Un promedio de glicoproteína de la envoltura viral Espigas de Electron cryotomography reconstrucciones utilizando Jsubtomo

Resumen

Se presenta un enfoque para determinar las estructuras de los complejos de glicoproteínas de la membrana viral utilizando una combinación de criotomografía electrónica y promediado de subtomografía con el paquete computacional Jsubtomo.

Resumen

Los virus envueltos utilizan glicoproteínas de la membrana en su superficie para mediar en la entrada en las células huésped. Análisis estructural tridimensional de estas glicoproteína 'picos' es a menudo un reto técnico, pero importante para la comprensión de la patogénesis viral y en el diseño de fármacos. Aquí, un protocolo se presenta para la determinación estructural repunte viral a través de un promedio de cálculo de los datos de la crio-tomografía electrónica. Electron crio-tomografía es una técnica en la microscopía electrónica utilizada para obtener reconstrucciones tridimensionales de tomografía de volumen, o tomografías, de muestras biológicas pleomórficas, como los virus de la membrana en un estado casi nativo, congelado-hidratado. Estas tomografías revelan estructuras de interés en tres dimensiones, aunque a baja resolución. Promediado Computacional de sub-volúmenes, o sub-tomografías, es necesario obtener una resolución más alta detalle de repetir motivos estructurales, tales como puntas de glicoproteína viral. Un enfoque computacional detallada para aliGning y un promedio de sub-tomografías utilizando el paquete de software Jsubtomo se perfila. Este enfoque permite la visualización de la estructura de espigas glicoproteína viral a una resolución en el intervalo de 20-40 Å y el estudio del estudio de las interacciones de orden superior-pico-a pico sobre la membrana del virión. Los resultados típicos se presentan para el virus de Bunyamwera, un virus con envuelta de la familia Bunyaviridae. Esta familia es un grupo estructuralmente diverso de patógenos que suponen una amenaza para la salud humana y animal.

Introducción

Electron crio-tomografía es una técnica de imagen electrónica de crio-microscopía que permite el cálculo de una en tres dimensiones (3D) la reconstrucción de muestras biológicas complejas. Muestras adecuadas varían de complejos purificados macromoleculares ^1, filamentos ^2, vesículas recubiertas ^3, y virus de membrana pleomórficas ⁴ a ⁵ células procariotas enteros e incluso zonas delgadas de células enteras eucariotas ^6. Tras la recogida de datos de una serie de posiciones, volúmenes tomográficos 3D, o tomografías, puede calcularse utilizando varios paquetes de software establecidas, incluida Bsoft ⁷ y ⁸ IMOD.

Dos aspectos inherentes al estudio de muestras biológicas por el límite de la crio-tomografía de electrones de la interpretación biológica de los volúmenes correspondientes tomográficas. En primer lugar, debido a la dosis de electrones limitada que se puede aplicar a materiales biológicos antes de introducir el daño por radiación significativa, signa-l-a ruido en los datos tomográficos son típicamente muy baja. En segundo lugar, como resultado de la geometría de inclinación limitado de la muestra durante la recolección de datos, algunos puntos de vista del objeto permanecen ausente, dando lugar a un denominado artefacto 'falta de cuña' en el volumen tomográfica. Sin embargo, ambas de estas limitaciones se pueden superar si el volumen tomográfica contiene la repetición de estructuras idénticas, tales como complejos macromoleculares, que pueden ser promediados con éxito ^9-12.

Antes de un promedio de estructuras de reconstrucciones tomograma, objetos de interés deben ser encontrados y alineados con la misma orientación. Localización de tales estructuras se puede lograr mediante la correlación cruzada de una estructura de plantilla en el volumen tomográfica utilizando un enfoque a menudo referido como plantilla de juego ^13. La plantilla utilizada en este proceso de correspondencia se puede derivar de la crio-microscopía de electrones de electrones o crio-tomografía combinado con reconstrucción 3D, o puede ser un mapa de densidad simulado desdeuna estructura atómica. Varios paquetes computacionales se han desarrollado para llevar a cabo estas tareas ^11.

