Un método de inmunofluorescencia para la caracterización de las células del esófago de Barrett

Resumen

Existe la necesidad de mejorar la información discernible en los conductores moleculares de esófago de Barrett. La tinción de inmunofluorescencia es una técnica útil para la comprensión de los efectos de la señalización celular en la morfología celular. Se presenta un protocolo simple, efectiva para el uso de la tinción de inmunofluorescencia para evaluar el tratamiento terapéutico en las células del esófago de Barrett.

Resumen

El adenocarcinoma de esófago (EAC) tiene una tasa de supervivencia global de menos del 17% y la incidencia de EAC ha aumentado drásticamente en las últimas dos décadas. Uno de los principales factores de riesgo de EAC es el esófago de Barrett (EB), un cambio metaplásico del esófago escamoso normal en respuesta a la acidez crónica. A pesar de la relación bien establecida entre la CAO y la SER, el interrogatorio de los eventos moleculares, en particular las vías de señalización alteradas involucran progresión de la SER para EAC, son poco conocidos. Mucho de esto es debido a la falta de adecuada en modelos in vitro disponibles para estudiar estas enfermedades. Recientemente, las líneas celulares inmortalizadas BE se han convertido en disponibles en el mercado que permite estudios in vitro de BE. A continuación, presentamos un método para la tinción de inmunofluorescencia de líneas celulares inmortalizadas BE, lo que permite la caracterización in vitro de la señalización celular y la estructura después de la exposición a los compuestos terapéuticos. La aplicación de estas técnicas se help a desarrollar una idea de los mecanismos implicados en BE para EAC progresión y abren una posible vía para el tratamiento y prevención de la EAC.

Introducción

El esófago de Barrett (EB) es un cambio metaplásico en el epitelio escamoso normal del esófago y una consecuencia de la exposición crónica a los contenidos gástricas asociadas a la enfermedad de reflujo gastroesofágico (ERGE) ^1. BE se piensa que es un mecanismo de protección en respuesta a la ERGE, sin embargo, la presencia de EB imparte un mayor riesgo de adenocarcinoma de esófago (EAC), una enfermedad que conlleva una significativa baja supervivencia ^1. Las estimaciones actuales indican que hasta un 5,6% de la población estadounidense tiene EB, sin embargo, como BE es a menudo asintomática, se piensa que la mayoría de BE no se diagnostica ^2. Como las tasas de incidencia tanto de la ERGE y EAC han visto un crecimiento continuo ^3, se ha convertido en importante para comprender los mecanismos moleculares implicados en la progresión de la SER para EAC, sobre todo ya que esta información podría potencialmente proporcionar enfoques terapéuticos destinados a prevenir la progresión de la SER para EAC.

Paciente dirigidos se han traducido en el paradigma actual de BE-EAC patogénesis ^1. La inflamación crónica, lesiones y daño genotóxico como resultado de la exposición prolongada a los contenidos gástricos ejercen una presión selectiva sobre la lesión SER promoción de la progresión neoplásica de EAC. Una serie de alteraciones genéticas han sido identificadas durante la BE a la progresión de la CAO. Sin embargo, a pesar de esto hay una clara falta de comprensión acerca de los cambios exactos en la señalización celular y los efectos posteriores sobre la estructura y la función celular.

