Un ensayo de comportamiento simple para Pruebas de función visual en<em&gt; Xenopus laevis</em

Resumen

Xenopus laevis renacuajos prefieren nadar en la parte blanca de un / tanque blanco negro. Este comportamiento es guiado por su visión. Sobre la base de este comportamiento, se presenta un ensayo simple para probar la función visual de los renacuajos.

Resumen

La medición de la función visual en los renacuajos de la rana Xenopus laevis, permite la detección de la ceguera en los animales vivos. La respuesta es un optocinético, comportamiento reflexivo basado en visión que se ha observado en todos los vertebrados examinados. Tadpole ojos son pequeños, así que utiliza la respuesta flip cola como medida alternativa, que requiere de un técnico capacitado para registrar la respuesta sutil. Hemos desarrollado un ensayo alternativo comportamiento basado en el hecho de que los renacuajos prefieren nadar en el lado blanco de un tanque cuando se coloca en un tanque con lados negros y blancos. El ensayo que aquí se presenta es una alternativa de bajo costo, simple que crea una respuesta que se mide fácilmente. La instalación consiste en un trípode, cámara web y tanques de prueba anidados, fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios de Xenopus. Este artículo incluye una película que muestra el comportamiento de los renacuajos, antes y después de cortar el nervio óptico. Con el fin de probar la función de uno de los ojos, también incluimos repreresultados representativos de un renacuajo en la que cada ojo se sometió a la axotomía de la retina en días consecutivos. Los estudios futuros podrían desarrollar una versión automatizada de este ensayo para probar la visión de muchos renacuajos a la vez.

Introducción

Xenopus laevis se han utilizado como un organismo modelo para estudiar la formación del ojo. Los ojos se desarrollan rápidamente, creciendo hacia la madurez en menos de una semana para los genes de prueba o vías que tienen un efecto sobre el desarrollo visual y la función. Para probar la función visual, la respuesta optocinético y optomotor se ha utilizado en el pez cebra y los renacuajos Xenopus, respectivamente ^1,2. Debido a que los ojos de los renacuajos Xenopus son relativamente más pequeño que el pez cebra, este ensayo requiere el uso de equipo especializado y personal entrenado para detectar el comportamiento sutil cola-flip y de movimiento ocular en Xenopus. Un comportamiento más robusto en Xenopus es la preferencia para nadar en un tanque con un fondo blanco, que se describe en el presente documento ^3. Al colocar un renacuajo en un medio tanque negro / mitad blanco, el renacuajo pre-metamórfica nada rápidamente hacia el lado blanco del tanque. Se utilizó previamente este ensayo para determinar si derivado de células pluripotentesojos eran funcionales ^4. Aquí, se presenta una versión detallada de este ensayo, que se puede utilizar para probar la función visual de los renacuajos de Xenopus premetamórficas.

Este ensayo es más sencillo que el ensayo de respuesta optomotor, ya que sólo requiere una cámara de vídeo montada digitales, software de la cámara digital y el equipo estándar en la mayoría de los laboratorios de Xenopus. Además, la respuesta registrada no requiere una formación especial a los resultados de conteo. Nuestros resultados representativos muestran que el mismo grupo de renacuajos, después de haber sido sometidos a axotomía de la retina doble, nadar al azar alrededor del tanque. También hemos incluido los resultados del ensayo de comportamiento de un renacuajo representante, mostrando como uno de los ojos puede ser probado para la respuesta visual. Una hoja de cálculo se ha incluido para que los números adquiridos durante el ensayo pueden ser insertados y se analizaron. Esta hoja de trabajo se puede utilizar para determinar si los renacuajos probados tienen una respuesta visual.

Protocolo

Cuidado de los Animales

La Xenopus laevis renacuajos utilizadas en este estudio fueron cultivados, criados y tratados de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Upstate Medical University IACUC y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