Promediando de espigas de glicoproteína de membrana de virus, como el VIH-1, ha sido un enfoque particularmente exitoso para el estudio de su estructura ^14-16. La comprensión de la estructura es integral tanto para revelar las bases moleculares de las interacciones virus-huésped y guiar el desarrollo del diseño y la vacuna antiviral. Mientras que la cristalografía macromolecular es la técnica de elección para alta resolución (generalmente mejor que 4 Å) análisis estructural de las glicoproteínas virales individuales y sus complejos, las estructuras de rayos X resultantes de este método son de proteínas aisladas del ambiente membranosa natural sobre el virión . Por lo tanto, los detalles importantes, tales como la arquitectura más alto orden de glicoproteínas virales, en el contexto del virión, siguen siendo deficiente. Por otro lado, electrón crio-microscopía y la reconstrucción de una sola partículade la totalidad de los virus envueltos se limita a viriones con simetría icosaédrica ^17,18. Por lo tanto cryotomography Electron combinado con la alineación sub-volumen ha surgido como una técnica complementaria que permite el estudio de los picos de glicoproteína de forma irregular, virus pleomórficos in situ.

Hemos desarrollado un software llamado Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) para la detección, la alineación, y un promedio de sub-volúmenes tomográficos. Jsubtomo se ha utilizado en la determinación de la estructura de un número de estructuras celulares y virales ^19-26. Aquí, presentamos un protocolo detallado, que permite la determinación de la superficie viral estructuras pico. Para evitar un exceso de refinamiento de estructuras promediadas mediante la correlación de ruido, el esquema de refinamiento 'estándar de oro' se adoptó ^10,27. Por último, se discuten las estrategias para la visualización e interpretación de los resultados típicos.

Protocolo

Un protocolo detallado para la adecuación de cálculo y posterior de promedio de picos de glicoproteína viral se describe. El protocolo sigue el flujo de trabajo se ilustra en la Figura 1 y combina una búsqueda automática de los picos utilizando estructuras de plantilla inicial y un refinamiento de la estructura estándar de oro.

Los datos de entrada para este protocolo es un conjunto de reconstrucciones tomográficas de los viriones. Una tomografía contiene uno o más viriones. Inicialmente, un pequeño subconjunto de los picos se recoge y se utiliza para promediar y perfeccionar dos modelos independientes manualmente. Estos modelos se utilizan para localizar automáticamente los picos en todos los viriones. Finalmente, dos refinamientos independientes se ejecutan y los promedios resultantes se comparan y se combinan para producir la estructura final.

El enfoque de refinamiento se demuestra mediante el uso de los programas del paquete Jsubtomo. Programas del paquete Bsoft ²⁸ se utilizan para una imagen general de ptareas rocesadorasde y gráficos moleculares paquete UCSF Chimera ²⁹ se utiliza para visualizar resultados. Los nombres de los programas individuales se dan en cursiva y formatos de archivo se denotan con las extensiones de nombre de archivo en mayúsculas.

Figura 1:.. Estrategia general para determinar las estructuras de complejos de glicoproteína pico de virus de membrana pleomórficas Los números corresponden a diferentes secciones en el Protocolo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Extraer Virus Sub-volúmenes de tamaño completo tomogramas

1. Escoja partículas de virus de forma manual en las tomografías.
   1. Abra un archivo de tomografía en bshow. Defina el centro de coordenadas de un partic virusle con la función de partículas-picking. Repita este paso hasta que se hayan procesado todos los viriones. Guardar virus coordenadas en un archivo de STAR.
   2. Repita el paso 1.1.1 hasta que se hayan procesado todas las tomografías. Tome nota de que el diámetro del virión en píxeles.
      NOTA: Si los puntos son difíciles de ver en las tomografías, utilice bfilter a paso bajo filtrado del tomografías a 80 Å de resolución (parámetro "-bandpass 80,10000").
2. Ejecute jsubtomo.py en modo de extracto (parámetro "extracto --mode") para extraer virión subvolúmenes a archivos de volumen individuales. Utilice los archivos de STAR guardados en el paso 1.1.1 como archivos de entrada.
   1. Dé un tamaño (parámetro "--Tamaño") ~ 25% más grande que el virión más grande en el conjunto de datos. Por ejemplo, si el virión es ~ 200 píxeles de diámetro, el uso de tamaño 250 x 250 x 250 píxeles.
   2. Los archivos de salida de los volúmenes de viriones estarán en MAP-formato. Además, crear un archivo de STAR-que acompaña a cada volumen virión (paráter "--output").
3. Normalizar el volumen de viriones en bimg (parámetro "0,1 -rescale").

