Marcador de superficie celular mediada Purificación de iPS intermedios célula de un modelo reprogramable Ratón

Summary

El fibroblasto embrionario de ratón puede ser reprogramado en células madre pluripotentes inducidas con baja eficiencia mediante la expresión forzada de los factores de transcripción Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Los raros intermediarios de la reacción de reprogramación son los FACS aislados mediante marcaje con anticuerpos contra los fabricantes de superficie celular Thy-1.2, Ssea-1 y Epcam.

Abstract

Las células maduras pueden ser reprogramadas a un estado pluripotente. Estas llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPS) son capaces de dar lugar a todos los tipos de células del cuerpo y, en consecuencia, tienen un gran potencial para aplicaciones de medicina regenerativa. Tradicionalmente, las células iPS se generan por introducción viral de los factores de transcripción Oct-4, Klf-4, Sox-2 y c-Myc (OKSM) en fibroblastos. Sin embargo, la reprogramación es un proceso ineficiente, ya que solo el 0,1-1% de las células vuelven a un estado pluripotente, lo que dificulta el estudio del mecanismo de reprogramación. Una metodología probada que ha permitido el estudio del proceso de reprogramación es separar los intermedios raros de la reacción de la población masiva refractaria. En el caso de los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), hemos demostrado previamente que las células de reprogramación experimentan una serie distinta de cambios en el perfil de expresión de los marcadores de superficie celular que se pueden utilizar para la separación de estas células. Durante las primeras etapas de la expresión de OKSM, las células que reprograman con éxito pierden el marcador de identidad de fibroblastos Thy-1.2 y regulan al alza el marcador asociado a la pluripotencia Ssea-1. La transición final de un subconjunto de células Ssea-1 positivas hacia el estado pluripotente está marcada por la expresión de Epcam durante las últimas etapas de la reprogramación. Aquí proporcionamos una descripción detallada de la metodología utilizada para aislar los intermedios de reprogramación de los cultivos de MEFs de reprogramación. Con el fin de aumentar la reproducibilidad experimental, utilizamos una cepa de ratón reprogramable que ha sido diseñada para expresar un transactivador transcripcional (m2rtTA) bajo el control del locus Rosa26 y OKSM bajo el control de un promotor sensible a la doxiciclina. Las células aisladas de estos ratones son isogénicas y expresan OKSM de forma homogénea tras la adición de doxiciclina. Describimos en detalle el establecimiento de los ratones reprogramables, la derivación de MEFs y el posterior aislamiento de intermediarios durante la reprogramación en células iPS mediante la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS).