Inmortalizada en líneas celulares in vitro son herramientas útiles para estudiar los efectos de la señalización celular, sobre todo en la investigación de los efectos de los compuestos terapéuticos dirigidos. La reciente disponibilidad comercial de BE líneas celulares inmortalizadas permite para tales estudios. Aunque los ensayos de alto rendimiento, tales como los ensayos de viabilidad ampliamente usados, pueden ser valiosas para determinar los efectos de las terapias dirigidas sobre la proliferación celular y Dorvival ^4-6, estos ensayos no son útiles para interrogar a los efectos de la señalización celular en la morfología celular. La tinción de inmunofluorescencia (IF) es una técnica útil para la investigación de los efectos de las terapias dirigidas en las características morfológicas, crecimiento y supervivencia de las células y las proteínas que están implicadas. Nuestro laboratorio ha adaptado estos métodos hacia líneas celulares inmortalizadas BE, usando IF para evaluar los efectos de un fármaco clínicamente disponibles a líneas celulares de BE con la esperanza de delinear un posible tratamiento quimiopreventivo y biomarcadores para el tratamiento de drogas ^7. Del mismo modo, la aplicación de estas técnicas en la EAC, BE y líneas de células esofágicas inmortalizadas ha delineado los hallazgos críticos respecto a BE a EAC progresión ^8-10. Hemos de encontrar si el análisis de las células pueden tratar con terapias dirigidas tiene valor, lo que permite la caracterización de los cambios en la estructura celular y localización de la proteína. A continuación, presentamos nuestros métodos de SI de ser células inmortalizadas a characterize tratamiento farmacológico.

Protocolo

1. Línea Celular Mantenimiento

1. Humana inmortalizada BE displásicas de alto grado (CP-B, CP-C, CP-D) y de metaplasia (CP-A) líneas celulares mediante transfección estable de la telomerasa transcriptasa inversa humana (ter) de proteínas ^11.
2. Mantener BE líneas celulares en medios de queratinocitos suplementado con extracto de pituitaria bovina (BPE), factor de crecimiento epidérmico (EGF), suero bovino fetal al 5% (FBS), aminoácidos no esenciales (NEAA), penicilina-estreptomicina neomicina (PSN), y norma las condiciones de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% CO _2, 98% de humedad).

2. SER celular Plating

1. Preparación de las placas de 12 pocillos / portaobjetos. Coloque 18 mm cubreobjetos en una placa de Petri de vidrio y de autoclave. Transferencia autoclave 18 mm cubreobjetos de vidrio en un 12 pocillos placa de cultivo de tejidos utilizando una pipeta de vidrio estéril conectada a un tubo de vacío. Lavar el portaobjetos con PBS estéril y medios de comunicación.
2. Trypsinize y contar las células inmortalizado. Contar las células using de un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Diluir las células en medios de cultivo a una concentración de 20.000-40.000 células / ml.
3. Coloque 1 ml de células en cada pocillo que contenía un cubreobjetos para un recuento total de 20.000-40.000 células / pocillo.
4. Utilice una punta de pipeta estéril para empujar suavemente el cubreobjetos a la parte inferior del pozo para asegurar que las células se adhieren a la cubreobjetos.

3. Tratamiento de Drogas de las células de BE

1. Diluir fármaco seleccionado en cálidos medios de comunicación (37 ° C) a la concentración deseada y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces o usando un mezclador de vórtice. Concentraciones de fármaco determinado empíricamente. Empiece el tratamiento 24 horas después de la siembra inicial de las células de BE para permitir que las células apego a la cubreobjetos
2. Para la comparación y el control, el tratamiento de un cubreobjetos adicional de células de BE con un 0,1% del vehículo (dimetilsulfóxido [DMSO] o agente utilizado para solubilizar compuestos) diluido en medio de cultivo. Placa de identificación con una pluma de laboratorio para identificar drogas y vehículo muestras tratadas. Colocar las células en una incubadora de cultivo celular ajustado a 37 ° C, 5% de CO _2, 98% de humedad y se incuba durante puntos de tiempo deseados.