2. generación de dos modelos iniciales Independientes

1. Elige un subconjunto de los picos de los sub-volúmenes virión.
   1. Abra un archivo MAP virión sub-volumen en bshow. Defina el centro de coordenadas de un pico con la función de partículas-picking, accesible a través de la ventana Cuadro de herramientas. Repita este paso hasta que se hayan procesado todos los picos bien diferenciados. Guardar pico coordenadas en un archivo de STAR.
   2. Si es necesario, repita el paso 2.1.1 para otros viriones hasta unos 200 picos de glicoproteína se han procesado. Nota dimensiones pico en píxeles.
      NOTA: ~ 200 picos son una guía aproximada y más pueden ser necesarios para algunas aplicaciones. Si es posible, tratar de recoger espigas en diferentes orientaciones. Evite aspirar sólo vistas superior.
2. Asigne un vector visión inicial a los picos ejecutando jviews.py. Utilice los archivos de STAR generados en el paso 2.1.1 como archivos de entrada.
   NOTA: Este vector vista aproxima a la dirección de la espiga con referencia a la virión.
   1. Utilice la coordenada central para asignar los puntos de vista de un virión esférico. Por ejemplo, si el virión se centra (después de la etapa 1.2) en una caja con un tamaño de 250 x 250 x 250 píxeles, la central de coordenada es 125 125 125 pixeles (opción "--Radial 125125125").
   2. Para asignar los puntos de vista de un virión filamentosos, abrir cada virión sub-volumen en bshow utilizando el archivo ESTRELLA define en el paso 2.1.1 como archivo de entrada. Definir los dos puntos extremos de filamento usando la herramienta de recogida de filamento y guardar el archivo de STAR. Repita este paso hasta que se hayan actualizado todos los archivos de STAR y ejecutar jviews.py utilizando los archivos actualizados de STAR como archivos de entrada (--option segmento).
3. Generar una máscara espacio real utilizando jsubtomo_create_mask.py. Asegúrese de que la máscara es el espacio real de los mismos dimensiones como se utiliza para la estructura promediados (véase 2.6.2) y es lo suficientemente grande como para contener tanto la espiga y un parche de la membrana subyacente.
4. Generar una máscara espacio recíproco usando jsubtomo_create_wedgemask.py. La máscara de espacio recíproco se utiliza para excluir regiones en la región 'falta de cuña' debido a la recolección de datos tomográfica de un solo eje. Asegúrese de que es de las mismas dimensiones que será utilizado para la estructura promedio (véase 2.6.2).
5. Generar un archivo de selección (archivo SEL) definir viriones pertenecientes a conjuntos "1" y "2" utilizando jsubtomo_evenodd.py y los archivos de STAR generados en el paso 2.2.
6. Generar dos medias iniciales usando jsubtomo_create_averages.py.
   1. Utilice el archivo SEL generada en la etapa 2.5 en el archivo de entrada.
   2. Dé un tamaño (parámetro "--Tamaño") al menos 32 píxeles más grandes que la mayor dimensión de la espiga. Por ejemplo, si el pico es de ~ 40 píxeles de largo, el tamaño de su uso 72 x 72 x 72 píxeles.
   3. Aplicar una alta simetría (por ejemplo, C100) en los promedios (parámetro "c100 --symmetry"), para aproximarse a una media cilíndrica alrededor del eje largo de la espiga. Utilice simetrización para reducir el ruido en los promedios iniciales.
   4. Proporcione un nombre único para los archivos de salida del proyecto (parámetro "--suffix").
   5. Utilice la máscara de espacio real generado en el paso 2.3 para enmascarar fuera fondo (parámetro "--mask"). Utilice la máscara de espacio recíproco generado en la etapa 2.4 para tener en cuenta la pérdida de la señal introducida por la presencia de una cuña que falta (parámetro "--Mask").

Alineación iterativo 3. Gold-estándar y de promedio de los dos modelos pico inicial

Iterativamente alinear y promediar los dos modelos iniciales generadas en la sección 2 con jsubtomo_iterate_gold.py.

