregados de dextramers MHC que contienen varios complejos de MHC-péptido pueden interactuar con múltiples receptores de células T (TCR).

Este grupo recientemente generada dextramers para diversos antígenos propios y demostró que la sensibilidad de detección de dextramers fue aproximadamente cinco veces más que los tetrámeros 8. Los sistemas experimentales incluyen encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida con proteína proteolípido (PLP) 139-151 en ratones SJL; EAE inducida con glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) 35-55 en ratones C57BL / 6; y miocarditis autoinmune experimental (EAM) inducida con miosina cardíaca cadena pesada-α (MyHC) 334-352 en ratones A / J. Este estudio demuestra el uso de PLP139b151 - y MyHC 334-352 dextramers para detectar células T CD4 específicas de antígeno in situ con especificidad por el desarrollo de un protocolo de tinción directa, eliminando así la necesidad de amplificar las señales del uso de anticuerpos de fluoróforo, una enfoque empleado comúnmente con el uso de tetrámeros. Además, un método integral de evaluación de los tejidos también se ha ideado para enumerar de forma fiable las frecuencias de células T CD4 específicas de antígeno in situ 10. La detección de células T específicas de antígeno in situ permite la delineación de eventos causados ​​por estímulos antigénicos específicos de las causadas por la activación espectador. Del mismo modo, la técnica de in situ en también providES oportunidades para realizar un seguimiento de la cinética de infiltraciones de células T específicas de antígeno en los órganos diana.

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Protocolo

Declaración de Ética:

Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con las directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por la Universidad de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

1. Inducción de la EAE

  1. Para inducir la EAE, preparar la emulsión péptido / adyuvante completo de Freund (CFA) como se describe en 11 con las siguientes modificaciones: Paso 1.1:. Preparar PLP139b151 a una concentración de 1 mg / ml en 1x tampón fosfato salino (PBS) Paso 1.4:. utilizar 200 l de CFA de emulsión que contiene 100 g de PLP139b151 por animal Paso 1.4.1: para inmunizar a diez animales, preparar 2 ml de emulsión mediante la mezcla de 1 ml de PLP139b151 (1 mg / ml en 1x . de PBS) y un volumen igual de CFA Paso 1.5: inyectar 200 l de emulsión en dosis divididas por vía subcutánea en las dos regiones inguinales (~ 75 l cada uno) y región esternal (~ 50 l) de cinco a seis semanas de edad femalos ratones le SJL / J. Los pasos 1.7 y 1.8 no son aplicables para la inducción de la EAE.

2. Puntuación clínica de ratones con EAE y recolección de cerebros

  1. Monitorear los animales para la aparición de signos clínicos, y la puntuación de la enfermedad-la gravedad todos los días de 9 días después de la vacunación de la siguiente manera: 0 - saludable; 1 - cojera cola o posterior debilidad de las extremidades, pero no tanto; 2 - cojera cola y posterior debilidad de las extremidades; 3 - parálisis parcial de las extremidades posteriores; 4 - parálisis completa de las extremidades posteriores; 5 - moribundos o muertos 12.
  2. La eutanasia a los ratones cuando alcanzan una puntuación neurológica de 3 o 4 utilizando CO 2. Para practicar la eutanasia a los ratones, pre-llenar la cámara de eutanasia primero con CO 2 girando el regulador del tanque de CO 2 no superior a 6 psi y permitir que los animales se queden dentro de la cámara durante aproximadamente 5 minutos para lograr la asfixia completa. Remojar los animales sacrificados en el 70% de alcohol. Inmediatamente, colocar los animales en una almohadilla absorbente y el uso de un par de estéril paraceps y tijeras exponen los corazones por el corte a través de la cavidad torácica. Perforar las aurículas derecha e perfundir inyectando 10 ml de frío 1 × PBS en los ventrículos izquierdos de los corazones.
  3. Excavar el cráneo al cortar el cráneo en forma circular con un par de tijeras curvas, y con cuidado, voltear los huesos del cráneo con unas pinzas. Se recoge el cerebro mediante disección roma y el uso de un bisturí limpio, cerebro separado del cerebelo. Coloque el cerebro en un tubo que contiene el frío 1 × PBS y dejar el tubo en hielo hasta su procesamiento.