Introduction

Las células madre embrionarias (ES) se derivan de la masa celular interna de embriones en estadio de blastocisto ^1. En condiciones de cultivo apropiadas se auto-renuevan y mantienen su pluripotencia. En 2006 Yamanaka y sus colegas demostraron que las células maduras pueden ser reprogramadas en células llamada madre pluripotentes inducidas (iPS) por la expresión forzada de los factores de transcripción Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) ^2. células iPS, como las células ES, pueden dar lugar a todos los tipos de células del cuerpo, sin embargo, que están libres de las restricciones éticas en torno a la generación de células ES ^3. Además, las células iPS llevan la promesa de la medicina regenerativa personalizada y tienen un enorme potencial para aplicaciones como el modelado de la enfermedad y en la detección de drogas in vitro ^4,5. A fin de que la reprogramación de la tecnología para cumplir con este potencial, el mecanismo básico de la reprogramación nuclear necesita ser completamente comprendido. Sin embargo, los esfuerzos para diseccionar la palmadita reprogramaciónhway han visto obstaculizados por el hecho de que sólo un número muy pequeño de células reprogramar (0,1-1%). Fibroblastos con éxito reprogramación se ha informado de que someterse a una serie distinta de eventos incluyendo una a la transición epitelial mesenquimal ^6-10 y, en las etapas finales de la reprogramación, la activación de la red ^11-14 pluripotencia núcleo endógeno. Nosotros y otros ^12,13,15-17 Recientemente hemos identificado un conjunto de marcadores de superficie celular que permite la separación de compuestos intermedios raras de la población mayor refractario. Fibroblastos de embriones de ratón (MEFs Reprogramación) sufren cambios en la expresión de Thy-1.2, Ssea1 y EpCAM (entre otros) durante el proceso de reprogramación de 2 semanas de duración ^15. Temprano durante la reprogramación de un subconjunto de MEFs regular a la baja la expresión del marcador de la identidad de los fibroblastos (Thy-1.2) y luego comenzar expresando el marcador de pluripotencia asociada SSEA-1 ^12. Durante las etapas finales de la reprogramación de células Ssea1-positivos REACTIVcomió genes pluripotencia endógenos como Oct-4 ^10-13,15. Esta última transición está marcado en la superficie celular por la expresión detectable de EpCAM (véase la Figura 1) o en una etapa posterior Pecam ^15. Recientemente, O'Malley et al. Informaron el uso de CD44 y ICAM1 como alternativas o complementarias a Thy-1.2 y SSEA-1 para la identificación de los productos intermedios de reprogramación. Hemos FACS previamente extraída intermedios de reprogramación desde el Día 0, Día 3, Día 6, culturas Día 9 Día 12 de reprogramación, así como de líneas de células iPS establecidas sobre la base de estos marcadores de superficie celular ^15,18. Para el sistema de reprogramación a continuación se describe y condiciones que hemos mostrado en el nivel de células individuales que, aunque las poblaciones son tranquilas homogénea, hay un cierto grado de heterogeneidad en las poblaciones intermedios identificados. Cabe señalar que sólo un subconjunto de las células dentro de estas poblaciones son capaces de avanzar a la siguiente respectiva stage del proceso de reprogramación y dan lugar a colonias de células iPS en diferentes eficiencias, que han sido ampliamente caracterizadas previamente ^15,19. Por otra parte, la eficiencia de la reprogramación de estas poblaciones dependerá también de las condiciones de re-enchapado y cultura. Para aumentar la reproducibilidad experimental utilizamos una cepa de ratón reprogramable que ha sido diseñado para expresar un transactivador transcripcional (m2rtTA) bajo el control del locus Rosa26 y un casete policistrónico OKSM bajo control de un promotor sensible a la doxiciclina ^20,21. Usando este modelo de ratón evita los efectos secundarios no deseados de los métodos virales tradicionales de generación de células iPS, es decir, una población heterogénea de partida con la célula a la variabilidad celular en número y ubicación de los sitios de integración de inserciones virales. Dos cepas de ratones transgénicos (OKSM, m2rtTA), disponibles como animales fundadores homocigotos en el Laboratorio Jackson, tienen que ser cruzado con el fin de establecer la reprogramodelo de ratón mmable (véase la Figura 2). En este manuscrito se describe en detalle cómo derivar MEFs, generar células iPS, y aislar los compuestos intermedios de reprogramación en las diversas etapas del proceso de conversión por FACS.

Protocol

1. Instrument Settings / Preparación de los reactivos / Genotipado

1. Preparar medio de células iPS: Suplemento 500 ml Knockout medio DMEM con suero de 75 ml fetal bovino (FBS), 5 ml de L-glutamina, 5 ml aminoácidos no esenciales, 500 l β-mercaptoetanol, 5 x 10 ⁵ unidades de factor inhibidor de la leucemia ( LIF). Por favor, consulte la Lista de Materiales para el producto e información de compras para los reactivos utilizados en el contexto de este manuscrito.
2. Preparar medio MEF: Suplemento de 500 ml DMEM con 50 ml de FBS, 5 ml de L-glutamina, 5 ml Los aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 5 ml, 500 l β-mercaptoetanol.
3. Preparar medio de congelación: Por 10 ml, combine 9 ml de FBS con 1 ml de DMSO.
4. Preparar platos recubiertos con gelatina, añadir la solución de gelatina porcina 3-5 ml 0,1% a un matraz T75, se incuban a temperatura ambiente durante al menos 10 min y aspirar justo antes de su uso.
5. Preparar medio de marcaje FACS: para 10 ml, mezclar 9,9 ml de PBS con 0,1 ml de FBS.
6. Realiceuna PCR genotipo para el locus Rosa26 m2rtTA: Realizar reacciones con Taq ADN polimerasa según las instrucciones del fabricante. Use un modificado _MgCl2 -concentración de 3,5 mM y las siguientes 3 ​​cebadores: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG TGT AGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA GAT ATG ATG 3 '. Ciclismo condiciones: 94 ° C durante 3 min; 35 ciclos de (94 ° C durante 30 segundos, 65 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min); 72 ° C durante 2 minutos; mantener a 12 ° C. Tamaño del producto esperado: 650 pb para el alelo de tipo salvaje y de 340 pb para el alelo mutante.
7. Lleve a cabo una PCR genotipificación para el locus colágeno-StemCa / OKSM: Realizar reacciones con Taq ADN polimerasa según las instrucciones. Use un modificado _MgCl2 -concentración de 2,5 mM y las siguientes 3 ​​cebadores: col / frt-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Condiciones de los ciclos: 95 ° C durante 1 min: 2 ciclos de (94 ° C durante 30 segundos, 70 ° C durante 45 s), 6 ciclos de (94 ° C durante 30 segundos, 68 ° C durante 45 segundos) y 30 ciclos de (94 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 1 min); 72 ° C durante 5 minutos; mantener a 12 ° C. Tamaño del producto esperado: 331 pb para el alelo de tipo salvaje y 551 pb para el alelo mutante.
8. Llevar a cabo todos los pasos de centrifugación a 400 xg durante 3 min a 4 ° C.