1. Etapa I. El objetivo de esta etapa es refinar eldirección del vector de vista. El archivo de entrada es el archivo SEL generado en la etapa 2.5.
   1. Use un muestreo angular de 8 grados (parámetro "--angles 8,8,8").
   2. Permitir cambios de 16 grados en la dirección del vector de vista espiga (parámetro "--thetaphilimit 16"), pero mantienen el ángulo alrededor del eje largo clavo fijo (parámetro "--alphalimit 0").
   3. Permitir que los pequeños cambios de traslación (por ejemplo, 5 píxeles) para dar cuenta de las inexactitudes en la recolección manual de los picos (parámetro "--shiftlimit 5").
   4. Aplicar una alta simetría (por ejemplo, C100) en los promedios (parámetro "c100 --symmetry"), para aproximarse a una media cilíndrica alrededor del eje largo de la espiga.
      NOTA: La simetrización se utiliza para reducir el ruido en los promedios.
   5. Utilice la máscara de espacio real y la máscara de espacio recíproco generada en los pasos 2.3 y 2.4 para enmascarar lejos los picos circundantes y cuenta para la cuña faltante (parámetros "--Mpreguntar "y" --Mask ", respectivamente).
   6. Utilice los dos archivos MAP generados en 2.6 (indicado por las etiquetas "incluso" y "extraño" en el nombre del archivo) como plantillas (parámetros "--Template1" y "--Template2", respectivamente).
   7. Aplicar un filtro de paso bajo a 50 Å de resolución (parámetro "--resolution") para evitar el sesgo de la alineación.
   8. Aplicar un factor de 2 bin para acelerar el refinamiento (parámetro "--bin 2").
   9. Ejecutar 5 iteraciones de alineación y un promedio (parámetros "--firstiter 1 --lastiter 5").
2. Etapa II. El objetivo de esta etapa es para refinar el ángulo alrededor del vector de vista. El archivo de entrada es el archivo SEL de salida de la etapa 3.1.9.
   1. Medir las dimensiones exactas de la púa abriendo el archivo MAP filtrada paso bajo generado en la última iteración en el paso 3.1.9 (denotada por la etiqueta "_lp" en el nombre de archivo) en bshow. Generar un nuevo realesmáscara espacio de manera similar al paso 2.3 que define el pico, pero excluye la mayor parte de la membrana y los picos vecinos.
      NOTA: El tamaño óptimo de la máscara depende del tamaño y características de la espiga.
   2. Utilice el muestreo angular de 8 grados (parámetro "--angles 8,8,8") como antes.
   3. Permitir cambios de 180 grados en el ángulo alrededor del vector vista espiga (parámetro "- alphalimit 180") pero mantener la theta y ángulos phi fija (parámetro "--thetaphilimit 0").
   4. No permita que los cambios de traslación (parámetro "--shiftlimit 0").
   5. No aplique ninguna simetría en los promedios (omitir el parámetro "--symmetry").
   6. Utilice la máscara de espacio recíproco generado en la etapa 2.4 para tener en cuenta la falta de cuña.
   7. Utilice los dos archivos MAP generados en la última iteración de la etapa 3.1.9 sin simetría (indicado por las etiquetas "even_nosym" y "odd_nosym" en el nombre del archivo) como plantillas (parámetros R20; - Template1 "y" --Template2 ", respectivamente).
   8. Aplicar un filtro de paso bajo a 50 Å de resolución (parámetro "--resolution") en la primera iteración para evitar el sesgo de la alineación. Ajustar los parámetros de filtro en las siguientes iteraciones automáticamente (parámetro "--adaptivefilter") basado en Fourier Shell Correlación del patrón oro (FSC) entre las dos medias independientes. Utilice 0.143-criterio (parámetro "--fsccrit 0,143"). No permita que el refinamiento más allá del primer cero de la función de transferencia de contraste (CTF) (parámetro "--minhires"), a menos que la corrección CTF se ha aplicado a las tomografías.
   9. Ejecute 5-10 repeticiones de alineación y un promedio (por ejemplo, los parámetros "--firstiter 6 --lastiter 15"). Monitorear los cambios en la resolución informado. Cuando no se observan cambios significativos, el proceso se puede detener.
3. Evaluar el grado de simetría en la estructura por examining el archivo resultante de paso bajo MAP filtrada (denotada por la etiqueta "_lp" en el nombre de archivo) en quimera. Por ejemplo, si el pico es un complejo trimérico, simetría 3 veces debería ser evidente.
4. Etapa III. El objetivo de esta etapa es para refinar el ángulo alrededor del vector de vista adicional con la simetría correcta. El archivo de entrada es el archivo SEL de salida de la etapa 3.2.9. Los parámetros son los mismos que en el paso 3.2 con unas pocas excepciones:
   1. Permitir cambios adecuados en el ángulo en torno al vector vista espiga. Por ejemplo, si la estructura tiene simetría 3 veces, permitir cambios de 60 grados en el ángulo alfa (parámetro "--alphalimit 60").
   2. Aplicar la simetría correcta (por ejemplo, c3) en los promedios (parámetro --symmetry c3 ").
   3. Utilice los dos archivos MAP generados en la última iteración en el paso 3.2.9 (indicados por las etiquetas "par" y "extraño" en el nombre del archivo) como archivos de plantilla de entrada (parámetros "--Template1" y --Template2).
   4. Ejecute 5-10 repeticiones de alineación y un promedio (por ejemplo, los parámetros "--firstiter 16 --lastiter 25"). Monitorear los cambios en la resolución informado. Cuando no se observan cambios significativos, el proceso se puede detener.
5. Etapa IV. El objetivo de esta etapa es refinar con precisión los tres ángulos de forma simultánea. El archivo de entrada es el archivo SEL de salida de la etapa 3.4.4. Los parámetros son los mismos que en el paso 3.4 con unas pocas excepciones:
   1. Permitir cambios de 8 grados en el ángulo alrededor del vector vista espiga (parámetro "- alphalimit 8") y los cambios de 8 grados en la dirección del vector de vista pico (parámetro "--thetaphilimit 8"). Matizar las orientaciones a la precisión de 4 grados (parámetros "--angles 8,8,8 --iterate 2").
   2. Permitir que los pequeños cambios (por ejemplo, 5 píxeles) para dar cuenta de las inexactitudes en los pasos anteriores de alineación (parámetro "--shiftlimit 5").
   3. USE La dos archivos MAP generados en la última iteración en el paso 3.4.4 (denotados por las etiquetas "incluso" y "extraño" en el nombre del archivo) como archivos de plantilla de entrada (parámetros "--Template1" y --Template2).
   4. Ejecute 5-10 repeticiones de alineación y un promedio (por ejemplo, los parámetros "--firstiter 26 --lastiter 35"). Monitorear los cambios en la resolución informado. Cuando no se observan cambios significativos, el proceso se puede detener.

