RNA catalizador como reportero para rastrear fármacos contra ARN de edición en tripanosomas

Houtan Moshiri; Vaibhav Mehta; Reza Salavati

doi:10.3791/51712

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Artículo de método

RNA catalizador como reportero para rastrear fármacos contra ARN de edición en tripanosomas

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DOI:

10.3791/51712

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22 de julio de 2014

Houtan Moshiri^*¹^,² , Vaibhav Mehta^*¹^,² , Reza Salavati¹^,²^,³

¹Department of Biochemistry, McGill University, ²Institute of Parasitology, McGill University, ³McGill Centre for Bioinformatics, McGill University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este artículo se describe un ensayo basado en ribozima altamente sensible, aplicable al cribado de alto rendimiento de productos químicos dirigidos al proceso único de edición de ARN en patógenos tripanosomátidos. Los inhibidores pueden utilizarse como herramientas para el análisis basado en hipótesis del proceso de edición del ARN y, en última instancia, como terapéuticos.

Resumen

Se ha avanzado considerablemente en la determinación del mecanismo de edición del ARN mitocondrial en tripanosomas. Del mismo modo, se ha avanzado considerablemente en la identificación de los componentes del complejo editosome que catalizan la edición del ARN. Sin embargo, todavía no está claro cómo estas proteínas trabajan juntos. Los compuestos químicos obtenidos a partir de una pantalla de alto rendimiento contra el editosome pueden bloquear o afectar a una o más etapas en el ciclo de edición. Por lo tanto, la identificación de nuevos compuestos químicos generará valiosos sondas moleculares para disecar la función editosome y montaje. En estudios anteriores, los ensayos in vitro de edición en se llevaron a cabo utilizando ARN radiomarcado. Estos ensayos consumen mucho tiempo, ineficiente e inadecuada para fines de alto rendimiento. Aquí, una basada en la fluorescencia homogénea "de mezcla y medida" reportero de ensayo martillo ribozima in vitro para monitorear la edición de ARN, se presenta. Sólo como consecuencia de la edición de ARN dela ribozima cabeza de martillo un sustrato oligorribonucleótido transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) se somete a la escisión. Esto a su vez resulta en la separación del fluoróforo de la inhibidor de la fluorescencia produciendo de este modo una señal. En contraste, cuando la función de editosome se inhibe, se apagará la señal de fluorescencia. Se trata de un ensayo altamente sensible y simple que debe ser de aplicación general para vigilar en la edición de ARN in vitro o cribado de alto rendimiento de los productos químicos que pueden inhibir la función editosome.

Introducción

El proceso de edición de ARN, una modificación post-transcripcional del mRNA, fue descubierto por primera vez en tripanosomátidos ^1. Desde entonces, el trabajo sustancial se ha llevado a cabo en el estudio del mecanismo detrás de la edición de ARN en Trypanosoma brucei ^2,3. En una serie de reacciones enzimáticas, la editosome, un complejo de núcleo de aproximadamente 20 proteínas, crea ARNm mitocondriales maduros para múltiples componentes del sistema de la fosforilación oxidativa de generación de energía. El orden de los eventos catalíticos es la escisión endonucleolítica, uridilato (U) adición o supresión, y la ligadura, según lo dict....