Artículo de método

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

DOI:

10.3791/51763

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12 de agosto de 2014

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Resumen

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Los modelos actuales de astrocitoma son limitados en su capacidad para definir las funciones de las mutaciones oncogénicas en tipos específicos de células cerebrales durante la patogénesis de la enfermedad y su utilidad para el desarrollo preclínico de fármacos. Con el fin de diseñar un mejor sistema modelo para estas aplicaciones, se cosecharon y cultivaron astrocitos corticales fenotípicamente salvajes y células madre neurales (NSC) de ratones condicionales modificados genéticamente (GEM) que albergan varias combinaciones de alelos oncogénicos floxados. La recombinación genética se indujo in vitro mediante la recombinación mediada por Cre adenoviral, lo que dio lugar a la expresión de oncogenes mutados y a la deleción de genes supresores de tumores. Las consecuencias fenotípicas de estas mutaciones se definieron midiendo la proliferación, la transformación y la respuesta al fármaco in vitro. Se desarrollaron modelos de aloinjerto ortotópico, en los que las células transformadas se inyectan estereotácticamente en el cerebro de compañeros de camada singénicos inmunocompetentes, para definir el papel de las mutaciones oncogénicas y el tipo de célula en la tumorigénesis in vivo. A diferencia de la mayoría de los xenoinjertos de líneas celulares de glioblastoma humano establecidos, la inyección de astrocitos corticales derivados de GEM transformados en el cerebro de compañeros de camada inmunocompetentes produjo astrocitomas, incluido el subtipo más agresivo, el glioblastoma, que recapituló las características histopatológicas de los astrocitomas humanos, incluida la invasión difusa del parénquima cerebral normal. Se utilizaron imágenes de bioluminiscencia de aloinjertos ortotópicos de astrocitos transformados modificados para expresar luciferasa para monitorear el crecimiento tumoral in vivo a lo largo del tiempo. Por lo tanto, los modelos de astrocitoma que utilizan astrocitos y NSC recolectados de GEM con alelos oncogénicos condicionales proporcionan un sistema integrado para estudiar la genética y la biología celular de la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo y pueden ser útiles en el desarrollo preclínico de fármacos para estas enfermedades devastadoras.

Introducción

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Los astrocitomas son el tumor cerebral primario más común y glioblastoma (GBM), un astrocitoma de grado IV, es el subtipo más común y agresiva con una supervivencia media de 12 a 15 meses 1,2. La invasión de los astrocitomas difusos, en particular GBM, se opone a la resección quirúrgica completa, limita la eficacia de las terapias adyuvantes, y conduce inevitablemente a la recurrencia después del tratamiento 3. Los pacientes inicialmente presentes ya sea de novo (primaria) GBM o con astrocitomas de grado bajo que progresa inevitablemente a GBM (secundaria) 4. GBM es genómicamente heterogénea y que se caracteriza por mutaciones mutuamente excluyentes y concurrentes en los genes que gobiernan tres principales vías de señalización: el punto de control del ciclo celular G1 / S (Rb), receptor de la tirosina quinasa (RTK), y TP53 vías 5-7. GBM consiste en cuatro subtipos genómicos con distintos perfiles de expresión que se asemejan a los diferentes tipos de células del cerebro, lo que sugiere que el subtipo de GBM es influmentado por su 6,8,9 célula de origen. Se requieren mejores modelos de astrocitoma para definir el papel de las combinaciones específicas de mutaciones en tipos particulares de células durante la patogénesis astrocitoma. Aprovechando estos modelos para el desarrollo preclínico más eficiente de drogas en última instancia, ayudará a mejorar los resultados del paciente. Modelos actuales incluyen astrocitoma establecieron líneas celulares humanas, paciente derivado xenoinjertos (PDX), astrocitos humanos normales modificados genéticamente y las células madre neurales (NSC), y ratones modificados genéticamente (GEM) 10-14. Hemos desarrollado un modelo alternativo, GEM no germinal (nGEM) 15 utilizando células cerebrales primarios - astrocitos corticales y NSC - cosechadas de GEM que alberga varias combinaciones de alelos oncogénicos floxed. El objetivo era generar modelos de astrocitoma con células genéticamente definidos que podrían ser caracterizadas fenotípicamente tanto in vitro como in vivo y potencialmente utilizados para el desarrollo de fármacos preclínica en iratones mmune-competentes.

Líneas celulares humanas establecidas son el modelo más comúnmente usado de la patogénesis astrocitoma y la respuesta al fármaco in vitro e in vivo. Son técnicamente sencillo, ampliamente disponibles, y han definido cinética y la tumorigenicidad sobre xenoinjertos ortotópico en ratones inmunodeficientes 10,11,16-18 . Sus desventajas incluyen la incapacidad para generar líneas celulares establecidas a partir de los astrocitomas de bajo grado, limitando estudio sólo a los astrocitomas de alto grado; falta de una celda definida de origen; la presencia de anormalidades genómicas complejas, a menudo con perfiles genómicos que difieren notablemente de la muestra original paciente; y la susceptibilidad a fenotípica y genotípica de deriva durante el cultivo en serie en el suero 11,17,19-22. Las consecuencias fenotípicas de las mutaciones oncogénicas individuales en líneas celulares de GBM humanos establecidos pueden ser enmascarados por la multitud de anomalías que están realmente presentes, que a menudo impide elucconso- de consecuencias directas genotipo-fenotipo.