4. Generación y alineación de semillas a la superficie del virus de comparación de plantillas

1. Generar semillas ubicadas de manera uniforme sobre la superficie del virión de comparación de plantillas y asignar un vector visión inicial de las semillas mediante la ejecución jviews.py. Utilice los archivos de STAR generados en el paso 1.2.2 como archivos de entrada. Genera aproximadamente 1,5 veces más semillas que el número esperado de picos.
   NOTA: Este vector vista aproxima a la dirección de la espiga más cercano a cada punto semilla.
   1. Para generar semillas distribuidas uniformemente en un virión aproximadamente esférica (parámetro "--incluso"), dan el radio (parámetro "--radius"), la separación angular (por ejemplo, 20 grados) de las semillas (parámetro "--angle 20" ) y la coordenada central del virión. Por ejemplo, si el virión se centra (después del paso 1.2) en una caja con un tamaño de 250 x 250 x 250 píxeles, la coordenada central es 125 125 125 píxeles (opción "--origin 125125125") .
   2. Para generar semillas distribuidas uniformemente sobre una partícula filamentosa, utilice el parámetro "--Filament" y especificar tanto el radio como parámetros de simetría helicoidal (altura y twist).
      Nota: Los parámetros de simetría helicoidales se utilizan aquí sólo como una manera conveniente de definir las posiciones de semillas distribuidas de manera uniforme y no necesitan reflejar el orden real de los picos en el filamento.
2. Generar dos medias independientes de la superficie del virus como explained en la sección 2.
   1. Generar un archivo SEL definir viriones pertenecientes a conjuntos "1" y "2" utilizando jsubtomo_evenodd.py y los archivos de STAR generados en el paso 4.1.
      NOTA: Para garantizar la independencia de los conjuntos de datos, cualquier asignación previa de los viriones en grupos "1" y "2" debe permanecer igual.
3. Refinar la posición de las semillas.
   1. Siga las instrucciones en el paso 3.1 a menos que se indique lo contrario. Utilice el archivo SEL generada en el paso 4.2.1 que el archivo de entrada.
   2. Permitir que las semillas se desplazan sólo a lo largo de la normal a la membrana (parámetro "--zshiftlimit"). Ajuste la cantidad permitida de cambio en función de la cantidad de los viriones se desvían de la geometría esférica ideal (por ejemplo, el parámetro --zshiftlimit 25 ").
   3. Utilice los dos archivos MAP generados en el paso 4.2 (indicado por las etiquetas "pares" y "extraño" en el nombre del archivo) como archivos de plantilla de entrada (parámetros "--TemPlate1 "y --Template2).
   4. Utilice un sufijo único para evitar sobrescribir los archivos de entrada en estrella original (por ejemplo, el parámetro "--suffix _seeds").
   5. Utilice binning de 4 para acelerar el cálculo (parámetro "--bin 4") y un filtro de paso bajo (por ejemplo, el parámetro "--resolution 50").
4. Generar archivos de marcadores Chimera (CMM) de los archivos semilla estelar refinados usando jviews.py (parámetro "--cmm"). Examine las semillas mediante la apertura de los archivos de CMM (y los archivos MAP virión asociados) en quimera. Asegúrese de que las semillas refinados están alineados correctamente con respecto a la membrana del virus.
   NOTA: Los diferentes colores se puede utilizar para diferenciar distintos conjuntos de marcadores (parámetro "--color"). Alternativamente, los marcadores refinados pueden ser de color en función de su coeficiente de correlación cruzada (por ejemplo, el parámetro "--fomcolor 0.1,0.3").