4. Inmunofluorescencia La tinción

1. Fijación
   1. Tras el tiempo de incubación deseado de tratamiento de drogas, aspirar los medios y lavar los cubreobjetos rápidamente con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT, 25 ° C).
   2. Aspirar el PBS y añadir 1 ml de PBS que contenía 4% de PFA [PFA al 4% / PBS] a cada pocillo e incubar a TA durante 30 min.
   3. Aspirar el 4% PFA / PBS y se lava el cubreobjetos 3x, 5 minutos cada uno con PBS a RT. Cubreobjetos tienda durante una semana en PBS/0.1% PFA a 4 ° C si se desea.
2. Permeabilización / Bloqueo
   Permeabilizar células PFA fijos para permitir que el anticuerpo para acceder a las dianas intracelulares. Para extracelular a la superficie las proteínas, realizar todos los pasos posteriores sin saponina añadido a la solución de BSA 1x PBS/0.5%.
   1. Reducir fondo mediante la incubación con 50 mM de _NH4Cl diluido en PBS durante 10 min a temperatura ambiente y lavar con RT PBS una vez durante 5 min.
   2. Incubar ser células durante 30 min en 100-300 l de PBS que contenía 0,1% de saponina y 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA). Diluir saponina de filtro esterilizado 10%, preparada en agua y se almacenaron a 4 ° C.
   NOTA: Este previene la unión de los anticuerpos a las proteínas celulares no específica mediante el bloqueo de cubreobjetos debido a la adición de 0,5% de BSA. Alternativamente, sustituir BSA con suero de cabra diluido a 5% para ayudar a reducir la unión no específica de anticuerpos.
3. Preparación de la Cámara humana
   1. Preparar un plato cuadrado bioensayo por capas de la parte inferior de la cámara con toallas de papel húmedo y coloque una capa de Parafilm en la parte superior.
   2. Transferir suavemente el cubreobjetos, células mirando hacia arriba, hacia el Parafilm usando pinzas y una jeringa con aguja.
   3. Marque el Parafilm con una pluma de laboratorio para identificar cubreobjetos.
4. Primaria de anticuerpos de incubación
   1. Diluir el anticuerpo primario en PBS que contenía tanto BSA 0,5% y 0,1% de saponina.
   2. Seque suavemente fuera de la solución de bloqueo utilizando un tejido de laboratorio y añadir 100 ml de la solución de anticuerpo primario. Incubar la primaria de anticuerpos en las células de BE durante la noche a 4 ° C.
5. La incubación de anticuerpo secundario
   1. Se lavan los portas 3x con PBS/0.5% BSA/0.1% saponina durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente.
   2. Diluir anticuerpo secundario conjugado con un marcador fluorescente en PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina que el anticuerpo secundario reconoce las especies en las que se planteó el anticuerpo primario.
   3. Añadir 100 l de anticuerpo diluido a cada cubreobjetos. Incubar el anticuerpo secundario durante 2 horas a TA.
6. Lavado y Montaje del cubreobjetos
   1. Lavar el portaobjetos 3x, 5 minutos en cada una PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina. Retirar el tampón de lavado y añadir 100-300 l de PBS a los cubreobjetos.
      NOTA: Para la doble luchatinción cuerpo, repita los pasos 4.4 hasta 4.5 con el anticuerpo primario y secundario adicional deseado de acuerdo con información que se indica en la discusión.
   2. Con unas pinzas, levante suavemente el cubreobjetos y borra de la PBS utilizando un tejido de laboratorio o toalla de papel.
   3. Añadir 15 l de un medio de montaje anti-fade adecuado que contiene 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) a la cubreobjetos y invertir el cubreobjetos, las células hacia abajo, sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio.
   4. Colocar los portaobjetos en una carpeta porta e incubar fuera de la luz directa durante la noche a temperatura ambiente para permitir que el medio anti-fade establecido difícil de curar, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez que el medio anti-fade ha establecido, las diapositivas se pueden almacenar ya sea en 4 ° C o -20 ° C hasta que la visualización microscópica.

5. Visualización microscópica de Cubreobjetos

Las células teñidas se pueden visualizar a través de cualquiera de microscopía confocal o un SI microscópicas vertical capaze. Aunque la microscopía confocal proporciona imágenes de alta resolución en profundidades discretas, un microscopio en posición vertical es capaz de producir imágenes útiles más rápido. Por razones de brevedad, un método de formación de imágenes manchado BE células mediante microscopía estándar se presenta. En general, a la imagen isotiocianato de fluoresceína (FITC) o fluoróforos similares (es decir, proteína fluorescente verde), rojo de Texas y DAPI, requiere un microscopio con filtros capaces de discriminar estos fluoróforos. Compruebe el microscopio antes de comenzar el protocolo para determinar fluoróforos compatibles.

