Artículo de método

Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

DOI:

10.3791/51710

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18 de octubre de 2014

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1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

En este artículo

Resumen

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Esta presentación demuestra un método mediante el cual la electroporación de células adherentes y cultivadas se utiliza para el estudio de la comunicación intercelular y de unión, mientras las células crecen en un portaobjetos recubierto con óxido de indio-estaño conductor y transparente.

Resumen

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En esta técnica, las células se cultivan en un portaobjetos de vidrio que está parcialmente recubierto con óxido de indio-estaño (ITO), un material transparente y conductor de electricidad. Una variedad de moléculas, como péptidos u oligonucleótidos, pueden introducirse en prácticamente el 100% de las células de una manera no traumática. Aquí, describimos cómo se puede utilizar para estudiar la comunicación intercelular de unión gap. El amarillo Lucifer penetra en las células cuando un pulso eléctrico, aplicado a la superficie conductora en la que están creciendo, hace que se formen poros a través de la membrana celular. Esto es electroporación. Las células que crecen en la superficie de vidrio no conductora inmediatamente adyacente a la región electroporada no absorben el amarillo Lucifer por electroporación, pero adquieren el tinte fluorescente a medida que se les pasa a través de uniones de separación que las unen a las células electroporadas. Los resultados de la transferencia de colorante de una célula a otra se pueden observar microscópicamente bajo iluminación de fluorescencia. Esta técnica permite una cuantificación precisa de la comunicación de las uniones entre huecos. Además, se puede utilizar para la introducción de péptidos u otras moléculas no permeadas, y la transferencia de pequeños péptidos electroporados a través de uniones gap para inhibir la señal en las células adyacentes no electroporadas es una poderosa demostración de inhibición de señal.

Introducción

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La aplicación de corriente eléctrica a una célula provoca la formación de poros en la membrana celular, mediante un proceso denominado electroporación. Los poros permiten el paso de una variedad de moléculas nonpermeant través de la membrana. El campo eléctrico puede ser controlada con precisión, de modo que los poros formados son muy pequeñas y volver a cerrar rápidamente, con la mínima perturbación a la fisiología celular. Curiosamente, las células adherentes pueden ser cultivadas en un portaobjetos de vidrio recubierto con óxido de indio-estaño conductora y transparente (ITO) y electroporación in situ, que está en la superficie donde crecen, sin ser individual para ser a electroporación en suspensión. Las células pueden crecer muy bien en esta superficie, y como están unidos y extendidos, la observación microscópica detallada es posible. Usando esta técnica, moléculas pequeñas nonpermeant se pueden introducir de forma instantánea y en esencialmente el 100% de las células, lo que hace esta técnica especialmente adecuada para estudios sobre la activación de un borradoronents de una vía después de la estimulación del ligando de un receptor (revisado en 1).

La electroporación se ha utilizado principalmente para la introducción de ADN (también llamado electrotransfección). Sin embargo, la electroporación in situ puede ser valiosa para la introducción de una gran variedad de moléculas, tales como péptidos, oligonucleótidos 2-4, tales como ARN antisentido, oligonucleótidos de doble cadena de ADN de señuelo para inhibir la unión del factor de transcripción, o siRNA 3,5, 6, 7-10 nucleótidos radiactivos, proteínas 11 12 o profármacos 13. Después de la electroporación, las células pueden ser lisadas para los análisis bioquímicos o fijaron y se tiñeron con anticuerpos.

El recubrimiento de ITO conductor es muy delgada, 800-1,000Å, de modo que el crecimiento celular no se ve perturbado por la diferencia de altura de las dos superficies, ya que las células crecen a través del borde del revestimiento conductor. Esto ofrece la ventaja de que no electropevaporaron células pueden ser cultivadas lado a lado con los electroporación, para servir como controles. El mismo enfoque se puede utilizar para el examen de la unión brecha, la comunicación intercelular (GJIC), como se describe en el vídeo.

