Un método de inmunofluorescencia para la caracterización de las células del esófago de Barrett

Summary

Existe la necesidad de mejorar la información discernible en los conductores moleculares de esófago de Barrett. La tinción de inmunofluorescencia es una técnica útil para la comprensión de los efectos de la señalización celular en la morfología celular. Se presenta un protocolo simple, efectiva para el uso de la tinción de inmunofluorescencia para evaluar el tratamiento terapéutico en las células del esófago de Barrett.

Abstract

El adenocarcinoma de esófago (EAC) tiene una tasa de supervivencia global de menos del 17% y la incidencia de EAC ha aumentado drásticamente en las últimas dos décadas. Uno de los principales factores de riesgo de EAC es el esófago de Barrett (EB), un cambio metaplásico del esófago escamoso normal en respuesta a la acidez crónica. A pesar de la relación bien establecida entre la CAO y la SER, el interrogatorio de los eventos moleculares, en particular las vías de señalización alteradas involucran progresión de la SER para EAC, son poco conocidos. Mucho de esto es debido a la falta de adecuada en modelos in vitro disponibles para estudiar estas enfermedades. Recientemente, las líneas celulares inmortalizadas BE se han convertido en disponibles en el mercado que permite estudios in vitro de BE. A continuación, presentamos un método para la tinción de inmunofluorescencia de líneas celulares inmortalizadas BE, lo que permite la caracterización in vitro de la señalización celular y la estructura después de la exposición a los compuestos terapéuticos. La aplicación de estas técnicas se help a desarrollar una idea de los mecanismos implicados en BE para EAC progresión y abren una posible vía para el tratamiento y prevención de la EAC.

Introduction

El esófago de Barrett (EB) es un cambio metaplásico en el epitelio escamoso normal del esófago y una consecuencia de la exposición crónica a los contenidos gástricas asociadas a la enfermedad de reflujo gastroesofágico (ERGE) ^1. BE se piensa que es un mecanismo de protección en respuesta a la ERGE, sin embargo, la presencia de EB imparte un mayor riesgo de adenocarcinoma de esófago (EAC), una enfermedad que conlleva una significativa baja supervivencia ^1. Las estimaciones actuales indican que hasta un 5,6% de la población estadounidense tiene EB, sin embargo, como BE es a menudo asintomática, se piensa que la mayoría de BE no se diagnostica

Protocol

1. Línea Celular Mantenimiento

1. Humana inmortalizada BE displásicas de alto grado (CP-B, CP-C, CP-D) y de metaplasia (CP-A) líneas celulares mediante transfección estable de la telomerasa transcriptasa inversa humana (ter) de proteínas ^11.
2. Mantener BE líneas celulares en medios de queratinocitos suplementado con extracto de pituitaria bovina (BPE), factor de crecimiento epidérmico (EGF), suero bovino fetal al 5% (FBS), aminoácidos no esenciales (NEAA), penicilina-estreptomicina neomicina (PSN), y norma las condiciones de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% CO _2, 98% de humedad).

2. SER celular Plat....

Results

Un ejemplo de los resultados obtenidos de la aplicación de los procedimientos descritos se ilustra en las Figuras 1A-D. Cubreobjetos con CP-D y ser células CP-C fueron tratados durante 24 horas con 1 mM del inhibidor de Src familia, SKI-606, o vehículo (DMSO) y se tiñeron utilizando los procedimientos anteriores para la unión adherente y Wnt de señalización de proteínas, β -catenina. Visualización de β-catenina se logró mediante el etiquetado con una IgG anti-conejo acoplada a un fluoróforo verde, mient.......

Discussion

Hemos esbozado un método para la aplicación de SI de las células de BE a la aclaración de los efectos fisiológicos de las terapias dirigidas sobre estas células. Aunque se han descrito el uso de estos procedimientos hacia células BE, hemos encontrado que estos métodos son también aplicables a una variedad de diferentes tipos de células ^13,17,18. Además, estos procedimientos pueden ser alterados de varias maneras de optimizar la tinción para objetivos específicos.

Nos encontramos c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CP-A (línea celular metaplásica)	ATCC	CRL-4027
CP-B (línea celular displásica de alto grado)	ATCC	CRL-4028
CP-C (línea celular displásica de alto grado)	ATCC	CRL-4029
CP-D (línea celular displásica de alto grado)	ATCC	CRL-4030
Queratinocitos-SFM (1x),	Liquid Life Technologies	17005-042
0.25% Tripsina-EDTA (1x), Rojo de Fenol	Life Technologies	25200056
Suero fetal bovino, calificado, HI	Life Technologies	10438026
PSN mezcla de antibióticos Life	Technologies	15640
PBS - Solución salina tamponada con fosfato	Life Technologies	10010049
Reactivo antidecoloración de oro Pro-long con DAPI	Life Technologies	P36931
Cubreobjetos de vidrio circular 18 mm	Fisher Scientific	15-183-86
β-catenina Anticuerpo primario (conejo)	Señalización celular	9562S
Alexa Fluor 488 (Cabra Anti-Conejo)	Life Technologies	A11008
10 cm Placa de PS tratada con TC, estéril	USA Scientific	CC7682-3394
Placa PS tratada con TC de 12 pocillos, estéril	USA Scientific	5666-5180
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148
Cloruro de amonio	Sigma-Aldrich	A9434
Saponina	Sigma-Aldrich	47036
Albúmina sérica bovina - Fracción V	Sigma-Aldrich	85040C
SKI-606 (Bosutinib)	Selleck Chemicals	S1014
Plato de bioensayo cuadrado	Thermo Scientific	240835
Parafilm	VWR	82024-546
Pipetas Pasteur desechables, vidrio de pedernal	VWR	14672-380
Nexcelom Mini Cell Counter Cámaras	Nexcelom Nexcelom
		CHT4-SD100-014
Zeiss Apotome Microscopio	Zeiss