2. Generación de fibroblastos embrionarios de ratón

1. Realizar un apareamiento sincronizado entre un animal de la cepa OKSM con un miembro del sexo opuesto de la cepa m2rtTA. Cosecha embriones en el día embrionario 13,5 por sacrificio de la madre y de la eliminación de la trompa uterina. Antes de la retirada del cuerno uterino, rocíe la región abdominal con una solución de etanol al 80%, para evitar la contaminación microbiana.
2. Transferir el cuerno uterino en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm que contenía 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Utilice tijeras quirúrgicas de grado esterilizados para cortar el cuerno uterino en trozos que contienen un embrión (véase la Figura 3A, B).
3. Utilice un microscopio de disección (idealmente colocado dentro de una campana de cultivo de tejidos) y pinzas esterilizadas para quitar cuidadosamente la envoltura del útero y las membranas extra-embrionarias que rodean a cada embrión. Transferir cada embrión a un 10 cm separada plato con 10 ml de PBS.
4. Proceder mediante la eliminación de la cabeza del embrión, las extremidades, la cola y los órganos internos (corazón, hígado, intestino, etc) con las pinzas (véase la Figura 3C). Transferencia de la cabeza del embrión en un tubo de 1,5 ml y congelar hacia abajo de modo que puede ser utilizado para el genotipado si es necesario.
5. Transferir el torso del embrión en un 10cm plato vacío y utilizar dos hojas quirúrgicas para picar el embrión durante 2 min. Añadir 200 l de solución de tripsina / EDTA en la parte superior del embrión picada y se incuba durante 3-5 min a TA. Continuar picado durante 2 min, añadir 2 ml de medio MEF en activar la tripsina, y luego transferir a un tubo de 15 ml.
6. Utilice una pipeta de 1.000 l para disociar más mecánicamente el tejido mediante pipeteo suave. Transferencia a una gelatina recubierto placa de 10 cm y añadir otros 10 ml de medio MEF. Nota: Las dos incubadoras normoxic hipóxica y pueden ser utilizados para la cultura, se refieren a la discusión para más información.
7. Después de 24 a 48 horas, la placa debe ser densamente cubierto con MEFs.
8. Alternativamente, las células pueden propagarse a continuación, o se congelan aún más. Para la congelación de las células, eliminar el medio de cultivo, enjuagar el recipiente con 10 ml de PBS para eliminar los restos de medios de comunicación y de superposición con 3 ml de solución / EDTA tripsina. Incubar durante 3-5 min a 37 ° C, inactivar la digestión con tripsina añadiendo 5 ml de medios de comunicación y la transferencia de MEF a un tubo de centrifugación de 15 ml. Haga girar hacia abajo y volver a suspender el sedimento en 3 ml de congelación medios de comunicación. Traslado al 3 crioviales y congelar en un recipiente de congelación celular.

3. Reprogramación de MEFs

ove_content "> NOTA: Precipitar las células por centrifugación a 200 g durante 5 min a 4 ° C y utilizar incubadoras de cultivo de tejidos para la reprogramación normóxicas Puede ser beneficioso para derivar y ampliar MEFs bajo condiciones de hipoxia (5% de oxígeno, véase la discusión para más información. ).