3. In Situ La tinción de secciones cerebrales con MHC de clase II (IA s) / PLP139b151 Dextramers

  1. Preparar 4% tamponada con PBS bajo punto de fusión de agarosa, se funden por calentamiento a 50 ° C y se deja en un 40 ° C baño de agua hasta su uso.
  2. Coloque el cerebro en un cassette histología molde de base profunda desechable mantuvieron sobre hielo y vierta fundido (40 ° C) de agarosa. Inmediatamente, presione suavemente el cerebrocon unas pinzas para sumergir el tejido. Deje el cartucho en hielo durante 15-20 minutos hasta que la solidificación es completa.
  3. Llene la bañera con vibratome refrigerada 1x PBS. Llenar el espacio alrededor de vibratome baño con cubitos de hielo para mantener la temperatura de PBS entre 0 y 2 ° C. Fijar una hoja de afeitar limpia en el vibratome y ajuste el ángulo de la hoja a 15 °.
  4. Colocación del tejido en vibratome. Recorte el exceso de agarosa de todos los lados del tejido incrustado y exponer ligeramente la superficie ventral del cerebro.
    1. Unte vibratome bloque de tejido con pegamento y transferir el tejido e inmovilizado sobre la superficie encolada mediante la colocación de la superficie ventral expuesta del cerebro sobre el pegamento para la sección transversal. No mueva el tejido, una vez que el tejido se fija sobre el bloque.
    2. Coloque el bloque vibratome que contiene el tejido agarosa incrustados en el hielo, y permitir que el pegamento se seque durante 15 minutos.
  5. Mientras tanto, coloque la cámara de tejidoBers uno por pocillo de una placa de 24 pocillos. Llenar los pocillos que contienen las cámaras de tejido con 1 ml de PBS 1x frío, y dejar la placa en hielo.
    1. Preparar las cámaras de tejido uniendo una fina malla de nylon para el corte final de una pipeta de 25 ml de polipropileno utilizando pegamento; después de recortar el exceso de malla alrededor de la pipeta, cortar la pipeta a una longitud de 1 cm de la malla.
  6. Bajar la hoja vibrátomo al nivel de la superficie superior del tejido; establecer la velocidad vibratome a 0,22 mm / seg y empezar a cortar con un movimiento hacia adelante para hacer 200 micras de espesor secciones. Transferir una sección cerebral por pocillo usando un cepillo suave acuarela en las cámaras de tejidos colocados dentro de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Guarde la placa de hielo hasta el seccionamiento es completo para evitar la degradación de los tejidos. Nota: Siga estos pasos para obtener en tres secciones, el total de pares de tres regiones diferentes del cerebro dorsal a la superficie ventral (Figura 2). Una sección decada par (en total tres secciones) colocados en tres cámaras de tejido individuales se designan para la tinción con dextramers específicos (IA s / PLP 139-151) y anti-CD4. Del mismo modo, otro grupo de tres secciones que se colocan en tres cámaras de tejido individuales se designan para la tinción con dextramers control (IA s / TMEV 70-86) y anti-CD4.
  7. Transferencia de las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers específicos en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por pocillo en el que, 300 l de un cóctel que contiene aloficocianina (APC)-conjugados PLP139b151 dextramers (2,5 g / ml) y anti-CD4-ficoeritrina (PE; se añadió previamente 5 g / ml) en solución de bloqueo (1x PBS con 2% de suero normal de cabra). Cubrir los pocillos con una tapa.
  8. Del mismo modo, transferir las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers de control en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por nosotrosll en el cual, se añadió previamente 300 l de un cóctel que contiene TMEV APC-conjugado 70-86 dextramers (2,5 mg / ml) y anti-CD4-PE (5 mg / ml) en solución de bloqueo. Cubrir los pocillos con una tapa. Nota: Consulte Massilamany et al 8, para la preparación de dextramers, y las moléculas de dextrano para preparar dextramers fueron amablemente proporcionados por Immudex, Copenhague, Dinamarca..
  9. Etiquetar los pozos, y envolver el plato con papel de aluminio y coloque la placa en una plataforma oscilante fijado a las rotaciones suaves durante 1,5 horas en la oscuridad a temperatura ambiente.
  10. Después del período de incubación, lavar las secciones de tejido en la plataforma oscilante, mediante la transferencia de las cámaras de tejido a un nuevo pocillo que contenía 1 ml de PBS 1x frío, y evitar el goteo los contenidos de un pocillo en el otro. Repita el lavado tres veces, dejando al menos 10 min por lavado. Asegúrese de que las secciones de tejido no se les secan, ya que pueden pegarse a las paredes de la cámara.
  11. Fijar las secciones mediante la transferencia de la cámara de tejidobros en un pozo fresco en placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de filtrada paraformaldehído al 4% tamponada con PBS (pH 7,4) en una plataforma de agitación durante 2 horas con rotaciones suaves.
  12. Repita el lavado tres veces como se describe en el paso 3.10.
  13. Coloque las secciones teñidas y fijadas en un portaobjetos limpio con un cepillo suave acuarela. Limpie el exceso de agua sin tocar la sección, y montar la sección utilizando medio de montaje. Cubra con el cubreobjetos microscópica y deje que los portaobjetos se sequen a TA O / N en el cuarto oscuro.
  14. Almacenar los portaobjetos en una caja de almacenamiento de diapositivas a prueba de luz a 4 ° C.