Gap cruces son canales que conectan los interiores de células adyacentes 14. Unión Gap, la comunicación intercelular juega un papel importante en la formación de tumores y metástasis, mientras que los oncogenes tales como Src suprimen GJIC 15,16. Para examinar GJIC un colorante fluorescente como el amarillo Lucifer (LY) a menudo se introduce en células cultivadas a través de microinyección o raspar de carga 17 y la difusión del colorante en las células vecinas se observa microscópicamente bajo iluminación de fluorescencia. Estas técnicas, sin embargo, invariablemente causan daño celular. Describimos ahora una técnica donde las células se cultivan en un portaobjetos de vidrio que está parcialmente recubierto con ITO 18. Un pulso eléctrico se aplica en la presencia de LY (u otros colorantes) cautilizando su penetración en las células que crecen en la parte conductora de la corredera, mientras que la migración de colorante a las células adyacentes no se observó microscópicamente electroporación través de la iluminación de fluorescencia. Para evitar células sensibles perturbadores que pueden tender a separarse de la monocapa, un conjunto fue diseñado que no requieren un electrodo que se coloca en la parte superior de las células para aplicar la corriente eléctrica 19. Este enfoque ofrece la posibilidad de cuantificar la GJIC en un gran número de células, sin ninguna perturbación detectable con el metabolismo celular, como se indica por la ausencia de un efecto sobre la duración de la fase G1 después de la estimulación de suero 12, el aumento de los niveles de los fos proteína protooncogén (Raptis, inédito) o dos quinasas asociadas con el estrés celular, el cerdo p38 o JNK / SAPK quinasa 1. Este enfoque hace posible el examen de la relación entre los niveles de expresión de oncogenes, transformación y GJIC 18, así como el efecto de Src y Stat3 sobre GJIC en una variedad de tipos de células, incluyendo células recién cultivadas a partir de muestras de tumor de pulmón 20-23. Además, en la electroporación in situ con la configuración descrita que carece de un electrodo superior ha sido empleado con éxito para la demostración de cierre de brecha de la salida a la diferenciación adipocítico, aunque la unión celular al sustrato se reduce en esa etapa 19,24.

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Protocolo

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1. Plating las células en las cámaras de electroporación

  1. En una campana de flujo laminar, trypsinize las células utilizando una técnica estéril como de costumbre.
    NOTA: Es muy importante eliminar por centrifugación todos los rastros de la tripsina, ya que pueden impedir la propagación de las células en el cristal, por lo tanto, la formación de adherentes y uniones gap.
  2. Pipetear 1 ml de la suspensión de células en las cámaras de electroporación estériles proporcionadas con el en electroporador situ (Figura 1), y colóquelo en un 37 o C, CO 2 incubadora.
    NOTA: La adhesión celular se puede mejorar en placas sobre fibronectina, colágeno, poli-lisina o de células y el tejido adhesivo (ver Tabla de Materiales).
  3. Cuando las células han formado una capa confluente de que estén listos para el examen GJIC.

2. Procedimiento electroporación

La electroporación para el examen GJIC puede llevarse a cabo fuera de una campana de flujo laminar,ya que toma sólo unos pocos minutos. Si se requieren tiempos de incubación más largos para un experimento específico, entonces puede llevarse a cabo enteramente en una campana de flujo laminar. En todos los casos, las cámaras donde se cultivan las células deben ser estériles.

  1. Prepare una solución de color amarillo ml 5 mg / Lucifer: Disolver 10 mg de polvo LY (suministrado con el electroporador) en 2 ml de medio de cultivo libre de calcio. Para los experimentos que requieren tiempos de incubación más largos, filtro-esterilizar la solución y se almacena a 4 º C.
  2. Aspirar el medio de cultivo y se lavan las células con medio libre de calcio, teniendo cuidado de no rayar la monocapa o secar las células. Si se secan las células por lo general tienen núcleos oscuros y recoger LY sin electroporación. El efecto es más pronunciado en el centro de la diapositiva que está más expuesta a corrientes de aire (Figura 4F).
  3. Con una pipeta Eppendorf, pipeta la solución de colorante a las células (400 l para toda la cámara), en el borde de la cámara, ber cuidado de no tocar la capa de células.
  4. Coloque la cámara en el soporte suministrado con el electroporador y aplicar un pulso de la fuerza apropiada (ver Discusión).
  5. Aspirar cuidadosamente algo de la solución LY. Puede ser reutilizado una segunda vez para experimentos menos importantes.
  6. Añadir DMEM libre de calcio que contiene 10% de suero dializado.
  7. Se incuban las células durante 3-5 minutos en la incubadora para permitir la transferencia de colorantes a través de uniones.
    NOTA: La inclusión de suero dializado en este punto ayuda de cierre de los poros.
  8. Lavar el colorante no incorporado con DMEM libre de calcio para la observación de células vivas. Alternativamente, las células pueden fijarse en esta etapa, a través de la adición de 4% de formaldehído al pozo, después se lavaron con PBS (solución salina tamponada con fosfato). En todos los casos el lavado debe eliminar todo el fondo.
    NOTA: En experimentos preliminares para determinar las condiciones óptimas, si el voltaje es demasiado bajo, entonces es posible hacer que las células se recuperan en el incubator durante unos minutos y electroporar la misma diapositiva una segunda vez, para ahorrar en el coste de diapositivas.

