C. elegans se ha convertido en un nuevo modelo genético para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Aquí se describe un protocolo para infectar C. elegans con Salmonella typhimurium, junto con la técnica de RNAi interferencia de doble hebra para examinar el papel de los genes del huésped en la defensa contra la infección por Salmonella.
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Artículo de método
Un protocolo para infectar
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Resumen
Resumen
En la última década, C. elegans se ha convertido en un organismo invertebrado para estudiar las interacciones entre los hosts y patógenos, incluyendo la defensa del huésped contra bacterias gram-negativas bacteria Salmonella typhimurium. Salmonella establece una infección persistente en el intestino de C. elegans y resulta en la muerte temprana de los animales infectados. Un número de mecanismos de la inmunidad se ha identificado en C. elegans para defenderse de las infecciones por Salmonella. La autofagia, una vía de degradación lisosomal conservadas evolutivamente, se ha demostrado que limitar la replicación de Salmonella en C. elegans y en los mamíferos. Aquí, un protocolo se describe para infectar C. elegans con Salmonella typhimurium, en la que los gusanos están expuestos a la Salmonella por un tiempo limitado, similar a la infección por Salmonella en los seres humanos. infección por Salmonella acorta significativamente la vida útil de C. elegans </ Em>. Usando el gen de la autofagia esencial BEC-1 como un ejemplo, se combinaron este método de infección con C. elegans alimentación RNAi enfoque y mostró este protocolo puede ser utilizado para examinar la función de C. genes del huésped elegans en la defensa contra la infección por Salmonella. Desde C. elegans todo el genoma RNAi bibliotecas están disponibles, este protocolo permite a la pantalla exhaustivamente para C. genes elegans que protegen contra la Salmonella y otros patógenos intestinales utilizando RNAi bibliotecas de todo el genoma.
Introducción
La vida libre de nematodos Caenorhabditis elegans suelo es un simple y manejable de forma genética organismo modelo utilizado para estudiar muchas cuestiones biológicas. C. elegans existe predominantemente como hermafroditas autógamas. Los varones son generados espontáneamente por la no disyunción del cromosoma X durante 1,2 gametogénesis. En la presencia de abundante comida, C. elegans desarrollar continuamente a través de cuatro estadios larvarios a adulto. La temperatura también influye en C. desarrollo elegans; desarrollo más rápido se observó a temperaturas más altas. En el laboratorio, C. elegans se cultiva a una temperatura estándar de 20 ° C en placas de agar con cabeza de serie bacteria Escherichia coli (cepa OP50) como alimento 1,2.
En la última década, C. elegans se ha convertido en un organismo invertebrado para estudiar las interacciones huésped-patógeno 3-5. En la naturaleza, C. elegans come bacterias como su nutrien1,2 t fuente. Su comida normal de laboratorio bacteriana, OP50, puede ser fácilmente sustituido con otros patógenos para examinar las interacciones entre C. elegans y cualquier patógeno elegido. En estas condiciones, el intestino es el sitio primario de la infección. De hecho, se ha demostrado una amplia gama de patógenos bacterianos para infectar letalmente C. elegans 3-5.
La bacteria Salmonella gramnegativos es un patógeno gastrointestinal que causa la enfermedad transmitida por los alimentos humanos en todo el mundo 6,7. C. elegans es un buen modelo de acogida de Salmonella typhimurium ya que esta bacteria se replica y exhibe las infecciones intestinales persistentes 8-10. C. elegans ha sido utilizado para identificar tanto novedoso y anteriormente conocido virulencia de Salmonella factores 11. Curiosamente, la C. sistema inmune elegans limita con éxito la replicación de Salmonella. Se ha informado anteriormente de que no habilition de genes autofagia hace que el aumento de la replicación de Salmonella en C. elegans, lo que resulta en la muerte temprana de los gusanos infectados 10. Macroautofagia (aquí referido como la autofagia) es un proceso dinámico que implica la reorganización de las membranas subcelulares para secuestrar citoplasma y orgánulos para la entrega a los lisosomas para degradación 12. La autofagia ha sido reportado para limitar la replicación de Salmonella en C. elegans y en los mamíferos 10,13.