4. Inducción de EAM y Colección de corazones

  1. Inducir EAM como se describe en la referencia 11.
  2. La eutanasia a los ratones en el día 21 después de la vacunación utilizando la cámara limpia equipado con CO 2 cilindro de gas, y disfrutar de los animales en el 70% de alcohol. Inmediatamente, colocar los animales en una almohadilla absorbente y utilizando un par de pinzas y tijeras exponer el corazóns cortando a través de la cavidad torácica. Perforar las aurículas derecha e perfundir inyectando 10 ml de frío 1 × PBS en los ventrículos izquierdos de los corazones. Recoge los corazones y lugar en tubos que contienen frío 1 × PBS.

5. In Situ La tinción de las secciones de corazón con MHC de clase II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers

  1. Preparar 4% PBS-tampón bajo punto de fusión de agarosa, se funden por calentamiento a 50 ° C y se deja en un 40   ° C baño de agua hasta su uso.
  2. Coloque el corazón en un casete desechable profunda histología molde de base se mantuvo en hielo, y se vierte fundida 40 ° C agarosa hasta que los tejidos estén completamente sumergidos como se describe en el paso 3.2.
  3. Siga el paso 3.3.
  4. Recorte el exceso de agarosa de todos los lados del tejido incrustado y exponer ligeramente la base del corazón. Frotis de vibratome bloque de tejido con pegamento y transferir el tejido de agarosa-incrustado sobre la superficie pegada, mediante la colocación de la superficie expuesta de lacorazón sobre el pegamento. No mueva el tejido, una vez que el tejido se fija sobre el bloque.
    1. Coloque el bloque vibratome que contiene el tejido agarosa incrustados en el hielo, y permitir que el pegamento se seque durante 15 minutos.
  5. Siga los pasos 3.5 y 3.6.
  6. Transferir las secciones del corazón usando un cepillo suave acuarela en las cámaras de tejidos colocados dentro de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Mantener la placa en hielo hasta el seccionamiento es completa para prevenir la degradación del tejido. Nota: Siga estos pasos para obtener en total, ocho secciones emparejadas desde el vértice hasta la base del corazón (Figura 2). Coloque todas las secciones de cámaras de tejido, la asignación de hasta 3 secciones por cámara. Una sección de cada par (un total de ocho secciones) se designa para la tinción con dextramers específicos (IA K / MyHC 334 a 352) y anti-CD4. Del mismo modo, otro conjunto de ocho secciones se designa para la tinción con dextramers control (IA k / RNasa 43-56) y anti-CD4.
  7. Transferir eltres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers específicos en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por pocillo en el que, 300 l de un cóctel que contiene APC-conjugados MyHC 334-352 dextramers (2,5 g / ml) y anti-CD4-PE (5 g / ml) en solución de bloqueo se añadió previamente. Cubrir los pocillos con una tapa.
    1. Del mismo modo, transferir las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers de control en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por pocillo en el que, 300 l de un cóctel que contiene RNasa APC-conjugado 43-56 dextramers (2,5 microgramos / ml) y anti-CD4-PE (5 g / ml) en solución de bloqueo se añadió previamente. Cubrir los pocillos con una tapa.
  8. Etiquetar los pozos, y envolver el plato con papel de aluminio y coloque la placa en una plataforma oscilante fijado a las rotaciones suaves durante 1,5 horas en la oscuridad a temperatura ambiente.
  9. Siga los pasos, 3.10 a 3.11
  10. THR lavado Repitahielo, como se describe en el paso 3.10.
  11. Coloque las secciones teñidas y fijos (hasta tres secciones / diapositivas) en un portaobjetos de microscopio limpio con un cepillo suave acuarela. Limpie el exceso de agua sin tocar las secciones, y montar las secciones utilizando medio de montaje. Cubra con el cubreobjetos microscópica y deje que los portaobjetos se sequen a TA O / N en el cuarto oscuro.
  12. Almacenar los portaobjetos en una caja de almacenamiento de diapositivas a prueba de luz a las 4 ° C.

6. Análisis de Dextramer + (Dext +) las células T CD4 + por láser confocal de barrido microscopio (LSCM) (común a las dos secciones del cerebro y del corazón)