5. Oro stand-ard iterativo alineación y de promedio de la Estructura de Spike

Localice automáticamente todos los picos de los sub-volúmenes virión mediante comparación de plantillas local alrededor de las semillas refinados y alinear y promediar los picos localizados. Utilice los promedios generados a partir de un subconjunto de los picos recogidos manualmente como plantillas iniciales.

1. Realizar comparación de plantillas local alrededor de las semillas para promediar todos los picos que usan jsubtomo_iterate_gold.py programa. Siga las instrucciones en el paso 3.5 menos que se indique lo contrario.
   1. El archivo de entrada es el archivo de SEL para que las semillas refinados generados en la etapa 4.3.
   2. Utilice un límite suficientemente grande para que el ángulo de visión del vector. Por ejemplo, si las semillas se generaron cada 20 grados (paso 4.1), utilice un ángulo ligeramente más grande que la mitad de este valor (parámetro "--thetaphilimit 12"). Permitir cambios adecuados en el ángulo en torno al vector vista espiga.
   3. Permitir que las semillas se desplacen en el plano de la membrana (parámetro"--xyshiftlimit"). Por ejemplo, si la distancia entre la semilla y la semilla es de 25 píxeles, utilice cambio total de un poco más de la mitad de este (por ejemplo, los parámetros "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
      NOTA: Adicional turnos de la traducción pueden ser necesarios si los archivos de mapa generado en el paso 3.5 se centran en una distancia diferente desde el centro del virión de las semillas.
   4. Utilice los dos archivos MAP generados en el paso 3.5 (indicado por las etiquetas "incluso" y "extraño" en el nombre del archivo) como archivos de plantilla de entrada (parámetros "--Template1" y --Template2).
   5. Utilice la resolución actual de los archivos de mapa generado en el paso 3.5 (parámetro --resolution).
   6. Ejecute 5-10 repeticiones de comparación de plantillas, la alineación y promedio (por ejemplo, los parámetros "--firstiter 1 --lastiter 10"). Monitorear los cambios en la resolución informado. Cuando no se observan cambios significativos, el proceso se puede detener.
   7. Después de cada iteración, Excluir los hits superpuestos. Por ejemplo, si el ancho de la punta es de 30 píxeles, excluye éxitos que están más cerca de 30 píxeles a otros éxitos (parámetro "--mindist 30").
   8. Excluir hits con una baja correlación cruzada co-eficiente. Por ejemplo, incluir los mejores 75% picos para cada virión (parámetro "--topp 75").
      NOTA: Hits con una baja correlación cruzada co-eficiente es probable que representan falsos positivos hits.

6. Visualización de los Resultados

1. Abra la estructura refinada de la subida de quimera para la visualización y el ajuste de las estructuras atómicas.
   1. Utilice el archivo MAP filtrada de paso bajo (denotada por la etiqueta "lp") creado en la iteración final en el paso 5.1.6 como archivo de entrada.
   2. Utilice la resolución indicada en el paso 5.1.6 para la correlación cruzada encajar quimera basada "Fit en mapa" de la herramienta.
2. Crear un modelo compuesto de la VIRIOn utilizando jsubtomo_create_model.py.
   1. Utilice el archivo MAP filtrada de paso bajo (denotada por la etiqueta "lp") creado en la iteración final en el paso 5.1.6 que el archivo MAP entrada (parámetro "--Template").
   2. Utilice un archivo ESTRELLA generado en la iteración final en el paso 5.1.6 que el archivo ESTRELLA entrada.
   3. Utilice el archivo de máscara generada en el paso 3.2.1 para tener en cuenta las densidades de la superposición en el modelo compuesto (parámetro "--mask").
   4. Indicar el tamaño del archivo MAP virión para generar un modelo compuesto del mismo tamaño (parámetro "--size").
3. Abra el modelo compuesto para la visualización en quimera.

