Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Resumen

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Resumen

Las células madre se dividen asimétricamente para generar dos células hijas con desigual potencial destino: una célula madre de autorrenovación y diferenciación celular. Dada su importancia para el desarrollo y la enfermedad, la comprensión de los mecanismos que gobiernan la división de células madre asimétrica ha sido un área sólida de estudio. Debido a que son genéticamente manejable y se someten a rondas sucesivas de la división celular aproximadamente una vez cada hora, las células madre del sistema nervioso central de Drosophila, o neuroblastos, son modelos indispensables para el estudio de la división de células madre. Acerca de 100 células madre neurales se encuentran cerca de la superficie de cada uno de los dos lóbulos cerebrales de larvas, por lo que este modelo de sistema particularmente útil para estudios de microscopía de formación de imágenes en vivo. En este trabajo se revisan los enfoques ampliamente utilizados para visualizar las divisiones de células madre, y nos dirigimos a las ventajas y desventajas de las técnicas que emplean disocian frente a los tejidos cerebrales intactas relativos. También detalle nuestra simplifprotocolo ied utiliza para explantar cerebros enteros de larvas del tercer estadio de imágenes de células vivas y aplicaciones de análisis fijos.

Introducción

Las células madre mantienen un equilibrio de la diferenciación y autorrenovación para generar diversidad celular durante el desarrollo temprano y reemplazar las células dañadas en los tejidos adultos. Reglamento de esta homeostasis impide que tanto la pérdida como la expansión excesiva de la población de células madre, lo cual puede resultar en la degeneración del tejido perjudicial o tumorigénesis.

Los neuroblastos (NBS) son las células madre neurales ampliamente estudiadas del sistema nervioso central de Drosophila (Figura 1A) que primero forma durante las etapas embrionarias ^{1, 2.} RN sometidos a ron....

Protocolo

1. Preparación de los materiales requeridos para explante Brains tercer estadio larval

1. Preparar las herramientas necesarias para microdisección.
   1. Forjar dos herramientas de disección (un bisturí y un gancho) colocando primero un único pin de disección en cada soporte de pasador. Asegure los pasadores firmemente con la mano o con pinzas (Figura 1C).
   2. Use un par de pinzas de edad para doblar un pin de disección para un ángulo de aproximadamente 120 °. Haga esto bajo un microscopio de disección para asegurar que la mitad superior de la espiga quede plana cuando el soporte de pasador se mantiene en su mano. Esta herramienta se....

Resultados

Formación de imágenes en vivo ha dilucidado una serie de mecanismos que regulan NB ACD. Antes de la adquisición de la imagen, es necesario determinar las condiciones óptimas de formación de imágenes. Es necesario equilibrar la tasa de captura de imágenes con la duración de imágenes de células vivas. Para el análisis celular fina, por ejemplo, aumentó temporal y la resolución óptica puede ser requerida. Cuando la visualización de un solo ciclo celular NB (Figura 4A), la velocidad a la que se capturan las.......

Discusión

Imágenes de células vivas es un enfoque inestimable utilizado para estudiar los mecanismos que regulan ACD de las células madre, la diferenciación de los linajes de células, y la morfogénesis de tejidos complejos. Aunque los grupos de investigación han utilizado históricamente una variedad de técnicas para visualizar NB ACD, estos enfoques pueden ser generalmente se agrupan en dos categorías que difieren principalmente con respecto a si el tejido cerebral se deja intacta o disociado.

Imaging.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo de tejidos Lumox 50 x 12 mm	Sarstedt	94.6077.410	Una placa de cultivo reutilizable con una base de película permeable al gas y ópticamente transparente.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiótico-Antimicótico (100x)	Invitrogen	15240-062	Un suplemento que contiene penicilina (10,000 U/ml), estreptomicina (10,000 μ g/ml) y anfotericina B (25 μ g/ml) que se añade a los medios S2 de Schneider para evitar la contaminación bacteriana y fúngica.
Cubreobjetos de vidrio, #1.5 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Aceite de halocarbono 700	Sigma-Aldrich	H8898	Un aceite inerte de alta viscosidad, transparente e incoloro.
Par de soportes de alfileres niquelados, 17 cm de largo	Fine Science Tools	26018-17
Par de pinzas Dumont #5 Fine	Science Tools	11252-20
Aguja/sonda de disección con mango de plástico	Fisher Scientific	08-965-A Filtro de jeringa
, 0.22 μ m tamaño de poro	Fisher Scientific	09-719A
Jeringa, 5 ml	BD Biosciences	309646
Pipeta de transferencia de plástico	Fisher Scientific	S30467-1
Paraformaldehído, 32% EM grado	Electrónica Microscopy Sciences	15714	PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico; debe manipularse en una campana extractora. Siga las pautas de MSDS para un manejo seguro.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)	Invitrogen	D1306	Colorante que marca el ADN y es excitado por la luz ultravioleta.