1. Descongelar rápidamente un criovial paso bajo (P0-P1, con 2-3 células de Mio) en un baño de agua (37 ° C) y transferir el contenido en un tubo con 10 ml de medio MEF pre-calentado. Precipitar las células, volver a suspender en medios MEF 12 ml frescas, transferir a un recipiente de cultivo T75 gelatina recubiertos, y permiten que las células se recuperen durante 24-48 horas antes de continuar. Nota: MEFs también se pueden usar directamente después de la derivación.
2. Después de la eliminación de medios de cultivo, lavar con PBS y MEFs cellularize mediante la superposición con una solución de tripsina / EDTA (3 ml para 3-5 min a 37 ° C). Se inactiva la tripsina mediante la adición de 5 ml de medio MEF y disociar además células por mezclado suave con una pipeta de 10 ml. Determinar el número de células utilizando un hemocitómetro.
3. Para reprograexperimentos Mming, MEFs semillas Onto frascos T75 recubiertos con gelatina a densidades de 6,7 x 10 ³ células / cm ² (~ 0,5 millones de células por frasco) en los medios de comunicación IPSC que contienen 2 mg / ml de doxiciclina. Consulte la Tabla 1 con respecto a las recomendaciones de siembra para obtener alrededor de 2 Mio intermedios de reprogramación para cada punto de tiempo. Nota: La reprogramación se inicia con la adición de doxiciclina (2 mg / ml) suplementado medios
4. Para los primeros 6 días a sustituir los soportes cada dos días con doxiciclina fresco complementado medios IPSC (12 ml de medio por matraz T75). Más allá de este punto de renovar los medios de comunicación sobre una base diaria si hay números altos de células. El doble de volumen de cultivo si los cambios de medios sólo se pueden realizar cada dos días.
5. Intermedios de reprogramación de la cosecha en los puntos de tiempo requeridos (sugerencia: días 3, 6, 9, 12) mediante la eliminación de los medios de comunicación, aclarando con volumen apropiado de PBS (10 ml para un matraz T75) y la superposición con una solución de tripsina-EDTA (3 ml para una matraz T75). Incubardurante 3-5 minutos a 37 ° C y se inactiva mediante la adición de 5 ml de medio de IPSC seguidos por pipeteo suave.
6. Número de suspensión de células con un hemocitómetro (ver arriba), pellet por centrifugación, aspirar las células sobrenadante y resuspender en 10 ml de PBS para eliminar cualquier rastro de tripsina. Se precipitan las células una vez más, se aspira el sobrenadante y proceder con el paso 4.1 para aislar los productos intermedios de reprogramación. Nota: Las células que sufren la reprogramación pueden ser criopreservados y descongelado para el aislamiento FACS en una etapa posterior.
7. Para establecer cultivos iPS totalmente reprogramadas, crecer las células en-dox libre IPSC medios durante otros 4-7 días. NOTA: Los cultivos con éxito reprogramación de contener un gran número de colonias por día 12 (ver Figura 4). Durante este tiempo, las células iPS aberrantes que aún requieren expresión OKSM desaparecerán.
8. Alternativamente, para propagar los cultivos restantes iPS totalmente reprogramadas: Inicialmente, la semilla MEFs irradiados a una densidad de 15 x 10 ³ células / cm ² en 12 ml de medio de IPSC en una gelatina recubierta T75 matraz de un día o 6 horas antes de los experimentos.
9. A continuación, los cultivos de células iPS cellularize mediante la eliminación de los medios de comunicación, enjuagando el matraz T75 con 10 ml de PBS, con superposición de 3 ml de solución de tripsina-EDTA e incubando durante 3-5 min a 37 ° C. Se inactiva la tripsina mediante la adición de 5 ml de medio de IPSC seguido de un mezclado suave, transferir a un tubo cónico de 15 ml, girar hacia abajo y luego se resuspendieron en 10 ml de medios de comunicación iPS.
10. Transferir 500 l de esta suspensión de células en los MEFs irradiados (matraz T75) y permitir que los cultivos crezcan durante 4-5 días. Nota: culturas iPS establecidas pueden ser criopreservados o utilizados para experimentos. Líneas celulares clonales se pueden derivar por recoger colonias individuales IPSC bajo un microscopio de disección ^22.
11. Cryo preservar culturas IPSC confluentes como se describe en 2.8 para MEFs.