PDX se generan a través del paso subcutánea de células de astrocitoma aislados de pacientes en ratones inmunodeficientes o por medio de su cultura como esferoides no adherentes en, medio definido libre de suero antes de la inyección ortotópico en el cerebro de ratones inmunodeficientes 12,23. PDX mantener con más precisión el paisaje genómico de astrocitomas humanos, pero similar a líneas celulares humanas establecidas, el efecto fenotípico de mutaciones oncogénicas individuales se puede enmascarar debido a su complejidad genómica 19,24. Para definir las consecuencias fenotípicas de las mutaciones oncogénicas específicas, particularmente en respuesta a las nuevas terapias, los paneles de líneas celulares humanas establecidas o PDX se utilizan con frecuencia para establecer correlaciones genotipo-fenotipo, mostrar generalización, y reducir al mínimo la probabilidad de efectos específicos de la línea de células. Mientras PDX recapitular con precisión las características histopatológicas de astrocitomas humanos, incLuding invasión, xenoinjertos ortotópico de líneas celulares humanas establecidas generalmente no 21,23,25. Además, los astrocitos humanos normales y NSC-han sido modificadas genéticamente con mutaciones oncogénicas definidos para modelar la tumorigénesis astrocitoma in vitro e in vivo 13,14,26. Estas células carecen de la complejidad genómica de líneas celulares humanas establecidas y PDX y recapitulan precisión histopatología astrocitoma humano, pero requieren xenoinjerto en roedores inmunodeficientes in vivo. Debido a que todos los modelos celulares humanas requieren huéspedes roedores inmunodeficientes para prevenir el rechazo de xenoinjerto inmune mediada, estos modelos fallan para recapitular las interacciones nativas tumor-estroma de un sistema singénico y carecen de un sistema inmunológico intacto, lo que limita la investigación preclínica de estroma-dirigida y inmune moduladora terapias 10,11.

GEM permiso de examen de las consecuencias fenotípicas de combinaciones predeterminadas de muta oncogénicociones in vivo durante situ en la tumorigénesis. Considerando que el GEM no condicional tienen mutaciones en todos los tejidos de todo el desarrollo, GEM condicional han floxed alelos oncogénicos que permiten la orientación de las mutaciones mediante la restricción de la recombinación mediada por Cre a determinados tipos de células a través del uso de tipos específicos de promotores celulares 10,11,15,18. GEM astrocitoma condicional se han utilizado para elucidar el papel funcional de mutaciones oncogénicas en distintos tipos de células dentro de un cerebro intacto 11. La utilidad preclínica de gliomagénesis en situ usando GEM condicional está limitada por un número de factores que incluyen 1) la falta de una correlación in vitro, 2) la dificultad en la generación de grandes cohortes de ratones con genotipos complejos, 3) de largo de latencia de en el desarrollo tumoral situ , 4) y estocástico progresión del tumor. Debido a la tumorigénesis in situ carece de un modelo correspondiente in vitro, las pruebas de drogas in vitro no se puede realizar wmodelos condicionales Ith GEM. En contraste con otros tipos de cáncer, los modelos condicionales de GEM astrocitomas rara vez son inducidos por mutaciones oncogénicas individuales 11. Por lo tanto, se requieren complejos sistemas de mejoramiento para generar GEM condicional con múltiples mutaciones oncogénicas. Por otra parte, la iniciación astrocitoma ocurre con penetrancia variable después de un largo período de latencia en estos modelos, mientras que la progresión a los astrocitomas de alto grado se produce generalmente en un no-uniforme, de manera estocástica y en última instancia da lugar a tumores con complejos paisajes genómicas y la cinética de crecimiento rápido 27, 28. La penetrancia variable y la naturaleza estocástica de la progresión maligna en modelos GEM condicional requiere que los ratones individuales se seleccionaron mediante imágenes radiográficas para detectar la presencia y la ubicación de los astrocitomas de alto grado antes de su inscripción en los ensayos de medicamentos preclínicos. Tomados en conjunto, estas limitaciones impiden la generación y prueba de los grandes cohortes de GEM condicional requerida para prpruebas de drogas eClinical.

El sistema de GEM RCAS-TVA, que utiliza retrovirales aviar (RCAS) vectores para infectar GEM ingeniería genética para expresar el receptor viral (TVA) en tipos específicos de células neuronales, se ha utilizado ampliamente para modelar la tumorigénesis astrocitoma 11. En contraste con GEM condicional, este modelo de sistema permite la introducción de múltiples mutaciones oncogénicas en tipos de células específicas sin el requisito de que los esquemas de selección complejas. Sin embargo, está limitada por penetrancia variable, el requisito de que las células se dividen activamente para lograr la integración viral, y la inserción aleatoria de transgenes en el genoma huésped 29.

Los modelos no germinales GEM (nGEM), que utilizan células recogidas de GEM, son cada vez más importantes, ya que superar muchas de las limitaciones de otros sistemas modelo 15. El papel de tipo de célula y de iniciar mutaciones concurrentes en la patogénesis astrocitoma son difíciles de disuadirmina utilizando establecido líneas de células humanas o GBM PDX porque se derivan de los tumores en etapa terminal que se han acumulado mutaciones genéticas extensas en tipos de células no definidos durante el curso de la progresión maligna. En contraste, todos los grados de astrocitomas pueden modelarse usando nGEM mediante la inducción de mutaciones genéticas definidas dentro de los tipos de células cerebrales purificados específicos 11,30. Por lo tanto, la influencia de mutaciones genéticas específicas y tipo de células en fenotipos celulares y moleculares se puede determinar in vitro e in vivo. Similar a las líneas de células de GBM humanos establecidos, en ensayos in vitro inicial de fármaco usando nGEM se puede utilizar para priorizar los medicamentos para las pruebas in vivo utilizando las mismas células. La tumorigénesis in vivo, se puede determinar por aloinjerto nGEM células ortotópicamente en los cerebros de los compañeros de camada singénicos inmunocompetentes 30. Por tanto, estos modelos de aloinjertos ortotópico permiten pruebas in vivo no sólo de citotóxica convencional unnd terapias dirigidas, pero inmunomoduladores y terapias estroma orientada también. Finalmente, el papel del microambiente en la iniciación y progresión del tumor se puede determinar mediante la comparación de resultados entre los modelos convencionales GEM nGEM y utilizando las mismas mutaciones en los mismos tipos de células.