  1. Utilice Nikon A1-Eclipse sistema de microscopía confocal 90i para el escaneo de rutina y adquisición de imágenes. Para iniciar haga clic en Abrir, el software NIS Elementos AR (versión 4.13).
    1. Elija "TRITC" y canales "Cy5" del panel. Las longitudes de onda de excitación / emisión, respectivamente, para los canales de TRITC y Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm y 640,7 nm / 663-738 nm aparece de forma predeterminada.
    2. Asigne la pseudocolors "verde" y "rojo" para el TRITC (CD4-PE) y Cy5 (dextramer-APC) canales, respectivamente.
    3. Coloque la diapositiva para ser examinado en la fase microscópica y enfoque manualmente bajo un aumento de 100X. Ajuste el "HV" para 110 y compensar a "0". Haga clic en "Focus" y ajuste el "voltaje" para optimizar los lasers.
    4. Haga clic en "Focus"; escanear la sección de arriba a abajo, y ajuste el nivel 'Z' para la adquisición de imágenes. Haga clic en "serie CH" y adquirir la secuencia de imágenes. Identificar Dext + células T CD4 + que aparece como células puntiformes de color amarillo sobre la base de co-localización de las señales generadas a partir de tanto los canales rojo (dextramers) y verde (CD4).
  2. Utilice Olympus FV500-BX60 microscopio confocal para la enumeración cuantitativa fácil de las células T CD4 + + DEXT. Para empezarhaga clic en abierto, el software Fluoview (versión 4.3).
    1. Seleccione el tintes "Cy3" y "Cy5" en el menú desplegable, y haga clic en "Aplicar" para cargar los respectivos láseres. Nota: las longitudes de onda de excitación / emisión para Cy3 (543 nm / pseudocoloreada "verde"; CD4-PE); canales y Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocoloreada "rojo").
    2. Coloque la diapositiva para ser examinado en el portaobjetos de microscopio y se enfoque de forma manual a baja magnificación (4X o 10X). Haga clic en "Focus", mientras que el láser Cy3 está encendido, y se centran el foco inflamatorio.
    3. Cambie el objetivo de un aumento de 100X. Ajuste el tamaño del archivo a "512/512" en el menú desplegable. Haga clic en "Focus" y ajuste los valores para "PMT", "ganancia" y "Offset" parámetros para optimizar los láseres por separado para Cy3 y Cy5.
    4. Haga clic en "fase Z" y luego haga clic en "Focus", mientras tanto los láseres están encendidas. Conjuntoel espesor de la "etapa Z" haciendo clic en las flechas "abajo" "arriba" y. Establezca el intervalo de "Z" a 2 micras.
    5. Haga clic en "Stop", y seleccione "Seq123". A continuación, haga clic en "XYZ" y comenzar la adquisición de imágenes de la serie "Z" para el área seleccionada en el foco inflamatorio. Guarde los "Z imágenes en serie" como archivos AVI. Para guardar archivos de imágenes, seleccione la imagen de la "Z imagen de serie", y luego guardarlo en formato "tiff".