4. Anticuerpo etiquetado

1. Volver a suspender los sedimentos celulares de las culturas de reprogramación, que se preparaba en la Sección 3, enFACS medios etiquetado complementado con anticuerpos (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotina 1: 400 y anti-EpCAM Fitc 1: 400). Utilice 200 l de mezcla de marcaje complementado por 5 millones de células y se incuba en hielo.
2. Después de 10 min golpee suavemente el tubo para resuspender las células y se incuba durante 10 minutos adicionales en hielo. Añadir 10 ml de PBS frío por tubo y centrifugar.
3. Para cada tubo que se va manchado preparar 200 l de material de etiquetado suplementado con 1 l de estreptavidina-PeCy7 (1: 200) por 5 millones de células. Cuando las células han sedimentado, aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender en un volumen apropiado de los medios de etiquetado suplementadas con estreptavidina-PeCy7.
4. Mantener las células en hielo durante 10 min, toque para volver a suspender, incubar durante otros 10 minutos en hielo, añadir 10 ml de PBS frío por tubo, centrifugar y sobrenadante aspirado.
5. Resuspender los sedimentos celulares en medios suplementados etiquetado con yoduro de propidio (PI) (2 mg / ml) a aproximadamente 1 x 10 ⁷ células / ml. Eliminar grupos de células haciendo pasar la suspensión a través de un colador de 70 micras. Transferir las células a un tubo de FACS apropiado y mantenerlos en hielo.
6. Preparar muestras separadas con anticuerpos individuales (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 y anti-EpCAM). NOTA: Estos están obligados a realizar la compensación de color en los tres canales utilizados en el análisis. Además, se necesitan células no marcadas para ajustar los voltajes y puertas para la clasificación. Lo ideal sería que las células iPS se utilizan para la compensación: existencias de 0,5 a 1 x 10 ⁶ células iPS mantenidos en MEFs irradiados se almacenan en crioviales en nitrógeno líquido. La presencia de MEFs es esencial para obtener una señal en el canal de Thy-1.2.
7. Descongelar un criovial de células iPS como se describe para MEFs (sección 3). Después de la centrifugación, se resuspenden las células en 800 l de tampón de etiquetado y 200 l de esta muestra se encuentra a un lado como el control sin etiquetar.
8. Utilizar las células restantes como controles de compensación. Las células se dividen entre tres tubos de 15 ml y añadir anticuerposcomo sigue: Pacific Blue control de compensación de: añadir 0,5 l de anticuerpo anti-Thy-1.2 Pacific Blue. Tubo de compensación FITC: añadir 0,5 l de anticuerpo anti-EpCAM-FITC. Pe-Cy7 control de compensación: 0,5 l de anticuerpo anti SSEA-1-biotina.
9. Mantener las muestras de células de anticuerpos en hielo durante 10 min, la mezcla tocando y se incuba durante 10 min en hielo.
10. Lávese las muestras con 10 ml de PBS frío para eliminar el anticuerpo no unido, giran celdas hacia abajo y aspirar el sobrenadante. Sedimentos celulares Resuspender en 200 l de FACS medios etiquetado.
11. Por contra SSEA-1-biotina-etiquetados muestras, añadir un conjugado estreptavidina-PeCy7 (1 l por 200 células mu l). Células de la etiqueta como se describe para el anticuerpo primario (SSEA-1-Biotina).
12. Pasar todas las muestras incluyendo el control no marcado a través de un colador de 70 micras y añadir PI (2 g / ml). Transferir las células a tubos de FACS y mantener en hielo hasta que se requiera.

5. FACS Aislamiento de los Intermedios

Nota:Las células se clasifican usando un clasificador celular activado por fluorescencia con 405 nm, 488 nm y 560 nm de excitación láser y una boquilla de 100 micras.

1. Configuración de los voltajes de dispersión frontal y lateral de manera que la población de células se visualiza correctamente. Dibujar una puerta alrededor de las células como se indica en la figura 5A para excluir los desechos. Nota: La configuración correcta de las tensiones en el clasificador de células puede ser complejo y requiere un operador experimentado FACS.
2. Uso dispersión frontal (FSC) de altura frente a área FSC excluir agregados (Figura 5B).
3. Visualice el canal PI frente FSC a puerta en las células vivas negativos PI (Figura 5C).
4. Utilice las células no marcadas para ajustar los voltajes para los canales fluorescentes de PB, FITC / GFP, Pe-Cy7. Idealmente posicionar la población de células en el extremo inferior del canal respectivo.
5. Conjunto puertas con las células de control no marcados como se muestra en la Figura 6A, B a la fracción sub el culto reprogramaciónUres en el día 3, 6 y 9 poblaciones: SSEA-1-/ Thy-1.2 + células; SSEA-1-/ Thy-1.2- células; y la reprogramación como intermediaria en SSEA-1 + / células Thy-1.2-.
6. Además subdividir el día 9 SSEA-1 + / Thy-1.2- fracción usando el Pe-Cy7 frente Fitc blot; dibujar puertas alrededor de la ESS-a1 + / + células las células / Epcam- SSEA-1 EpCAM + y. Conjunto puertas con las células de control no marcados como se muestra en la Figura 6C, D.
7. Prellenado tubos de recogida apropiados con los medios de comunicación de células iPS (1-2 ml) antes de la clasificación de las subpoblaciones que desee (vea la Figura 7 para FACS perfiles representativos de MEFs, Día 3 / Día 6 / Día 9/12 Día de las culturas y las células iPS).
8. Realizar FACS clasificación de acuerdo con fabrica protocolo.
9. Después del aislamiento FACS someter las células a perfiles moleculares (ARN / extracción de proteínas, la inmunoprecipitación de la cromatina, ADN metiloma análisis, etc). Alternativamente, las diversas fracciones de células pueden ser cultivadas.