Nosotros y otros han desarrollado astrocitoma nGEM utilizando células primarias - astrocitos, NSC, o células precursoras de oligodendrocitos (OPC) - recogidas de GEM 30-34. La razón de ser del desarrollo de un astrocitoma nGEM era crear un modelo para determinar las consecuencias fenotípicas de las mutaciones oncogénicas en tipos específicos de células que podrían ser utilizados para las pruebas de drogas preclínicas in vitro e in vivo en animales inmunocompetentes. Cosechamos astrocitos fenotípicamente WT corticales y NSC de la no-Cre que expresan, GEM condicional mantenido en un> 94% de fondo C57 / Bl6 con vía presupuesto ordinario floxed - Rb1 loxP / loxP, o TgGZT121 - y floxed RTK / RAS / PI3K vía - Cf1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP - genes en varias combinaciones 35-39. Inducimos recombinación genética in vitro usando vectores adenovirales que codifican la recombinasa Cre. Debido a que las cosechas de astrocitos corticales contienen una mezcla de tipos de células, hemos utilizado vectores Ad5GFAPCre o transgenes oncogénicos dominantes, tales como TgGZT 121 impulsada desde el promotor GFAP humana, para enriquecer para GFAP + astrocitos corticales en estos cultivos. Hemos definido las consecuencias fenotípicas de G 1 / S (Rb), MAPK, y mutaciones de la vía PI3K en astrocitos corticales y NSC in vitro e in vivo. MAPK y PI3K vía activada por G1 / S-defectuosos astrocitos molecularmente mimetizada GBM humano proneural y, tras la inyección ortotópico, tumores formados en una ubicación predefinida con una cinética de crecimiento uniforme, latencias cortas, y el histopatológicosAL características de GBM humano 30. Monitoreo longitudinal del crecimiento del tumor in vivo ayuda a las pruebas preclínicas fármaco a través de la normalización de las cohortes de tratamiento y análisis cuantitativo de crecimiento del tumor en respuesta al tratamiento 40. Se determinó la cinética de crecimiento del tumor por imágenes de bioluminiscencia longitudinal de los ratones inyectados con luciferasa que expresa astrocitos corticales. Por lo tanto, los astrocitos corticales y NSC derivados de GEM condicional proporcionan un sistema modelo manejable para la definición de las consecuencias funcionales de las mutaciones de astrocitoma asociada y un sistema de modelo potencial para el desarrollo de fármacos preclínicos.

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Protocolo

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Todos los estudios con animales fueron aprobados por la Universidad de Carolina del Norte Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