El C. elegans genoma fue el primer genoma eucariota multicelular secuenciado; que es sensible a RNAi tratamiento 14-16. Por otra parte, el ARNi puede ser administrado eficazmente sometiendo gusanos de ingerir las bacterias que contienen el ARN de doble cadena del gen diana, conocido como alimentación RNAi 16,17. Genoma bibliotecas de alimentación RNAi enteras han sido generados para la selección de ARNi de todo el genoma 16,18. En la presente memoria, una infección de Salmonella Proprotocolo es, junto con alimentación RNAi para permitir pruebas de C. genes elegans de interés por su capacidad de proteger contra la infección por Salmonella.
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Protocolo
1. Placas XLD (xilosa lisina desoxicolato) Agar
Agar XLD es un medio de crecimiento selectivo para Salmonella, que aparece como colonias negras en placas de agar XLD. Sin embargo, si no hay problemas de contaminación, una placa regular de LB puede ser sustituido.
- Pesar 5,5 g de agar XLD y resuspender en 5 ml de agua desionizada.
- Mezclar bien hasta que todo el agar está mojado. Añadir 95 ml de agua desionizada hasta que todos queden grumos y el medio se volvieron a suspender por completo.
- Hervir el medio para disolver por completo (no en autoclave).
- Enfriar el medio a temperatura ambiente a 50 ° C.
- Verter 25 ml de agar de cada 95 x 15 mm (diámetro x altura) de la placa (placas selladas con Parafilm pueden almacenarse a 4 ° C durante un máximo de 1 mes).
2. Nematodo Medio de Crecimiento (NGM) de alimentación RNAi placas
Preparación de C. placas elegans NGM se ha descrito anteriormente 19. Aquí un procedimiento se describe brevemente para añadir el antibiótico ampicilina y el ARNi inductor químico isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en los medios de comunicación NGM para hacer las placas de alimentación de RNAi.
- Disolver 3 g de NaCl y 2,5 g de Bacto peptona en 1 L de agua desionizada.
- Añadir 17 g de agar Bacto en los medios de comunicación.
- Autoclave los medios de comunicación durante 45 minutos y enfriar el medio a 50 ° C en un baño de agua.
- Añadir las siguientes soluciones: 1 ml de colesterol (5 mg / ml en etanol al 95%), 1 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 1 M MgSO4, y 25 ml de 1 M de tampón de fosfato de potasio (pH 6,0). Mezclar bien.
- Añadir 1 ml de 1 M de IPTG y 500 l de ampicilina (100 mg / ml en agua estéril).
- Mezcle bien la solución y verter en placas de Petri de 60 x 15 mm (diámetro x altura) utilizando una pipeta de Ayuda y 25 ml de pipeta serológica siguientes procedimientos estériles. Llene cada plato con 12 ml de agar. Las placas se pueden almacenar a 4 ° C durante hasta 1 mes.
3. Preparar RNAi tratados con animales para la infección
El gen esencial autofagia BEC-1 se utiliza como un ejemplo para examinar la función de un gen de acogida en la defensa contra la infección por Salmonella. Los procedimientos experimentales se ilustran en la Figura 1 y la Tabla 1. El protocolo para la preparación de los animales tratados con ARNi para la infección sigue, con el día de cada paso experimentales dados en paréntesis.
- Inocular bec-1 RNAi alimentación y el control de vector vacío L4440 alimentación RNAi bacterias mediante la colocación de un copo de -80 ° C las bacterias congeladas en 2 ml de medio LB suplementado con 100 mg / ml de ampicilina (Día 1). Repita este paso una vez a la semana durante todo el experimento de tener bacterias RNAi frescas. Guarde la cultura en el 4 ° C refrigerador cuando no se utiliza.
- Seed 100 ml de cultivo bacteriano durante la noche en placas de RNAi RNAi. Prepare de tres bec-1 RNAi y el control de tres v vacíaector placas de RNAi. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche (Día 2).
- Retire las placas de RNAi de la 37 ° C incubadora y deje que se enfríen a temperatura ambiente en el banquillo. Recoge bien alimentados L4 tipo salvaje hermafroditas N2 y transferirlos a Bec-1 RNAi y controlan placas RNAi vector vacío. Coloque tres gusanos por placa, en placas por triplicado. El mismo día, se preparan platos de RNAi como se describe en el paso 3.2 (día 3).