Resultados

Se demuestra la aplicación de la promediación de flujo de trabajo sub-tomografía descrito anteriormente para el complejo de glicoproteína de la envoltura del virus de Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) usando un conjunto de datos previamente publicados ^24. Parámetros de recolección y refinamiento de datos se enumeran en la Tabla 1. Una tomografía representativo se muestra en la Figura 2.

Parámetro (unidad)	Valor
La recolección de datos
Voltaje (kV)	300
Ampliación calibrada (X)	111000
Tamaño de píxel (Å)	5.4
Dosis estimada (e - / Å 2)	100
Underfocus (micras)	4,0-4,5
Primera cero CTF (A) un	26-30
Rango de inclinación (°)	-60-60
Muestreo Inclinación (°)	3
De datos y el refinamiento
Las tomografías	11
Los viriones	29
Semillas por virión	106
Número total de semillas	3074
Picos detectados	1346
Pinchos después de la eliminación de superposiciones	1401
Pinchos después de la selección basada correlación cruzada	1022
Espigas incluidos en el promedio final	1022
Simetría	C3
Muestreo angular (°)	8
Resoluciónrango utilizado en el refinamiento (Å)	42-334
Estimación final de resolución (A) b	35

Tabla 1: la recopilación de datos y estadísticas Bunyamwera refinamiento.
^un CTF, función de transferencia de contraste.
^b Calculado usando Fourier correlación shell entre dos estructuras de forma independiente refinados en un umbral de 0.143.

Figura 2:. Rebanada a través de una tomografía de los viriones Bunyamwera Varias vistas laterales pico evidente en la periferia de cada virión se indican con flechas. La tomografía ha sido filtrado de paso bajo a 60 Å. Barra de escala 100 nm.

En primer lugar, estamos perfeccionando un modelo inicial con 205 picos recogidos manualmente ( Figura 3). La simetría de tres veces del centro-pico más era evidente sin aplicar ninguna simetría (Figura 3B) y se impuso en las rondas posteriores de refinamiento (Figura 3C). Para la detección de todos los picos de forma automática en las superficies de virión, se generaron 106 semillas para cada virión en el radio de 43 nm y el espaciamiento de 20 grados (Figura 4A) y iterativamente refinado sus posiciones con respecto a la membrana (Figura 4B).

Figura 3: El perfeccionamiento de la estructura inicial de la plantilla. (A) cilíndrica promedio (C100) plantilla construida a partir de las posiciones definidas manualmente de picos. (B) densidad promediada después de cinco rondas de refinamiento sin ninguna simetría (C1) impuso muestra una espiga con triplecaracterísticas simétricas. La resolución del modelo es de 48 Å. (C) Promedio de la espiga se resolvió en 41 Å después de cinco rondas de refinamiento con simetría triple.

Figura 4:. Refinamiento de las semillas AB) Un subconjunto de las semillas antes (A) y después (B) el refinamiento se muestran en una densidad virión en la Figura 2 Semillas en (B) han sido codificados por color con base en el respectivo cruzada. coeficientes de correlación (Azules, baja correlación; rojo, alta correlación).

Los mejores parches correlacionar glicoproteína pico (superior al 75% después de la eliminación de superposiciones; ~ 1,000 picos) se utilizaron para calcular el promedio final. El promedio se resolvió a 35 Å de resolución (Figura 5). Se reveló una estructura trimérica pico en el medio, enAdemás de alguna contribución de seis picos vecinos. Modelos de compuestos de los viriones, calculados mediante la colocación de la estructura en las posiciones conocidas, revelaron colocación de los picos en la superficie del virión (Figura 6A). Ocasionalmente, los parches ordenados localmente de picos eran evidentes (Figura 6B).

Figura 5: Estructura de refinado de un parche de la capa de glicoproteína pico después de la adaptación de la plantilla. (AB) Dos mapas 'incluso' y 'extraño', reconstruido a partir de dos mitades de los datos se muestran. Los dos mapas muestran un notable grado de similitud, la verificación de la validness del enfoque. La orientación alrededor del eje largo pico es diferente ya que los dos mapas se han reconstruido totalmente independientemente uno de otro. (C) Media de los dos mapas se muestra enla resolución final de 35 Å.