Results

Después de la disección, la desagregación y el chapado de un embrión E13.5 ratón, se espera que una placa de 10 cm para llegar a la confluencia en aproximadamente 1 a 2 días. En esta etapa, es normal para que la cultura contiene algunas piezas de tejido adherentes que no se han cellularized correctamente. Estos desaparecerán después de los pases.

Tras la inducción doxiciclina, MEFs reprogramación sufren cambios morfológicos distintos. Alrededor del día 6, parches-colonias como primeras pueden comenzar a surgir (Figura 4C). Estos seguirán creciendo en tamaño a un cultivo adicional (ver Figura 4 D, E). Un buen experimento reprogramación debería resultar en> 500 colonias por T75 que se sembró inicialmente con 5 x 10 ⁵ células (Figura 4E). Culturas iPS establecidas poseen colonias en forma de cúpula característicos y sobre todo deben estar desprovistos de células diferenciadas (Figura 4F). De vez en cuando, los pases adicional de iPS cultures pueden ser necesarios para eliminar las células indiferenciadas / parcialmente reprogramadas; un matraz confluente de células se puede dividir en una proporción de 01:10 sobre una capa alimentadora de MEFs irradiados.

Como se mencionó anteriormente, los cambios morfológicos y moleculares durante la reprogramación se reflejan en cambios en los perfiles de FACS para Thy-1.2, SSEA-1 y en última instancia EpCAM (véase la Figura 7A-F). Como se informó anteriormente ^12,15, mientras que MEFs son predominantemente positivos para Thy-1.2 y negativo para los otros marcadores, Día 3 culturas ya se ven muy diferentes. Una gran proporción de las células han empezado a regular a la baja la expresión de Thy-1.2 y un muy pequeño subconjunto de estas células negativas Thy-1.2 se han convertido en positivo para SSEA-1, la reprogramación intermedio efectivo para este punto de tiempo. El número de intermedios de reprogramación que se pueden extraer a partir del día 3 culturas es muy impredecible como el porcentaje de SSEA-1 + / Thy-1.2- por lo general se encuentra en un rango entre 1-10% de viablcélulas e. Los días 6 y 9 un mayor porcentaje de células SSEA-1 +, por lo general muy por encima de 10%, se puede detectar. Alrededor del día 12 de un subconjunto de SSEA-1 células positivas se puede detectar que también etiquetar positivo para EpCAM. Día 12 culturas, como el día 3 culturas, representa un cuello de botella en la purificación de los productos intermedios, como el porcentaje de + / EpCAM células SSEA-1.2 + es variable y generalmente cae en el rango de sólo el 2-4% de todas las células vivas. El número esperado de intermedios de reprogramación presentados en la Tabla 1 sólo sirve como una aproximación. Culturas celulares establecidas de buena fe iPS serán fuertemente positiva para SSEA-1 y EpCAM.

Figura 1: Superficie cambios marcador durante la vía reprogramación: Down-regulación de la seña de identidad de fibroblastos Thy-1.2 es seguido por la sobre regulación deSSEA-1. La transición de un subconjunto de células SSEA-1 positivos hacia un estado pluripotente se indica mediante la adquisición de EpCAM alrededor del día 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Representación esquemática del modelo de ratón reprogramable:. M2rtTA expresión está bajo el control del locus Rosa26 ubicua activo en presencia de doxiciclina (dox) la proteína m2rtTA se une a un promotor dependiente de tetraciclina (tetOP) en el colágeno 1A1 (COL1A1) locus resulta en la expresión del casete de cuatro factores. Dos casetes bicistrónicos están unidos por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). Marcos de lectura abierta para octubre-4 / Klf-4 y Sox-2 / c-Myc son fu sed por F2A y E2A secuencias autoescindibles, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Embrión disección: cuerno uterino (A) Transferencia en un plato de 10 cm llena con 10 ml de PBS y (B) corta en trozos que contienen un embrión. (C) El uso de pinzas liberan los embriones a partir de tejido embrionario extra y eliminar la cabeza, las extremidades, la cola y los órganos internos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Parches Figura 4. Cambios morfológicos durante la reprogramación. Colonia-como se hacen evidentes en las culturas desde el día 6 en adelante. IPSCs Bona fide se caracterizan por una morfología en forma de cúpula. (A) Día 0 / MEFs, (B) Día 3, (C) Día 6, (D) Día 9, (E) Día 12, (F) IPS cultivo celular. Barra de escala:. 200 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 Configuración básica FACS. (A) No incluir escombros con dispersión lateral frente a la dispersión de la zona de transferencia. (B)Excluir agregados de no residuos, colocando puertas en la población de células individuales con Forward Area de dispersión frente a la dispersión de alta blot. (C) Excluir las células muertas de la población de células individuales, colocando puertas en PI eventos de baja con el canal de PI frente a la dispersión Área Blot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Gating. (A, B) El uso de las células de control sin marcar establecidos puertas de Thy-1.2 células + / SSEA-1-, 1.2- Thy-/ células SSEA-1 y Thy-1.2- / SSEA-1 + células. (C) Use las células control sin marcar para establecer puertas de las células positivas y negativas EpCAM EpCAM. (D) SSEA-1 células + / Thy-1.2- pueden separarseen un EpCAM positivo y en una población negativa EpCAM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Thy-1.2 contra SSEA-1 FACS blots en varias etapas del proceso de reprogramación. (A) Día 0 / MEFs, (B) Día 3, (C) Día 6, (D) Día 9, (E) Día 12, el cultivo de células (F) iPS.