. 1 Configuración Pre-comportamiento: Los renacuajos

1. Obtener embriones de Xenopus fertilizados de una fuente disponible comercialmente o in vitro fertilizar oocitos, como se describió anteriormente ^6.
2. Coloque blástula a embriones en estadio de la placa neural a 18 ˚ C en 60 mm placas de Petri que contienen 0.1X MMR [10 Modificado solución (MMR) de las acciones de Ringer X Marc (10 mM MgCl _2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl _2, 50 mM HEPES; 1 M de NaCl; se ajustó a pH 7,5, sometido a autoclave y se almacenó a temperatura ambiente)] con antibiótico gentamicina 50 mg / ml. Cambie 0.1X MMR cada día y quitar cualquier embriones muertos.
3. Una vez que los embriones alcanzan el estadio Nieuwkoop y Faber ~ 27 al ³⁰ julio, cambiar the embriones en 0.1X MMR sin antibiótico para permitir el crecimiento bacteriano intestinal.
4. Crecer los renacuajos hasta que alcanzan la etapa de alimentación (etapa 45) y moverlos a 100 mm placas de Petri llenas de 0.1X MMR. Aliméntelos sobrenadante polvo de ortiga cada dos días durante una semana, el cambio de la 0,1 X MMR en el día intermedio.
5. Después de una semana en el plato de Petri de 100 mm, desplazar a los animales a medio galón tanques llenos de agua rana [0,5 g / L océano instantánea y 2 mM de sodio fosfato dibásico (Na ₂ HPO _4: mw 141.96) pH 6,8]. Darles de comer como en el paso 2.4, pero cambie el agua sólo 2-3 veces por semana, cuando el agua está turbia. Mantener a los animales en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas light/12 con las luces de encender a las 6 am.
6. Coloque el depósito de medio galón con los sujetos de prueba en una superficie blanca, como un underpad mesa de laboratorio, por lo menos 12 hr O / N, antes de la prueba.
7. Renacuajos de prueba en las etapas 45 y 50 tal como se describe en el paso 3 a continuación.

. 2 Configuración Pre-comportamiento: Equipot

1. Ponga a un lado un área de laboratorio para el ensayo de comportamiento. Debe estar en una zona tranquila y con poco tráfico con iluminación fluorescente estándar.
2. Preparar los bancos de ensayo para los animales.
   Los tanques de prueba de medio galón anidados se componen de dos partes: un tanque interno que contendrá el agua y renacuajos; y un tanque exterior con el estímulo visual.
   1. Para el interior del tanque, hacer una pequeña marca en las esquinas exteriores con un Sharpie, 5 cm desde la parte inferior; esta es la línea de agua (Figura 1A, línea punteada verde).
   2. También, para el tanque interior, llena los divets en el tanque (en las esquinas y el centro) con un compuesto inerte, como Sylgard elastómero. NOTA: Los renacuajos se quedarán en estas zonas si no se llenan pulg
   3. Para el tanque exterior, cubra exactamente la mitad de la parte exterior de un tanque con cinta aislante color negro y la otra mitad con el tejido blanco de papel Figura 1B.
3. Coloque los tanques en ella inoculación de la placa giratoria.
4. Configuración de la cámara web / trípode de modo que está por encima de los bancos de ensayo. Ajustar la cámara para permitir la visualización de la zona de pruebas, como se muestra en la figura 1C.
5. Conecte la cámara web a un ordenador con el software QuickTime Player instalado ^5. Encienda la cámara. En QuickTime Player, en Archivo, seleccione 'Nueva grabación de la película. " La configuración del ensayo de comportamiento será visible en el equipo de inmediato.
6. Coloque un paño de algodón ligero en toda la instalación para reducir las señales externas que podrían afectar el comportamiento de renacuajo, así como, reducir la luz reflejada en la superficie del agua.
7. Asegúrese de que la luminancia bajo las medidas de tela entre 35-50 cd / m ^2.

3. Ensayo de Comportamiento

1. Llene el tanque de pruebas interior para la marca de 5 cm de agua realizada en el paso 1.2.1 con agua rana.
2. El uso de una pequeña red, mover suavemente al animal en el tanque de pruebas interno.
3. Abrir QuickTime software en la computadora y, usando el tanque exterior como guía, asegúrese de que la cámara es capaz de visualizar y grabar la zona de pruebas.
4. Escriba el nombre de un animal, la fecha y la hora en un pedazo de papel y grabar con la cámara.
5. Coloque el tanque de prueba en el tanque exterior con el lado negro de la cisterna a la derecha Figura 2.
6. Comience a grabar la película inmediatamente después de arreglar el tanque y ajustar el temporizador durante 2 min.
7. Cuando el temporizador de pitidos, retire el tanque de prueba interno, gire el depósito exterior 180 ° y coloque el tanque de prueba interna en el interior del tanque externo. Inicie el temporizador. Nota: el lado negro debe estar ahora en el otro lado.
8. Repita el paso 3.7, ocho veces más para un total de diez pruebas. Utilice la Figura 2 como guía, marcando cada ensayo.
9. Repita el ensayo de comportamiento en dos días separados.