- Incubar las placas de RNAi con gusanos en la incubadora de 20 ° C para 36 a 40 hy de transferencia de los gusanos a las placas de RNAi correspondientes frescos preparados en el paso 3.3. Después de gusanos se transfieren, incubar las placas en el 20 ° C incubadora durante 64 horas (día 4).
4. Preparar para la infección por Salmonella
- Salmonella racha de -80 ° C madre congelada en 1 placa de agar XLD e incubar la placa a 37 ° C durante la noche (el día 5 ).
- Elige un bien aislada de Salmonella negro colonia e inocular en 2 ml de medio LB a 37 ° C con agitación durante la noche (Día 6).
- Seed 80 ml Salmonella cultivo de una noche en 1 C. elegans 60 x 15 mm (diámetro x altura) placa de agar NGM y preparar 6 placas en total. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 6 horas. El cultivo bacteriano debe secarse y formar un césped en la placa (día 7).
5. Worms tratados con RNAi Infect con Salmonella
- Traslado bec-1 RNAi tratados y control de vectores hermafroditas L4 N2 vacías RNAi tratados (la progenie de gusanos creados en el paso 3) para placas de Salmonella. Coloque 40 gusanos por placa en 3 placas para cada grupo. Incubar las placas de gusanos a 20 ° C durante 48 horas (día 7).
- Prepare un juego de placas de RNAi frescas tal como se describe en los pasos 3.1 y 3.2 (Día 7 y día 8).
- Después de 48 horas de infección, transferir gusanos infectados por Salmonella en las correspondientes placas de RNAi preparados en la etapa 5.2 y se incuba a 20 ° C (día 9).
6. Ensayo de supervivencia
- Puntuación de la supervivencia de los gusanos diario y transferir gusanos correspondientes placas de RNAi frescas durante la época de puesta de huevos. Prepare un conjunto de placas de RNAi frescas antes de cada transferencia de gusano como se describe en los pasos 3.1 y 3.2. Toque el cuerpo del gusano (cabeza, parte media y cola) suavemente con un alambre de platino final aplanado. Un gusano se califica como muerto si no se observa el movimiento del cuerpo del gusano.
- Puntuación de la supervivencia de los gusanos al día o cada dos días, y la transferencia de los gusanos de las placas correspondientes RNAi frescas dos veces a la semana después de que los gusanos dejan de poner huevos.
- Después de todos los gusanos mueren, agrupar los datos de supervivencia de placas por triplicado como un conjunto de datos. Introduzca los datos de supervivencia de cada grupo en el software estadístico apropiado como GraphPad Prismo para generar curvas de supervivencia y para llevar a cabo el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Todo el experimento se repite al menos una vez para confirmar la conclusión.
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Resultados
A 20 ° C, la esperanza de vida media de tipo salvaje gusanos N2 es de 17 días (Figura 2A y Tabla 2). Infección por Salmonella disminuye significativamente la esperanza de vida media de los gusanos N2 a 10,5 días (p = 0,0002, prueba de log-rank) (Figura 2A ).
Si una C elegans gen desempeña un papel importante en la defensa contra la infección por Salmonella, se prevé que su inhibición impartirá la susceptibilidad a ...
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Discusión
C. elegans es un simple organismo modelo genético que come bacterias como fuente de nutrientes. Por lo tanto, es fácil de sustituir su alimentaria bacteriana normal con un patógeno intestinal para investigar las interacciones entre C. elegans y el patógeno elegido. En la presente memoria se describe un protocolo para combinar la infección por Salmonella y C. elegans alimentación RNAi tratamiento para examinar el papel de los genes del huésped en la defensa contra la infección por ...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Damos las gracias a la Dra. Diane Baronas-Lowell para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un Charles E. Schmidt Colegio FAU del Fondo Semilla de Ciencia y una Beca de Envejecimiento de la Fundación Médica Ellison a KJ
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| LB Caldo | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Productos químicos | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptona | Fisher | BP1420-500 | |
| Cloruro de sodio | Fisher | S671-500 | |
| Cloruro de calcio | Fisher | C69-500 | |
| Sulfato de magnesio | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Colesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicilina | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Placa de Petri 95 x 15 mm | Fisher | FB0875714G | |
| Placa de Petri 60 x 15 mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon pipeta serológica | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 incubadora de agitación | Incubadora Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Percival | I-36DL |
Referencias
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