1. cultivo cortical astrocitos de ratones recién nacidos

  1. Preparación
    1. Arruga 2-3 tejidos de tareas delicadas y colocar en el fondo de un matraz que contiene 70% de etanol. Coloque tijeras de disección, fórceps curvos y 2 pares de pinzas de micro directamente en este frasco. Los tejidos se utilizan para evitar que se doblen las pinzas de micro.
    2. Añadir 1 ml de HBSS a una placa de 60 mm de cultivo de tejidos. Preparar un plato separado para cada animal y mantener los platos en el hielo.
    3. Anestesiar a los animales por los reglamentos institucionales.
    4. Caliente 7 ml de DMEM con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina (DMEM completo) para cada animal en un baño de agua a 37 ° C. NOTA: Para 5 ratones, los pasos 1.1.1-1.1.4 tomará ~ 15 min.
  2. Tejido Harvest
    1. Sacrificar ratón neonatal (días 1-3) por Institutireglamentos onal.
    2. Retire tijeras de disección de etanol, les permiten escurrir y hacer un corte sagital en la piel sobre el cráneo de la médula espinal a la nariz.
    3. Hacer un corte en el cráneo a lo largo de la sutura sagital, a partir de la médula espinal y que se extiende más allá de los bulbos olfativos. Tenga cuidado de mantener las puntas de las tijeras cerca de la superficie interna del cráneo para minimizar el daño del tejido cerebral.
    4. Con unas pinzas curvas, pelar suavemente cada hemisferio del cráneo lateralmente lejos del cerebro.
    5. Con unas pinzas de micro rectas, pellizque suavemente la parte dorsal de cada hemisferio cortical y colóquelo en la placa de cultivo de tejido que contiene HBSS. Tenga cuidado de evitar el cerebelo y el bulbo olfatorio. No tome cualquier tejido debajo del cuerpo calloso.
    6. El uso de un microscopio de disección y 2 pares de micro fórceps, retire con cuidado las meninges de cada hemisferio cortical. Devuelva la placa de cultivo tisular de hielo hasta que comienza homogenizatio tejidon.
    7. Repita los pasos 1.2.1 a través de 1.2.6 para cada animal adicional. NOTA: Para 5 ratones, los pasos 1.2.1-1.2.7 tomará ~ 30 min.
  3. Homogeneización de tejidos
    1. Utilizando una cuchilla de afeitar limpia, finamente dados los hemisferios corticales y mover la placa a una campana de cultivo de tejido.
    2. Transferir el tejido cortado en un tubo cónico de 15 ml estéril. Lavar la placa con 1 ml de HBSS enfriado con hielo y transferir al tubo que contiene el tejido.
    3. Espere hasta que el tejido se deposita en el fondo del tubo, a continuación, retire con cuidado el exceso de HBSS usando una pipeta.
    4. Añadir 2 ml de la temperatura ambiente de tripsina / EDTA. Pipeta ~ 10 veces con una pipeta de 1 ml para disociar además células.
    5. Incubar la suspensión de células a 37 ° C durante 15 - 20 min. Mezclar cuidadosamente por inversión cada 5 minutos.
    6. Añadir 3 ml de DMEM completo para inhibir la tripsina. Pipeta ~ 10 veces con una pipeta de 1 ml para mezclar la solución.
    7. Centrifugar a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
    8. Retireel sobrenadante con una pipeta de 1 ml. No aspirar el medio, porque la pastilla puede estar suelto.
    9. Resuspender el precipitado en 4 ml de 37 ° C completar DMEM. Transferir la suspensión celular a un 75 cm tornillo matraz de cultivo de tejido superior. NOTA: Para 5 ratones, los pasos 1.3.1-1.3.9 tomará ~ 50 min.
    10. Aproximadamente 16 horas después de la cosecha de astrocitos, lavar el matraz con 4 ml de 37 ° C HBSS, a continuación, añadir 4 ml de 37 ° C completar DMEM. Mantener los astrocitos corticales a 37 ° C en 5% de CO 2. NOTA: La etapa de lavado es importante para la eliminación de las células no adherentes y los residuos de la placa de cultivo.
    11. Cuando la cultura es de ~ 95% de confluencia, agitar durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2, retire el soporte que contiene las células separadas, luego lava el recipiente con 4 ml de 37 ° C HBSS. Añadir 4 ml de 37 ° C completar DMEM y mantener las células a 37 ° C en 5% de CO 2. NOTA: Este paso es importante para enriquecer las culturas de astrocitos corticales, como la contaminación de la microglía ycélulas progenitoras de oligodendrocitos se desprenden con este procedimiento y se eliminan de la cultura 41.
    12. Repita los pasos 1.3.1-1.3.11 para cada animal.
  4. La inducción de la recombinación genética
    1. 24 horas después de completar el paso 1.3.11, sustituir el medio con 2 ml de 37 ° C completar DMEM. Añadir 1 ml de 37 ° C SMC que contienen 1 l de> 10 10 pfu / ml de Ad5CMVCre o Ad5GFAPCre. Incubar durante 6 horas a 32 ° C en 5% CO 2 .CAUTION: precauciones de seguridad Uso BSL2 al manipular adenovirus recombinante.
    2. Retire el soporte que contiene virus y añadir 37 ° C DMEM completo sin virus a los astrocitos corticales. PRECAUCIÓN: Utilice precauciones de seguridad al manipular BSL2 adenovirus recombinantes y deseche los medios de comunicación que contiene el virus por las regulaciones institucionales. NOTA: Para los 5 cultivos de astrocitos, los pasos 1.4.1 - 1.4.3 se llevará a ~ 15 min excluyendo la incubación de 6 horas.
    3. Ampliar cultivos de astrocitos corticales para envitro e in vivo caracterización. NOTA: determinar la presencia de mutaciones siguiente Cre-recombinación por PCR con cebadores específicos para el gen recombinado o mediante inmunotransferencias, ya sea para la proteína mutada específica o sus consecuencias de señalización. El tiempo requerido para la estabilización fenotípica de cultivos de astrocitos corticales después de la recombinación Cre-será dependiente de las mutaciones utilizadas y debe ser determinada empíricamente (Figura 2).