Figura 6: Colocación de los picos en el virión Bunyamwera. (A) Modelo Compuesto de un virión. Ver vectores (palos) indican las orientaciones de los picos. Los colores indican la correlación cruzada entre cada pico y la estructura de la plantilla (azul, baja correlación; rojo, alta correlación). (B) Un primer plano de un parche ordenada de los picos.

Discusión

El conocimiento de la estructura de espiga glicoproteína viral en la membrana del virión es esencial para la comprensión de la replicación del virus y el desarrollo de terapias para tratar y prevenir la infección. Electron crio-microscopía combinado con solo un promedio de partículas se ha convertido en el método más utilizado para resolver las estructuras de partículas de virus envueltos, incluyendo los picos de glicoproteína. Sin embargo, este método se limita a icosahedrally virus simétricas. Aquí, a través de la aplicación de la crio-tomografía de electrones y subtomogram promedio en Jsubtomo, hemos descrito un protocolo general para la determinación de los picos de glicoproteína en pleomórfico virus envueltos que no son susceptibles a otros métodos de biología estructurales actuales. Nuestros resultados representativos demuestran que la resolución de este método es suficiente para revelar conocimientos sobre arquitectura de dominio, oligomerización, y de mayor orden organización de espigas de glicoproteína en viriones intactos.

jove_content "> El paso más crítico dentro de este protocolo está construyendo dos modelos de partida fiables que son estadísticamente independientes una de la otra. ejecución exitosa de este paso se supone que los picos de glicoproteína son suficientemente grandes y no está llena uno contra el otro con demasiada fuerza, de modo que los picos individuales puede ser reconocidos visualmente y manualmente recogidos en el tomografías, y dos modelos independientes en promedio. Si esto no es posible, dos modificaciones en el protocolo se puede intentar. Primera, dos modelos aleatorias independientes se pueden construir mediante la definición de primera dos subconjuntos aleatorios de subtomograms y luego promediando los subtomograms dentro de estos subconjuntos ^30. segundo lugar, si una estructura de la espiga aislado ha sido derivado por otros medios, por ejemplo mediante cristalografía de rayos X, que puede ser utilizado como un modelo de partida. Sin embargo, se debe tener cuidado para bajos filtro de paso este modelo utilizando un punto de corte de baja resolución (50-70 Å), ya que los dos modelos resultantes en la próxima ronda de refinamiento voluntadestadísticamente independiente sólo más allá de esta resolución. Debido a esta advertencia, se recomienda el enfoque anterior.

La resolución que se puede obtener a partir de este protocolo depende de cuatro factores principales: i. estrategia de recopilación de datos y la calidad de los datos de entrada, ii. número de los subtomograms, iii. exactitud de la alineación de los subtomograms, y iv. la heterogeneidad de las estructuras. Mientras que la primera y segunda limitación se puede superar en gran medida mediante el uso de detectores de alta de señal a ruido directa de electrones en combinación con tomografía CTF corregido y recolección de datos automatizado, la alineación de precisión se ve afectada más por el tamaño y forma de la estructura de la propia interés. Al aplicar este protocolo en pequeñas espigas que carecen de características destacadas, puede ser ventajoso para unir los fragmentos Fab a la punta para mejorar la precisión de la alineación y por lo tanto la resolución ^31. Por último, si las estructuras para obtener el promedio de exposición múltiples conformaciones, sub-tomogrmétodos de clasificación am se pueden utilizar para promediar diferentes conformaciones separado. Con ese fin, Jsubtomo integra con el paquete Dynamo, ofreciendo clasificación poderosa subtomogram ^9.

El protocolo anterior es complementaria a la cristalografía de rayos X de las glicoproteínas virales aisladas. Estructuras cristalográficas pueden ensamblarse en promedios sub-tomografía para obtener la orientación precisa de la glicoproteína con respecto a la membrana del virión. La aplicación de esta metodología, sin duda, seguirá arrojar luz sobre la estructura del virus envuelto y biopatología.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jsubtomo (ver 1.3.1)	Universidad de Oxford	n/a	www.opic.ac.uk/jsubtomo
Bsoft (ver 1.8.7)	NIAMS, NIH	n/a	bsoft.ws
UCSF Chimera	UCSF	n/a	www.cgl.ucsf.edu/chimera