1. Imaging en un SI Microscopio Estándar
   1. Retire almacenados diapositivas / cubreobjetos de -20 ° C o 4 ° C y permita que alcancen la temperatura ambiente. Encienda el microscopio y lámpara de arco de mercurio.
   2. Coloque portaobjetos con cubreobjetos mirando hacia el objetivo en la platina del microscopio. Para el uso de un objetivo de inmersión en aceite, añadir una gota de aceite de inmersión sobre cubreobjetos.
   3. Seleccione el filtro de DAPI y abrir el obturador.
   4. Enfoque el objetivo mientras mira a través de los oculares hasta que aparezca la imagen. Dado que todas las células se mancha con DAPI, los núcleos deben ser fácilmente observable.
   5. Recoge imágenes utilizando el software de procesamiento de imagen respectiva.

Resultados

Un ejemplo de los resultados obtenidos de la aplicación de los procedimientos descritos se ilustra en las Figuras 1A-D. Cubreobjetos con CP-D y ser células CP-C fueron tratados durante 24 horas con 1 mM del inhibidor de Src familia, SKI-606, o vehículo (DMSO) y se tiñeron utilizando los procedimientos anteriores para la unión adherente y Wnt de señalización de proteínas, β -catenina. Visualización de β-catenina se logró mediante el etiquetado con una IgG anti-conejo acoplada a un fluoróforo verde, mient...

Discusión

Hemos esbozado un método para la aplicación de SI de las células de BE a la aclaración de los efectos fisiológicos de las terapias dirigidas sobre estas células. Aunque se han descrito el uso de estos procedimientos hacia células BE, hemos encontrado que estos métodos son también aplicables a una variedad de diferentes tipos de células ^13,17,18. Además, estos procedimientos pueden ser alterados de varias maneras de optimizar la tinción para objetivos específicos.

Nos encontramos c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CP-A (línea celular metaplásica)	ATCC	CRL-4027
CP-B (línea celular displásica de alto grado)	ATCC	CRL-4028
CP-C (línea celular displásica de alto grado)	ATCC	CRL-4029
CP-D (línea celular displásica de alto grado)	ATCC	CRL-4030
Queratinocitos-SFM (1x),	Liquid Life Technologies	17005-042
0.25% Tripsina-EDTA (1x), Rojo de Fenol	Life Technologies	25200056
Suero fetal bovino, calificado, HI	Life Technologies	10438026
PSN mezcla de antibióticos Life	Technologies	15640
PBS - Solución salina tamponada con fosfato	Life Technologies	10010049
Reactivo antidecoloración de oro Pro-long con DAPI	Life Technologies	P36931
Cubreobjetos de vidrio circular 18 mm	Fisher Scientific	15-183-86
β-catenina Anticuerpo primario (conejo)	Señalización celular	9562S
Alexa Fluor 488 (Cabra Anti-Conejo)	Life Technologies	A11008
10 cm Placa de PS tratada con TC, estéril	USA Scientific	CC7682-3394
Placa PS tratada con TC de 12 pocillos, estéril	USA Scientific	5666-5180
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148
Cloruro de amonio	Sigma-Aldrich	A9434
Saponina	Sigma-Aldrich	47036
Albúmina sérica bovina - Fracción V	Sigma-Aldrich	85040C
SKI-606 (Bosutinib)	Selleck Chemicals	S1014
Plato de bioensayo cuadrado	Thermo Scientific	240835
Parafilm	VWR	82024-546
Pipetas Pasteur desechables, vidrio de pedernal	VWR	14672-380
Nexcelom Mini Cell Counter Cámaras	Nexcelom Nexcelom
		CHT4-SD100-014
Zeiss Apotome Microscopio	Zeiss