Vortex asistida Microscale Electroporador para entrega secuencial Molecular

Summary

Una plataforma de electroporación asistida vórtice de microfluidos fue desarrollado para la entrega secuencial de múltiples moléculas en poblaciones de células idénticas con control de la dosificación precisa e independiente. Tamaño basado electroporación anterior etapa de purificación de células diana del sistema ayudado a mejorar la eficiencia de la entrega molecular y la viabilidad celular procesada.

Abstract

La electroporación ha recibido una creciente atención en los últimos años, debido a que es una técnica muy poderosa para la introducción de sondas moleculares físicamente exógenos no permeantes en las células. Este trabajo presenta una plataforma de electroporación de microfluidos capaz de realizar la entrega molécula múltiple para células de mamífero con control de parámetros precisos y molecular-dependiente. La capacidad del sistema para aislar células con una distribución de tamaño uniforme permite una menor variación en la eficiencia de la electroporación por intensidad de campo eléctrico dado; por lo tanto, una mayor viabilidad de la muestra. Además, su función de visualización de procesos permite la observación del proceso de absorción molecular fluorescente en tiempo real, lo que permite ajustes de parámetros de entrega moleculares rápidas in situ para la mejora de la eficiencia. Para mostrar las enormes capacidades de la plataforma informado, macromoléculas con diferentes tamaños y cargas eléctricas (por ejemplo, dextrano con un PM de 3.000 y 70.000 Da) fueronentregado a las células de cáncer de mama metastásico con altas eficiencias de entrega (> 70%) para todas las moléculas ensayadas. La plataforma desarrollada ha demostrado su potencial de uso en la expansión de los campos de estudio en el chip técnicas de electroporación pueden ser beneficiosos.

Introduction

En los últimos años, el uso de pulsos eléctricos para facilitar la entrega citosólica de moléculas extracelulares se ha convertido en un medio atractivo para la manipulación de células de mamífero. ¹ Este proceso, también conocido como electroporación, permeabiliza reversiblemente la membrana celular, lo que permite la membrana inherentemente moléculas impermeables para acceder al medio intracelular de las células. Debido a que prácticamente cualquier molécula se puede introducir en el citosol a través de poros creados temporales en la membrana de cualquier tipo de células por medio de electroporación, la técnica ha sido reportado como siendo más reproduci....

Protocol

1. Preparación de la célula

1. Placa 1 × 10 ⁵ células / ml de metastásico línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 en un volumen de 10 ml por matraz de cultivo tisular T75 en de Leibovitz L-15 suplementado con 10% (v / v) de suero fetal bovino y 1 % de penicilina-estreptomicina.
2. Incubar MDA-MB-231 células en un incubador humidificado a 37 ° C con 0% de CO ₂ medio ambiente.
3. Cosecha células para los experimentos de 2 días después de la siembra por tratamiento de las células con 0,25% de tripsina-EDTA durante 2 min e inactivar la actividad enzimática de tripsina mediante la adición de 8 ml de medio de crecimiento.

Results

El electroporador microfluidos paralelo desarrollado entregado macromoléculas con varios tamaños y cargas eléctricas en las células de cáncer de mama metastásico que viven. El éxito de la entrega molecular se determinó cualitativamente mediante la supervisión de los cambios en la intensidad de fluorescencia de las células que orbitan alrededor de electroporación in situ y confirmado por mediciones cuantitativas mediante análisis de citometría de flujo. Figura 4A muestra que el 90% de las célula.......

Discussion

Con la nueva plataforma de electroporación paralelizado, mejora de 10 veces en el rendimiento y la eficiencia de la prestación de múltiples molécula se logró, además de todas las ventajas que el sistema de una sola cámara previamente desarrollado proporciona. ¹⁸ méritos Anteriormente disponibles incluyen (i) antes de la purificación de dirigirse a las células con una distribución uniforme del tamaño para la mejora de la viabilidad, (ii) control de la dosificación precisa y molecular individual, y (iii) la cor.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 línea celular cancerosa	Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC)	HTB-26
Leibovitz' s L-15	Cell Mediano, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Tripsina	Gibco, Life Technologies	25200-056
Citómetro de flujo easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Limpiador de plasma de oxígeno	Technics Perfilador de superficies Micro-RIE
Dektak 6M	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 ELASTÓMERO DE SILICONA KIT	Dow Corning
Gas nitrógeno comprimido	Airgas	NI 300
Regulador de alta presión	McMaster-Carr	6162K22
Regulador aguas abajo	McMaster-Carr	4000K563
Colector de válvulas de alta velocidad de 3/2 vías 8 Válvula de retención en	Festo
Idex	Salud y Ciencia	CV3320
5/32" de diámetro exterior x 3/32" de diámetro interno Tubos de poliuretano	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" de diámetro exterior x 0,17" de diámetro interno Tubos de poliuretano	Pneumadyne	PU-250PB-4
Tubos de PEEK de 1/16"	Festo	P1533
Tubos de PEEK de 1/32"	Idex Salud y Ciencia	P1569
Uniones de tubos de PEEK	Salud y Ciencia	P881
Generador de impulsos	HP	8110A
Alambre de aluminio	Bob Martin Company	6061 ALUM
Osciloscopio	Agilent DSO3062A
50 ml Tubos de centrífuga VWR		21008-178
Tubo de centrífuga de 15 ml	VWR	21008-216
T75 Matraz de cultivo VWR		82050-862
Dextrano, Tetrametilrodamina, 3.000 MW, Gibco aniónico	, Life Technologies	D3307
Dextrano, Tetrametilrodamina, 70.000 MW, Neutro	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3.000 MW, Neutral	Gibco, Life Technologies	D3329