  3. Examine tres secciones emparejadas del cerebro donde se tiñó de un conjunto de tres secciones con IA s / PLP139b151 dextramers/anti-CD4 y el otro conjunto de tres secciones con IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 realizar análisis cuantitativo.
    1. Del mismo modo, analizar ocho secciones emparejadas para el corazón, en el cual, un conjunto de ocho secciones se tiñeron con IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 y otro sít de ocho secciones con RNasa 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Examine 10 a 15 focos inflamatorios por sección en cerebro, y en cada foco, adquirir un conjunto de 15 a 25 imágenes en serie secuencialmente.
    1. Examine un total de 20 focos inflamatorios de todas las ocho secciones de corazón y de cada foco adquirir de 10 a 15 imágenes en serie secuencialmente. Tome los 'Z' imágenes en serie mediante el escaneo de las diapositivas en un movimiento "horizontal-vertical-up horizontal-vertical hacia abajo" de manera que se evite la repetición de la serie 'Z' dentro del mismo enfoque.
    2. Una vez que las imágenes de serie 'Z' son capturados, el nombre de los archivos mediante la identificación de los números de diapositiva, el nombre de las secciones y el número de los 'Z' imágenes seriadas tomadas.
      1. Utilice el software 'ImageJ' para contar las células T CD4 + + DEXT en relación con el número total de células T CD4 +. Seleccione la opción "tipo de contador 'en' ImageJ, comprobar y# 8216; mostrar todos 'y empezar a contar haciendo clic en el centro de cada célula y seguir contando en diferentes' Z 'imágenes en serie utilizando las flechas laterales. Después de contar a todas las células T CD4, elige otro tipo de contador y contar el + en las células T CD4 + Dext. Haga clic en la ficha de resultados para obtener el número total de células contadas con los dos contadores diferentes.
      2. Para obtener el número total, agregue el número de células en todos los 'Z' imágenes en serie que representan a todas las tres secciones cerebrales o las ocho secciones del corazón.

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Resultados

En este informe, la detección in situ de antígeno-específica, autoreactive células T CD4 por tinción directa con MHC de clase II dextramers se describe. Secciones cerebrales Corte recientemente se obtuvieron a partir de ratones con EAE y se tiñeron con cócteles que contienen PLP139b151 (control) dextramers y anti-CD4 (específica) o TMEV 70-86. Los paneles superiores de la Figura 1 muestra el análisis de secciones cerebrales LSCM costained con PLP 139-151 dextramers (rojo) y de anticuer...