3. Examen microscópico

  1. Observar las células bajo iluminación de fluorescencia, usando un microscopio invertido equipado con el filtro apropiado para el tinte que se utiliza. Para Lucifer amarillo, excitación es 423nm, 555nm emisión, filtro WBV para un microscopio Nikon IX70.
  2. Eliminar los efectos de menisco mediante la colocación de un cubre de vidrio en la parte superior del plástico y, después de llenar a la cima con el líquido, para examinar la morfología celular bajo contraste de fase. Para obtener mejores imágenes, el pozo puede ser separado de la corredera, y el cubreobjetos colocado en el bastidor. Para las células fijas, el pozo puede ser llenado con glicerol para la observación microscópica, mientras que para las células vivas que debe ser llenado con medio de crecimiento.
    NOTA: Lavado y fotografiar es más fácil si las células se fijan con formaldehído tras la transferencia del colorante (paso 2.7). Si las células no sont fijo, la fluorescencia se elimina de las células dentro de aproximadamente 60 min dependiendo de la introdujo en células fijadas, mientras que la fluorescencia se mantiene durante varias horas tipo de célula, la tensión y la cantidad de LY. Sin embargo, la fluorescencia se desvanece o se disipa después de O / N de incubación, incluso en células fijadas. Por esta razón, las fotografías deben tomarse pronto después de la electroporación (Figura 2).

4. La cuantificación de la comunicación intercelular

  1. Fotografiar las células con un objetivo de 20x bajo de fluorescencia y de contraste de fase (Figura 3).
  2. Identificar y marcar con una estrella las células sometidas a electroporación en la frontera con la zona de no-electroporación (Figura 2, flecha, borde electroporación).
  3. Identificar y marcar con un punto células fluorescentes en el lado no-electroporación, donde el colorante ha transferido a través de uniones (Figuras 3A y 3B).
  4. Se divide el número total decélulas fluorescentes en la zona de no-electroporación por el número de células sometidas a electroporación a lo largo del borde (Figuras 3A y 3B).
    NOTA: La transferencia de al menos 200 células del borde contiguas a electroporación se calcula para cada experimento. El número obtenido es el valor GJIC.

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Resultados

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La Figura 2 muestra células de hígado de rata T51B epitelial 22, electroporación con LY y fotografiados bajo de fluorescencia (panel A y B), o de contraste de fase (C), la iluminación siguientes fijación y lavado. En el panel A, el borde de la zona de electroporación está marcado en rojo. El gradiente de la fluorescencia a la derecha de la línea roja indica la transferencia a través de uniones. En la figura 3A y 3B, la cuantificación de la brecha ocasiones la...

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Discusión

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Los pasos críticos en el protocolo

Material de electroporados
La pureza del material que se va a electroporación es muy importante. Si las células son muy planas, se deben utilizar concentraciones más altas de entonces el colorante de seguimiento (hasta 20 mg / ml para LY) y en tales casos, la pureza es incluso más importante que en las células con una forma más esférica 1. Además LY han empleado una gran variedad de otros colorantes o moléculas nonpermeant, ...

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Divulgaciones

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El autor correspondiente es el inventor de una patente de la Universidad de Queen, que ha sido licenciada a Cell Projects Inc. La compañía o la Universidad no tenían influencia sobre el contenido del documento.

Agradecimientos

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Agradecemos a Lowell Cochran por su ayuda experta en videografía. Se agradece la asistencia financiera de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), la Fundación Canadiense de Cáncer de Mama (CBCF, Capítulo de Ontario), el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), la Alianza Canadiense de Investigación del Cáncer de Mama, los Centros de Excelencia de Ontario, la Acción contra el Cáncer de Mama de Kingston y el fondo de legado de Clare Nelson a través de subvenciones a LR. SG recibió una beca NSERC. MG contó con el apoyo de una beca postdoctoral del Programa de Cáncer de Mama del Ejército de los Estados Unidos, el Ministerio de Investigación e Innovación de la Provincia de Ontario y el Comité Asesor de Investigación de la Universidad de Queen.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM sin Hidrocona de Calcio(Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
Suero de ternero de donante PAA: http://www.paa.com/Cat.# B15-008
Suero fetal bovinoPAA: http://www.paa.com/Cat.# A15-751
Aparato de electroporaciónCell Projects Ltd Reino Unido: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd Reino UnidoACE-04-CC4 pocillos
ChambersCell Projects Ltd Reino UnidoACE-08-CC8 pocillos
Lucifer YellowCell Projects Ltd Reino UnidoACE-25-LYAlta pureza
CelTakBD Biosciences354240Adhesivo para células y tejidos
FibronectinaSigma AldrichF1141
ColágenoBD Biosciences354236
Poli-LisinaSigma AldrichP8920

Referencias

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