2. cultivo células madre neurales de ratones recién nacidos

  1. Preparación
    1. Antes de comenzar la disección, preparar 4 ml de solución de digestión por el cerebro mediante la adición de 3,1 mg de papaína y 1,3 mg de cisteína al medio de disociación 4 ml - 98 mM Na 2 SO 4, 30 mM K 2 SO 4, 5,8 mM de MgCl 2, 0,25 mM CaCl 2 , 1 mM de HEPES (de 1 M de HEPES pH 7,4 de stock) de glucosa 20 mM, 0,001% de rojo de fenol, y NaOH 0,125 mM. La adición de papaínay cisteína al medio de disociación se encenderá la solución amarilla.
    2. Incubar en 37 ° C baño de agua durante 15 min. Mezclar periódicamente por inversión.
    3. Añadir 0,1 M NaOH gota a gota hasta que la solución de digestión regresa a la luz de color rojo.
    4. En una campana de cultivo de tejido, filtro estéril de la solución de digestión usando un filtro de jeringa (0,22 m de tamaño de poro). Mantenga la solución de digestión en el hielo.
    5. Preparar 50 ml de Medio de Células Madre (SCM) por mezcla de 44,5 ml NSC medio basal, 5 ml suplemento de NSC, 0,5 ml de penicilina-estreptomicina, 50 l 0.2% de heparina, 10 l 100 mg / ml de EGF, y 10 l 100 g / ml bFGF. SCM es estable durante 1 semana cuando se almacenan a 4 ° C.
    6. Preparar completa HBSS (cHBSS) mediante la mezcla de 50 ml de HBSS 10x, 1,25 ml de HEPES 1 M (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glucosa, 5 ml 100 mM CaCl 2, 5 ml 100 mM MgSO 4, y 2 ml 1 M NaHCO3. Llevar el volumen total a 500 ml con ddH2O
    7. Filtra esterilizar cHBSS ingenioja filtro de tamaño de 0,2 micras de poro y se almacenan a 4 ° C.
    8. Arruga 2-3 tejidos de tareas delicadas y colocar en el fondo de un matraz que contiene 70% de etanol. Coloque tijeras de disección, pinzas curvas, y 2 pares de pinzas de micro directamente en este frasco. Los tejidos se utilizan para evitar que se doblen las pinzas de micro. NOTA: Para 5 ratones, los pasos 2.1.1-2.1.8 tomará ~ 45 min.
  2. Tejido Harvest
    1. Sacrificar neonatal (días 1-3) ratones por regulaciones institucionales.
    2. Retire tijeras de disección del etanol al 70%, les permiten escurrir y hacer un corte sagital en la piel sobre el cráneo de la médula espinal a la nariz.
    3. Hacer un corte en el cráneo a lo largo de la sutura sagital, a partir de la médula espinal y que se extiende más allá de los bulbos olfativos. Tenga cuidado de mantener las puntas de las tijeras cerca de la superficie interna del cráneo para minimizar el daño del tejido cerebral.
    4. Con unas pinzas curvas, pelar suavemente cada hemisferio del cráneo lateralmente lejos de lacerebro.
    5. Retire con cuidado todo el cerebro y colocar en hielo cHBSS frío.
    6. Utilizando un microscopio de disección, retire con cuidado las meninges del cerebro con herramientas de disección finas.
    7. Coloque el cerebro en su superficie inferior y retire cerebelo / cerebro posterior y el bulbo olfativo / corteza frontal con vertical (coronal) corta con un bisturí tamaño 11.
    8. Gire el cerebro restante 90 ° para colocarlo en la porción caudal, generando así una vista coronal del cerebro. Localice los ventrículos laterales.
    9. Cortar una sección cúbica que contiene la zona subventricular (SVZ).
    10. Transferencia SVZ-tejido que contiene a un 60 mm placa de cultivo de tejidos con hielo fresco cHBSS frío y tejido de carne picada con tamaño 11 bisturí.
    11. Transferir el tejido picado a un tubo de 15 ml estéril. Coloque el tubo en hielo.
    12. Lave la placa de Petri con 1-2 ml de hielo cHBSS frío. Transferir la solución de lavado al tubo que contiene el tejido.
    13. Repita los pasos 2.2.1-2.2.12 con neonata adicionall ratones si es necesario. Transferir todos los tubos de 15 ml a una campana de cultivo de tejido para el resto del protocolo. NOTA: Para 5 ratones, los pasos 2.2.1 - 2.2.13 tendrá ~ 45 min.
  3. Homogeneización de tejidos
    1. Colocar la solución de digestión (preparado en la etapa 2.1.1) en un 37 ° C baño de agua durante 5 min. Además, cálido SMC 2 ml por cada cerebro en un 37 ° C baño de agua.
    2. Retirar con cuidado el sobrenadante del tejido picado con una pipeta de 1 ml. No aspirar.
    3. Añadir solución de digestión 2 ml 37 ° C por cada tubo de 15 ml y se mezcla cuidadosamente por inversión.
    4. Incubar en 37 ° C baño de agua durante 15 min. Mezclar por inversión cada 5 minutos.
    5. Añadir otros 2 ml de solución de digestión 37 ° C a cada tubo y repetir el paso 2.3.4.
    6. Permitir que las células se depositan en el fondo del tubo por gravedad, a continuación, eliminar el sobrenadante a partir de tejido digerido usando una pipeta de 1 ml.
    7. Añadir 2 ml de 10 mM E-64 diluido en cHBSS y mezclar cuidadosamente por inversión.
    8. Incubar durante 3 min a temperatura ambiente.
    9. Permitir que las células se depositan en el fondo del tubo por gravedad, a continuación, eliminar el sobrenadante a partir de tejido digerido.
    10. Añadir 1 ml de 37 ° C cHBSS y homogeneizar con una punta de pipeta de 1 ml (~ 20 golpes). Evitar la inyección de burbujas de aire durante la homogeneización de los tejidos.
    11. Pasar el homogeneizado de tejido a través de una de 40 micras filtro de células de tamaño de poro, luego enjuague el filtro con 5 ml de 37 ° C cHBSS.
    12. Centrifugar el homogeneizado de tejido a 125 xg durante 5 min.
    13. Retire el 95% de sobrenadante con una pipeta de 1 ml sin alterar el sedimento celular. Sedimento celular con cuidado resuspender en 200 l 37 ° C SMC con una punta de pipeta de 200 l.
    14. Añadir 1,8 ml 37 ° C SMC y transferir la suspensión celular a un pocillo de una placa de pocillo estéril 6. NOTA: Para 5 ratones, los pasos 2.3.1-2.3.14 tomará ~ 75 min.
  4. Neural Cultura de Células Madre
    1. Reponer el medio después de 3 días al añadir otros 2 ml 37 °C SMC.
    2. Después de 7 días, transferir las neuroesferas a un tubo de 15 ml y dejar que las neuroesferas se depositan por gravedad durante> 5 min.
    3. Eliminar el sobrenadante y añadir 2 ml 37 ° C SMC.
    4. Transferencia de las neuroesferas a un nuevo pocillo de una placa de 6 pocillos.
    5. Añadir 2 ml de 37 ° C SMC cada 3-4 días, y el cambio medio completamente cada 7 días.
    6. Si neuroesferas son> 100 micras de diámetro, disociar cuidadosamente con solución de disociación de células madre y replate la NSC en la densidad celular deseada.
  5. La inducción de la recombinación genética
    1. Añadir 1 ml de 37 ° C SMC que contienen 1 l de> 10 10 pfu / ml de Ad5CMVCre o Ad5GFAPCre a la 2 ml de SMC actualmente en las células. PRECAUCIÓN: Utilice precauciones de seguridad al manipular BSL2 adenovirus recombinante.
    2. Incubar durante 6 horas a 32 ° C en 5% de CO 2.
    3. Traslado SMC con neuroesferas en un tubo de 15 ml y dejar que las esferas se depositan por gravedad durante 5 min.
    4. Eliminar el sobrenadante primero con una pipeta de 1 ml, a continuación, con una pipeta de 200 l. PRECAUCIÓN: Utilice precauciones de seguridad al manipular BSL2 adenovirus recombinantes y deseche los medios de comunicación que contiene el virus por las regulaciones institucionales.
    5. Añadir 2 ml de 37 ° C SMC sin virus a la NSC, a continuación, transferir a una placa de 6 pocillos. NOTA: Para 5 culturas NSC, los pasos 2.5.1-2.5.5 tomará ~ 15 min excluyendo la incubación de 6 horas.
    6. El día siguiente, repita los pasos 2.5.1-2.5.5, seguido por pases neurosphere cuando sea necesario. Las esferas ahora se pueden ampliar por 2-3 pasajes antes de la caracterización in vitro y la inyección ortotópico en cerebros de ratón in vivo. NOTA: determinar la presencia de mutaciones siguiente Cre-recombinación por PCR con cebadores específicos para el gen recombinado o mediante inmunotransferencias, ya sea para la proteína mutada específica o sus consecuencias de señalización. El tiempo requerido para la estabilización fenotípica de las culturas NSC después de la recombinación Cre-será dependienteen las mutaciones utilizadas y debe ser determinada empíricamente (Figuras 2 y 3).