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Discusión

A diferencia de tetrámeros de MHC de clase I, el uso de MHC de clase II tetrámeros para aplicaciones de rutina sigue siendo un reto, especialmente para enumerar las frecuencias precursoras de baja afinidad autorreactivos células T CD4, debido en parte a su dependencia de activación 6,15-17. Recientemente, este problema se evitó mediante la creación de la próxima generación de tetrámeros, llamado "dextramers," que nos permite detectar células T CD4 específicas de antígeno para un número de autoantíge...

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Divulgaciones

Se declararon no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Miocardiopatía la Fundación del Niño (SDG2462390204001) American Heart Association y, y los Institutos Nacionales de Salud (HL114669). CM es un beneficiario de una beca de investigación postdoctoral concedida por la Fundación La miocarditis, NJ.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CFASigma Aldrich, St Louis, MO5881Tienda en 4 ° C
MTB  Extracto de H37Rv  Laboratorios Difco, Detroit, MI231141tienda en 4 ° C
PTLista de Laboratorios Biológicos, Campbell, CA181Tienda en 4 ° C
1x PBS Corning, Manassas, VA21-040-CVTienda en 4 ° C
Ratones hembra A/J Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
Ratones hembra SJL/JJackson Laboratories, Bar Harbor, ME686
Leur-lok jeringa estéril de 1 mlBD, Franklin Lakes, NJ309628
Leur-lok jeringa estéril de 3 mlBD, Franklin Lakes, NJ309657
Aguja estéril, 18 GBD, Franklin Lakes, NJ305195
Aguja estéril, 27 1/2 GBD, Franklin Lakes, NJ305109
llave de paso de 3 vías Smiths Medical ASD, Inc. Dublín, OHMX5311L
rollos de vendaje de gasa Kerlix Covidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Agarosa, Punto de fusión bajo, grado analíticoPromega corporation, Madison, WIV2111
Suero de cabra normal ImmunopureThermo Scientific, Waltham, MA31873Tienda en -20 ° C
CD4 anti-ratón conjugado con colorante PEeBioscience, San Diego, CA 12004185tienda en 4 ° C
de Paraformaldehído, Hatfield, PA19202Tienda en 4 ° C
Faramount Medio de montaje acuosoDako, Carpintería, CA10073021
Tubo cónico (15 ml)BD Biosciences, San José, CA352099
Tubo cónico (50 ml)BD Biosciences, San José, CA352070
Placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 24 pocillosBD Biosciences, San José, CA356775
Pinceles de acuarela#2Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY73502
Portaobjetos de microscopio liso, tamaño: 3" x 1" x 1.2 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA1255010
Cubierta de vidrio de primera calidad, 22 x 22-1Fisher Scientific, Pittsburgh, PA12548B
Casetes desechables de histología de molde de base profundaProdcust de laboratorio, Rochester, NYM-475-10
Pegamento Loctite SuperHenkel Corporation, Westlake, OH1471879
Hojas de afeitarGillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide, Cambridge, MAStore en 4 ° C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)Neopéptido, Cambridge, MATienda en 4 ° C
MHC clase II/IAs PLP 139-151 o TMEV 70-86 dextramers conjugados con coloranteAlmacene en 4 ° C
MHC clase II/IAk Myhc 334-352 o  o RNasa 40-56 dextrameros conjugados con coloranteAlmacene en 4 ° C
Dextrano conjugado SA-APCImmundex, Copenhague, DemarkStore en 4 ° C
Tijeras y pinzas quirúrgicas estérilesHerramienta INOX Corporación
Micro hornoGE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 VibratomeLeica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Microscopio confocal de barrido láserOlympus America, Inc. Center Valley, PA
Microscopio confocal Nikon A1-Eclipse 90iNikon Inc. Melville, NY
Ciencias de Microscopía Electrónica APC APC

Referencias

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  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
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