Tabla 1. sugeridos densidad de siembra, número de frasco y el resultado esperado para P1 MEF de un heterocigotos embriones para OKSM y m2rtTA. Por favor, haga clic here para ver una versión más grande de esta cifra.

Día	Número de matraces T75 sembró en el día 0	Número total de células Ssea1 + después de FACS	Número total de células Ssea1 + / EpCAM + después de FACS
3	8	2 millones
6	4	2 millones
9	4	2 millones
12	10	10 millones	2 millones

Discussion

Con el fin de reprogramar con éxito MEFs en células iPS y purificar los intermedios de reprogramación a gran cantidad es fundamental ser conscientes de los factores que tienen un impacto en la eficiencia global. En particular, el lote de FBS utiliza para complementar los medios de comunicación iPS puede tener un efecto perjudicial. En experiencias positivas generales se hicieron con madre embrionarias FBS cualificados (ES) de células, pero las pruebas de lote de sueros de una variedad de proveedores podría identificar una alternativa más barata.

Otro factor que incide en la eficiencia de la reprogramación es el genotipo de MEFs ^15,20. Aunque MEFs derivados de ratones heterocigotos (het) tanto para el OKSM y el locus m2rtTA no reprogramar, homozygousity en uno o ambos loci resultados en la eficiencia de reprogramación más altas. De hecho, MEFs derivados de las crías de OKSM y m2rtTA cruces muestran un aumento en la eficiencia de reprogramación en el siguiente orden (OKSM / m2rtTA): het / het la Tabla 1 son para animales het / het). En las raras ocasiones un homo / homo animal macho se identifica, un harén de apareamiento con múltiples hembras m2rtTA se puede configurar. Todos los descendientes de estos cruces será Het / homo para el OKSM / m2rtTA loci, respectivamente. Además, se recomienda la rápida determinación del genotipo de camadas como camadas más grandes se obtienen cuando se utiliza para la cría de ratones más jóvenes (6-15 semanas de edad).

Por otra parte, el uso de MEFs el paso bajo para la reprogramación se enfatiza ^23. Si se derivaron y expandido MEFs en una incubadora de cultivo de tejidos de normoxia se recomienda utilizar sólo estas células hasta el paso 2. Sin embargo, si el experimentador tiene acceso a una incubadora de bajo oxígeno (5% de oxígeno) para la derivación y la expansión de MEFs, números de hasta 3 seguirá siendo dar buenos resultados ²³ pasaje.

En caso de que el experimentador se encuentra con problemas asociados con la reprogramación, como se indica, las explicaciones más probables son números de alto pasaje en el momento de la adición de dox, el genotipo de los ratones incorrecta o el uso de FBS que no es propicio para la generación de células iPS. Sin embargo, en casos raros se observó que MEFs no fueron capaces de reprogramar incluso bajo condiciones ideales. En estos casos, una deleción espontánea de novo dentro de marco de lectura abierto de la m2rtTA se identificó como la razón subyacente.