3. inyección ortotópico de células recombinado en el cerebro del Recipiente Iimmunocompetent Ratones

  1. Preparación de 5% Metil Celulosa
    1. Disolver 5 g de 15 cPs metilcelulosa en agua desionizada hasta un volumen final de 50 ml en una botella de 100 ml tornillo tapa. Añadir el polvo lentamente mientras se agitaba a 4 ° C para evitar la formación de grumos. Se puede tomar hasta 24 horas de agitación a 4 ° C durante toda la metilcelulosa para entrar en solución.
    2. Pesar el frasco y registrar el peso.
    3. Autoclave la solución de celulosa de metilo 5%. Una vez tratada en autoclave, la celulosa de metilo se convertirá en un gel semisólido.
    4. Pesar el frasco y calcular el peso perdido durante el tratamiento en autoclave.
    5. Añadir asépticamente 1 ml de agua estéril por cada gramo de peso perdido.
    6. Coloque en el hielo y añadir 50 ml de hielo frío 2x DMEM.
    7. Mezclar durante la noche utilizando un agitador magnético a 4 ° C. Utilice una técnica estéril para dividir la solución de celulosa de metilo 5% en alícuotas de 20 ml. Alícuotas se almacenan a 4 ° C para hasta seis meses o hasta que el 2x DMEM expira. NOTA: Preparación de la solución de celulosa de metilo 5% en pasos 3.1.1-3.1.7 se llevará a ~ 2,5 días.
  2. Preparación de astrocitos corticales para Inyección
    1. Astrocitos corticales de la cosecha cuando ~ 90% confluentes.
    2. Para cosechar, aspirado de DMEM completo y lavar las placas con un volumen igual de 37 ° C HBSS.
    3. Añadir tripsina suficiente para cubrir la placa. Incline suavemente y toque la placa hasta que las células comienzan a separar.
    4. Inactivar la tripsina con un volumen igual de 37 ° C completar DMEM.
    5. Transferir las células a un tubo cónico de 50 ml y lavar la placa con el mismo volumen de 37 ° C DMEM completo utilizado en 3.2.4.
    6. Traslado de medios de lavado al tubo que contiene células. Centrifugar a 200 xg durante 3 min.
    7. Aspirar scélulas upernatant y volver a suspender en 1 ml de 37 ° C DMEM completo.
    8. Cuente la suspensión de células usando un hemocitómetro o un contador de células apropiada para determinar el número de células / l.
    9. Transferir el número deseado de células a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 200 xg durante 3 min.
    10. Resuspender las células en 800 l de 37 ° C DMEM completo. Determinar el volumen del sedimento de células (volumen total de suspensión de células - 800 l). NOTA: Es esencial para lograr una concentración de células precisa para inyección. Por lo tanto, el volumen del sedimento de células se debe determinar en este paso con el fin de calcular el volumen de 5% de celulosa de metilo para añadir en el paso 3.2.12.
    11. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y centrifugar a 200 xg durante 3 min.
    12. Aspirar el sobrenadante del sedimento celular y resuspender las astrocitos corticales en el volumen adecuado de helado 5% de celulosa de metilo (deseado volumen total - volumen deel sedimento celular) para obtener el número deseado de células / l.
    13. Colocar las células en hielo hasta la inyección.
    14. Coloque una jeringa de vidrio de 250 l en un antígeno dispensador de repetición y luego colocar un contundente 18 G aguja en la jeringa.
    15. Retire el émbolo lentamente con la aguja en la suspensión de astrocitos corticales; habrá una burbuja de aire por encima de las células que deben ser eliminadas, ya que las burbujas de aire se comprimen y disminuir el volumen realmente inyectado en el cerebro.
    16. Mantenga la punta de la aguja justo por encima de la suspensión de astrocitos corticales y empuje el émbolo rápidamente. La burbuja de aire se moverá más rápido que la suspensión de células y será expulsado en su mayoría.
    17. Repita el paso 3.2.16 hasta que todas las burbujas de aire se retira de la aguja.
    18. Llene la jeringa con aproximadamente ~ 200 l, a continuación, mantenga la aguja hacia arriba y tire del émbolo hacia atrás hasta que se detenga. Pequeñas burbujas de aire se pueden eliminar mediante la celebración de la aguja punta hacia arriba y empujando el émbolo rápidamente en aproximadamente 50 l entonces retirar lentamente a plena capacidad.
    19. Mantenga la punta de pie y repita el paso 3.2.18 4-5x.
    20. Deseche la aguja de calibre 18 y en forma de una aguja de 27 g en la jeringa.
    21. Pulse el botón en el dispensador de antígeno hasta que el líquido es expulsado de la aguja. NOTA: Para 1 línea celular de astrocitos, los pasos 3.2.1-3.2.21 tomará ~ 60 min.
  3. Preparación de NSC para Inyección
    1. Cuando neuroesferas son> 100 m de diámetro, transferir a tubos de 15 ml y dejar que las neuroesferas se depositan por gravedad durante> 5 min.