4. Retina Axotomía

1. Coloque animal en 0.02% tricaína hasta que no respondena una pizca de la cola con un # 3 pinzas.
2. Derretir 1% de agarosa en 0.1X MMR y luego añadir a un 60 mm placa de Petri. Una vez enfriado, hacer una pequeña chuleta rectangular en la agarosa y añadir el renacuajo a la chuleta con un poco de 0,02% tricaína, de modo que el animal está parcialmente sumergido en el líquido.
3. Pierce la piel en un ángulo de 45 grados detrás de la región dorsal del ojo con una aguja de 25 G, mientras sostiene el animal contra el fórceps sobre el lado opuesto.
4. Teniendo cuidado de no cortar la vena, que se encuentra al lado del nervio óptico, el alcance cuidadosamente en el agujero por el n º 5 de fórceps, cortar el nervio óptico y darle la vuelta a un lado. Si hay sangrado grave por accidente cortando la arteria, luego coloque rápidamente al animal en un 2% tricaína la eutanasia. PRECAUCIÓN: solución tricaína 2% puede causar entumecimiento en los seres humanos. Esta solución debe ser manejado con guantes.
5. Para recuperar el animal después de la cirugía, colocar animal en 100 mm de placa de Petri con 0.7X MMR y 50 mg / ml de gentamicina durante 20 min. Next, transferencia de renacuajo a depósito de recuperación con agua rana. Deje reposar animales O / N.
6. A la mañana siguiente, probar la función visual como se describió anteriormente (pasos 3.1 a 3.9).

5. Analizar Resultados

1. Después de que se completen los ensayos, medir la cantidad de tiempo que el renacuajo se queda en el lado negro de la cisterna.
   1. Ver manual de los vídeos mediante un software que muestra la hora y permite pausas frecuentes. Mira el tiempo de visualización de vídeo. Anote el inicio de la prueba de dos minutos, que es cuando el tanque interior anida con éxito dentro del tanque exterior y se eleva al cuadrado en vista de la cámara.
   2. Use la posición de los ojos del renacuajo de definir de qué lado del tanque de los animales están nadando en. Definir cruzar de un lado del tanque al otro sólo cuando ambos ojos han cruzado la línea de negro / blanco.
2. Anote el comienzo y el final de cada intervalo (en segundos) que el animal pasa en el lado negro. Haga una pausa y volverenrollar el video para asegurar la exactitud. Sume el sec dentro de cada ensayo.
3. Entrada estos números en la hoja de trabajo Comportamiento adjunto. La hoja de trabajo calcula la relación entre el tiempo que el animal pasó por el lado blanco, restando el tiempo invertido en el lado negro del tanque de la prueba total de 120 segundos y se divide por el tiempo total en segundos [(120 - total gastado en segundos el lado negro) / 120 seg]. Los promedios de hoja de cálculo de este ratio de más de los 10 ensayos.
4. Utilice la prueba T de un estudiante, a la par, dos colas de distribución para determinar si los juicios entre los días son significativas (P ≤ 0,05).

Resultados

Informes anteriores han demostrado que los renacuajos de Xenopus premetamórficas prefieren nadar en la parte blanca de un / tanque blanco negro y llamado a este ensayo, el fondo del ensayo preferencia de color ³ Hemos cambiado este ensayo con el fin de probar la función visual de uno de los ojos de los renacuajos en menos de una semana. De esta manera, sus ojos se pueden recoger para el examen histológico.

Mostramos aquí cómo la respuesta se debe a las señales visuales. E...

Discusión

Se presenta aquí un sencillo ensayo de comportamiento guiado por visión que puede ser fácilmente realizado en menos de una semana por personal de laboratorio mínimamente entrenados. Mientras otros ensayos requieren equipo especializado y la experiencia en el comportamiento animal, este ensayo permite una prueba rápida para determinar la función visual. Otro ensayo de comportamiento, el ensayo de evitación de Visual, se ha desarrollado para determinar cómo el tectum contribuye a la percepción visual en Xenopus <...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tanque flexible de 1/2 galón con tapa	eNasco		SB19271M Tamaño: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
Cinta
negra Papel
Plato giratorio de inoculación grande	VWR	50809-022	Tamaño: Dia 114.3 x   H 76,2 mm (4 1/2  x  3")
Almohadilla interior Durasorb	VWR	82004-836	Tamaño: 43,2 x 60,1 cm (17 x 24")
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
Trípode		Varios
Cámara iSight o webcam	Apple	M8817LL/A	Bueno para renacuajos más grandes, pero los pequeños son difíciles de ver
Ordenador portátil	Apple/PC	Varios	Utilizamos un MacBook de 13", 2 GHz Intel Core 2 Duo con MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV videocámara handycam	SONY	DCR-HC42	Conectado por firewire a la computadora con un FireWire 400 alfa de 6 y 4 conductores
Estación Handycam	SONY	DCRA-C121	Se puede utilizar para conectar firewire a la cámara
Software QuickTime Player	Quicktime	versión 10.1
Aguja de 26 G (5/8" de longitud)	VWR	BD305115
Dumont #5 Pinzas	Fine Science Tools	11295-10
Desechables
Sulfato de gentamicina [50 mg/ml]	Fisher Scientific	17-528Z	Almacenado en RT
Sylgard 184 elastómero de silicona	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Solución madre = 100 g/L almacenado en RT
Fosfato de sodio dibásico	Sigma Aldrich	S0876	Solución madre = 0,4 M almacenado en RT
In vitro embriones fecundados	eNasco	LM00490MX	100 embriones/unidad