Esta metodología se ha adaptado con éxito para extraer SSEA-1 + intermedios a través de aislamiento de células magnético (MACS). Existe una clara ventaja de tiempo en el uso de MACS, sin embargo, la pureza de los SSEA-1 + 'poblaciones de células se reduce a 80-90%, en lugar de más de 95%, lo que según el tipo de experimento, las células están destinadas para podría plantear un problema. Por lo tanto, una opción es utilizar MACS para enriquecer en células SSEA-1 +, seguido de FACS para aumentar la pureza y / o fracción en células SSEA-1 + / + y EpCAM SSEA-1 + / Epcam-.

"> Mientras que las células iPS producidos por el protocolo descrito y modelo de ratón han demostrado ser pluripotentes y efectivamente contribuir a todos los tejidos de animales quiméricos ^15,20, una capacidad reducida para producir embriones enteramente compuestas de estas células iPS a través de la complementación tetraploide ha sido demostrado ^24. patrones de metilación aberrante en el grupo de genes Dlk-Dio3 se han identificado como la causa subyacente ^24. Sin embargo, la adición de ácido ascórbico a una concentración de 50 mg / ml a los medios de comunicación durante la reprogramación producirá células de complementación tetraploide iPS competentes ^24. Por favor, tenga en cuenta que un modelo alternativo del ratón reprogramable diseñado para expresar los factores de reprogramación en una estequiometría diferente puede producir tetraploides células iPS competentes, incluso en ausencia de tratamiento con ácido ascórbico ^25. Sin embargo, en nuestras células manos de esta reprogramación deformación a frecuencias considerablemente menor en comparación al modo de ratón utilizado en el presente documentol.

La metodología descrita en este manuscrito permite la separación de los compuestos intermedios de reprogramación de la masa refractaria de la población y debe ser visto como valiosa herramienta para diseccionar y entender el proceso de reprogramación, la eliminación de las limitaciones anteriores de tener que utilizar una población no fraccionada para el perfil (por ejemplo, ruido de alta señal de las células refractarios). La combinación anticuerpo descrito en el presente documento permite el aislamiento de los compuestos intermedios a partir de células de ratón en alta pureza, sin embargo es posible que los marcadores de la superficie celular adicionales serán descubiertas en el futuro que permitirá obtener productos intermedios en aún mayor pureza. Tenga en cuenta que SSEA-1 de expresión no es una característica de las células madre pluripotentes inducidas humanas y como tal este protocolo no se puede utilizar en la reprogramación de células de origen humano. En conclusión, los compuestos intermedios de reprogramación Una vez aislado con el método descrito se pueden utilizar para los análisis molecular incluyendo expresión profilinag, de inmunoprecipitación de la cromatina, metiloma análisis y ensayos de proteínas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-ratón CD90.2 (Thy1.2) Azul Pacífico	eBiociencia	48-0902-82
Biotina SSEA-1 anti-humano/ratón	eBiociencia	13-8813
Estreptavidina PE-Cy 7	eBiociencia	25-4317-82
Anti-Ratón CD326 (Epcam) Fitc	eBiociencia	48-5791-82
Piruvato de sodio	Tecnologías de la Vida	11360-070
MEM Aminoácidos No Esenciales (NEAA)	Tecnologías de la Vida	11140-050
Suero fetal bovino (FBS) calificado para células madre embrionarias	Tecnologías de la Vida
tripsina-EDTA (0,25%)	Tecnologías de la Vida	25200-056 y 25200-056
Tecnologías de vida GlutaMAX		35050-070
β-Mercaptoetanol	Tecnologías de la Vida	21985-023
DMSO (sulfóxido de dimetilo)	Sigma-Aldrich	D8418
Penicilina/estreptomicina	Tecnologías de la Vida	15140
Solución de yoduro de propidio (PI)	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Gelatina de piel de cerdo	Sigma-Aldrich	G1890
Hiclato de doxiciclina	Sigma-Aldrich	33429-100MG-R
Factor Inhibidor de la Leucemia (LIF)	Millipore	ESG1107
DMEM Alta Glucosa	Tecnologías de la Vida	11960-044
DPBS (solución salina tampón de fosfato de Dulbecco)	Tecnologías de la Vida	14190-144
KnockOut DMEM	Tecnologías de la Vida	10829-018
MEFs irradiados	Tecnologías de la Vida	S1520-100
75 cm2 Matraces para cultivo de tejidos	Corning/BD Biociencia
tubos de centrífuga de 15 ml	Corning/BD Biociencia
tubos de centrífuga de 50 ml	Corning/BD Biociencia
Cuchillas quirúrgicas desechables	Clifford Hallam	SM0501
Viales criogénicos	Corning/BD Biociencia
70 y micro; m Colador de células	BD Biociencia	352340
ADN polimerasa Taq	Tecnologías de la Vida	10342-020 y nbsp;