    2. Eliminar el sobrenadante y disociar las neuroesferas con un reactivo de disociación suave, tales como solución de disociación de células madre o accutase de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con 0,05% de tripsina-EDTA como se ha descrito 42.
    3. Inhibir los reactivos de disociación de acuerdo con las instrucciones del fabricante sin exponer el NSC al suero. Se centrifuga a 100 × g durante 5 min.
    4. Aspirar el sobrenadante, a continuación, resuspender las células en 1 ml de 37 ° C cHBSS para generar una suspensión de células individuales.
    5. Contar las células usando un hemocitómetro o un contador de células apropiado para determinar el número de células / l.
    6. Transferir el número deseado de NSC a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Se centrifuga a 100 × g durante 5 min.
    7. Resuspender las células en 800 l de 37 ° C HBSS. Determinar el volumen del sedimento de células (volumen total de suspensión de células - 800 l). NOTA: Es esencial para lograr una concentración de células precisa para inyección. Por lo tanto, el volumen del sedimento de células se debe determinar en este paso con el fin de calcular el volumen de 5% de celulosa de metilo para añadir en el paso 3.3.9.
    8. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y centrifugar a 100 xg durante 5 min.
    9. Aspirar el sobrenadante y terminar de preparar las células para inyección ortotópico como en 3.2.12-3.2.21. NOTA: Para 1 línea celular NSC, los pasos 3.3.1-3.3.9 se llevará a ~ 60 min.
  4. Preparación de ratón para inyección
    1. Anestesiar al animal receptor a través de una inyección IP de 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribromoetanol) o 100 mg / kg de ketamina más 10 mg / kg de xilazina, según las directrices del IACUC institucional. NOTA: En la presente memoria son ratones a los 3-6 meses de edad como anfitriones de aloinjertos. Los ratones a diferentes edades se puede utilizar para investigar el impacto de la edad microambientales del desarrollo cerebral en la tumorigénesis.
    2. Afeitar el cuero cabelludo sobre el sitio de la incisión con tijeras o tijeras.
    3. Esterilizar el sitio quirúrgico con 3 hisopos alternas de etanol al 70% y betadine.
    4. Aplique una pomada oftálmica para los ojos para evitar cualquier daño debido a la pérdida de reflejo de parpadeo.
    5. Evaluar la profundidad de la anestesia por la retirada del pedal (pizca dedo del pie) refleja. NOTA: Para 5 ratones, los pasos 3.4.1-3.4.5 tomará ~ 15 min.
  5. Implantación ortotópico
    1. Asegure el animal en el marco estereotáxico.
    2. Make una incisión sobre la sutura sagital aproximadamente 0,5 cm de largo entre las orejas y los ojos.
    3. Ubicar la intersección de las suturas coronal y sagital (bregma), así como la intersección de las suturas sagital y lambdoid (lambda). Asegúrese de que Bregma y Lambda están en el mismo plano horizontal.
    4. Coloque la jeringa que contiene la suspensión celular y repitiendo dispensador de antígeno al marco estereotáxico en la cabeza. Llevar la punta de la aguja 27 g en contacto con Bregma. Este es el origen que se usará para la manipulación de coordenadas tridimensionales.
    5. Levante la aguja ligeramente fuera de la superficie del cráneo y mover 2 mm laterales y 1 mm rostral de Bregma.
    6. Baje la aguja con cuidado a través del cráneo hasta su destino 4 mm ventral de Bregma. NOTA: Hemos utilizado estas coordenadas estereotáxica para apuntar los ganglios basales. Diferentes coordenadas estereotácticas se pueden utilizar para investigar el impacto de diferentes microambientalesregiones del cerebro en la tumorigénesis.
    7. Inyectar 5 l de la suspensión celular mediante la activación del dispensador de antígeno de repetición una vez. Deje la aguja en su lugar durante 2 min para permitir que la presión intracraneal se equilibre.
    8. Retire la aguja lentamente durante un período de 30 seg. Use un hisopo de algodón para aplicar presión a cualquier hemorragia que pueda ocurrir.
    9. Aproximado los bordes de la herida y cerrar la incisión utilizando adhesivo tisular. Administrar 20 l de lidocaína por vía subcutánea en el sitio de la incisión. NOTA: Para 5 ratones, los pasos 3.5.1-3.5.9 tomará ~ 50 min. La UNC IACUC aprobó el uso postoperatorio de sólo anestesia local. Se recomienda consultar con las autoridades locales IACUC institucional respecto a los requisitos para el uso de analgésicos postoperatorios después de este procedimiento.
  6. Cuidados después de la cirugía
    1. Coloca los animales en una jaula limpia, cálida para recuperarse. Los animales no deben ser colocados directamente en las camas, ya que puede provocar la aspiración accidental.
    2. Observe elanimales para la reanudación de un comportamiento normal, como el aseo, comer y defecar. NOTA: La reanudación de la conducta normal puede tomar ~ 60 min.

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Resultados

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Hemos desarrollado un sistema modelo nGEM con astrocitos corticales y NSC cosechadas de acogida GEM neonatal floxed alelos oncogénicos condicionales que se pueden caracterizar fenotípicamente in vitro e in vivo (Figura 1). Con el fin de investigar las consecuencias de mutaciones oncogénicas específicamente en astrocitos corticales in vitro, es crítico para enriquecer primero para astrocitos. Cosechas de astrocitos corticales contienen una mezcla de microglia, astrocitos, oligo...

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Discusión

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Los pasos más importantes para garantizar la cosecha y cultivo de astrocitos corticales son 1) adecuado para extirpar la corteza sin tomar tejido debajo del cuerpo calloso, 2) para eliminar las meninges, 3) para disociar completamente las células, y 4) para enriquecer para GFAP + astrocitos. Aunque hemos utilizado mecánica (agitación) y genéticas (restricción de la recombinación genética con un vector de Ad5GFAPCre o la utilización de un transgén transformadora dominante (TgGZT 121) bajo e...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRM es un Investigador Clínico de Damon Runyon-Genentech. Este trabajo fue apoyado, en parte, por subvenciones a CRM de la Fundación de Investigación del Cáncer Damon Runyon (CI-45-09), el Departamento de Defensa (W81XWH-09-2-0042) y el Fondo de Investigación del Cáncer de la Universidad de Carolina del Norte (UCRF). Los autores desean agradecer a Daniel Roth por su ayuda en la cría de ratones. Los autores también desean agradecer a Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette y Susannah Krom por su asistencia en el cultivo de tejidos y la inmunofluorescencia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM también se pueden comprar de otros proveedores, incluidos GIBCOSigma y Cellgro
Suero fetal bovino, regularCellgro35-010-CV
Penicilina-estreptomicinaInvitrogen15140122
Tijeras de disección de punta afiladaFisher Scientific08-395
Pinzas de cartílago para el pulgar, curvadasFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Style 1 Pinzas estilo joyero, finas, 4Miltex17-301
Etanol (200 grados)Decon Labs2710
Hojas de afeitar VWR55411-050
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (1x), líquidoInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), rojo de fenolInvitrogen12605-010Otras soluciones de tripsina también son adecuadas para el uso de astrocitos corticales y el cultivo
Plato de cultivo, 60 x 15 mmThomas Scientific9380H77
Tubos de 15 mlBD Biosciences352096
50 ml Tubos BDBiosciences352070
Stock de adenovirusTransferencia de genes Vector Core, U. IowaAd5CMVCreStore en 5 µ l alícuotas a -80 °C. Peligroso. Utilice las precauciones de seguridad de Bsl2
Sulfato de sodio (Na2SO4) Sigma-Aldrich238597
Sulfato de potasio (K2SO4)Sigma-Aldrich221325 Cloruro
de magnesio (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma-Aldrich746495
HEPES salde potasioSigma-AldrichH0527
D-(+)- GlucosaSigma-AldrichG8270 
Rojo de fenolSigma-AldrichP3532
Hidróxido de sodio (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapaínaWorthingtonLS003127
L-Cisteína-HClSigma-AldrichC1276
Filtro de jeringa (0,22 y micro; KitMilliporeSLGP033NS
Neurocult, ratónStemcell Technologies5702Este kit contiene el medio basal NeuroCult NSC y el suplemento NeuroCult NSC NSC necesarios para el cultivo de NSC
Solución de heparina al 0,2%Stemcell Technologies7980
EGF InvitrogenPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Sulfato de magnesio (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132Hacer 10 mM de stock en DMSO, almacenar a -20 ° C
Placas de 6 pocillosFisher Scientific07-200-83
Filtro de células (40 µ m tamaño de poro)Corning352340
Solución de disociación de células madreStemcell Technologies5707Alternativamente, use soluciones enzimáticas suaves como Accutase
Metilcelulosa 15 cPSigma-AldrichM7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2xMilliporeSLM-202-BPara hacer una solución de metilcelulosa al 5%
1.7 ml Snap Cap Tubo de microcentrífugaCorning3620
Jeringa Hamilton, 250 y micro; l LT sin agujaFisher Scientific14-815-92
PB600-1 Dispensador de antígenosHamilton  83700
Agujas desechables de 18 GFisher ScientificNC9015638
27 ga 1/2" aguja con punta LuerFisher Scientific14-826-48
2,2,2-Tribromoetanol (Avertin)Sigma-AldrichT48402
BetadineFisher ScientificNC9386574
Puralube Pomada OftalmológicaFisher Scientific
Modelo 900 Bastidor estereotáxicoKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 Adhesivo de tejido 
Lidocaína ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG3580
Anti-Sox2MilliporeAB5603
Proteína ácida fibrilar antiglial policlonal de conejo (GFAP)DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerPara in vivo imagen
D-Luciferina - Sustrato bioluminiscente de sal K+PerkinElmer122796Para in vivo imágenes de bioluminiscencia
Kit de imagen EdUInvitrogenC10340
MSCV Luciferasa PGK-hygroAddgene18782
de proliferación NC9689910

Referencias

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